مقالة منهجية

استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة: طريقة فعالة للكشف عن أنواع الخلايا السلفية وتحديدها أثناء تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين

DOI:

10.3791/50769

⸱

أغسطس 30, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurologic Surgery, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Anatomy, Korea University College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء تكوين الخلايا العصبية في الحصين البالغين ، يتم التعبير عن مجموعة مميزة من العلامات الجينية عندما تتقدم الخلية الجذعية العصبية الهادئة بالتتابع وتتطور إلى خلية عصبية متكاملة وظيفيا في الدائرة. باستخدام استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة ، يتم تحديد أنواع الخلايا السلفية التي يصعب اكتشافها بفعالية محسنة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطرق التقليدية للكيمياء المناعية (IHC) بعد تثبيت الأنسجة تسمح بتصور أنواع مختلفة من الخلايا. عادة ما تستمر هذه في تطبيق الأجسام المضادة لربط المستضدات وتحديد الخلايا ذات الخصائص التي هي وظيفة لعلم الأحياء المتأصل والتطور. تكوين الخلايا العصبية للحصين البالغ هو عملية متسلسلة حيث يمكن تنشيط الخلية الجذعية العصبية الهادئة والمضي قدما عبر مراحل التكاثر والتمايز والنضج والتكامل الوظيفي. تتميز كل مرحلة بمورفولوجيا مميزة وتنظيم الجينات. يعد تحديد هذه المراحل أمرا مهما لفهم الآليات التنظيمية المؤثرة وأي تغييرات في هذه العملية تكمن وراء الفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات المنهكة. يعمل نهج استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة على تحسين شدة الإشارة التي يتم اكتشافها ويسمح بالتحديد الصحيح لنوع الخلية السلفية. كما تمت مناقشته في هذه الورقة ، فإنه يسمح لنا بشكل خاص بالتحايل على المشكلات الحالية في اكتشاف أنواع معينة من الخلايا السلفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف الآن أن تكوين الخلايا العصبية ، وهو توليد خلايا عصبية جديدة من الخلايا الجذعية العصبية ، يحدث باستمرار في مرحلة البلوغ في منطقتين متخصصتين في الدماغ. وتشمل هذه المنطقة تحت البطينية (SVZ) للبصلة الشمية والمنطقة تحت الحبيبية (SGZ) للتلفيف المسنن في الحصين. على مدى العقد الماضي ، شهد مجال تكوين الخلايا العصبية في الحصين للبالغين عملا كبيرا. جذبت المنطقة الكثير من الاهتمام لأن الخلايا العصبية حديثي الولادة في SGZ تساهم في تعزيز اللدونة العصبية التي يمكن أن تحافظ على وظائف دماغيةمحددة 1-5. وقد تورط تكوين الخلايا العصبية الحصين في البالغين للعب أدوارا مهمة في تنظيم المزاج, التجديد, والتعلم والذاكرة. وبالتالي ، كان هناك جهد متضافر لفهم تطوير وتنظيم الخلايا العصبية في هذا المكان العصبي الغني.

أحد الجوانب التي لا مفر منها والمهمة لدراسة تكوين الخلايا العصبية للحصين البالغين هو تحديد المراحل المنفصلة التي تمر بها الخلية الجذعية العصبية المنشطة في طريقها لتصبح خلية عصبية تعمل بكامل طاقتها. في هذه العملية ، يتم تنشيط الخلية الجذعية العصبية الهادئة وتمضي قدما من خلال سلسلة من أنواع الخلايا السلفية النشطة المبكرة والنشطة المتأخرة (الشكل 1). يمكن التعرف على هذه المجموعات المتميزة من الأسلاف العصبية من خلال التشكل وتعبيرهم عن العلامات الجزيئية مثل MCM2 و nestin و Tbr2 و Doublecortin (DCX) و NeuN التي توجه تحويل RGLs إلى أنواع الخلايا السلفية الخاصة بها. Nestin هو بروتين خيوط وسيط يتم التعبير عنه عبر الخلايا الدبقية الشعاعية الشبيهة بالخلايا الدبقية وبعض أنواع الخلايا السلفية المبكرة. علامة أخرى هي Tbr2 التي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في تضخيم الخلايا السلفية. يتم إيقاف تشغيل التعبير الجيني المعدل Tbr2 في البداية في الخلايا من النوع 1 (مثل الخلايا الدبقية الشعاعية) ، ويتم تشغيله عبر أسلاف Type-2a و Type-2ab و Type-2b ويتم إيقاف تشغيله بين الخلايا العصبية من النوع 3 وغير الناضجة الأكثر تمايزا (الشكل 1). DCX هي علامة هجرة عصبية يتم التعبير عنها في الأسلاف العصبية من النوع 2ab والنوع 2b والنوع 3. باستخدام هذا المزيج من ثلاث علامات ، يمكننا تسمية أنواع فرعية مميزة من الأسلاف العصبية. وتشمل هذه النوع 1 (MCM2 + nestin + Tbr2-) ، النوع 2a (MCM2 + nestin + Tbr2 +) ، النوع 2ab (MCM2 الجزئي + nestin-Tbr2 + و MCM2 + Tbr2 + DCX-) ، النوع 2b (MCM2 + Tbr2 + DCX +) والنوع 3 (MCM2 + Tbr2-DCX +). يمكن تحديد خلايا ما بعد الانقسام مثل الخلايا العصبية غير الناضجة والمتكاملة وظيفيا من خلال استخدام DCX وعلامة الخلايا العصبية الناضجة ، NeuN.

تستخدم الطرق التقليدية ل IHC الأجسام المضادة لتحديد المستضدات لأنواع معينة من الخلايا بناء على تعبيرها الجيني. يمكن استخدام التصور اللاحق من خلال تقنيات التصوير عالية الدقة مثل الفحص المجهري متحد البؤر لتحديد هويتها. ومع ذلك ، توجد حاليا مشاكل في هذه الطرق لا تسمح بالتعرف الفعال على الخلايا الدبقية الشعاعية وأنواع الخلايا السلفية المبكرة. من الصعب تحديد هذه الأنواع المعينة من الخلايا لأن الجسم المضاد المطبق غير قادر على اختراق بروتين nestin وربطه بكفاءة. Nestin هو بروتين الخيوط الوسيطة الذي يشتمل على العمليات الشعاعية التي تنتجها الخلية الشبيهة بالخلايا الدبقية الشعاعية. يمكن أن يكون الارتباط غير الفعال للجسم المضاد بالمستضد نتيجة للعديد من العوامل بما في ذلك وقت التثبيت ودرجة الحرارة والتقنية المستخدمة6-7. للمساعدة في حل مثل هذه المشكلات ، قمنا بتطوير طريقة استرجاع المستضد أو "الغليان". إلى جانب nestin ، تعمل طريقة استرجاع المستضد هذه أيضا على تحسين التلوين لعلامات أخرى مثل Ki67 و BrdU والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) و Tbr2 و MCM2. تجمع طريقتنا بين الأساليب الكيميائية والفيزيائية. إنه ينطوي على التثبيت الكيميائي للأنسجة في بارافورمالدهيد والغليان اللاحق بدرجة حرارة عالية لأقسام الحصين الإكليلية الرقيقة في مخزن مؤقت للعلاج الممسخ والفوضى. هذا يعزز إمكانية وصول المستضد إلى الجسم المضاد ، ويحسن خصوصية الجسم المضاد ويسمح بتحسين تحديد أنواع الخلايا السلفية. نهجنا سهل الاستخدام ويتطلب في الغالب أدوات وكواشف متوفرة بالفعل في المختبر. لقد استخدمناه على نطاق واسع لدراسة تطور الخلايا الجذعية العصبية وتنظيمها عبر العوامل البيئية الوراثية أو الخارجيةالجوهرية 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. ما قبل الكيمياء المناعية: التروية والأنسجة

  1. الفئران المزخرفة وفقا لبروتوكول ترانسكاردي عام تم تكييفه للفئران واستخراج الأدمغة إلى 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) 9.
  2. اترك الدماغ في PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية (على سبيل المثال ، أنبوب مخروطي 10 مل مملوء ب PFA). يحفظ في PFA لمدة 12-24 ساعة على الأقل ، ولا تزيد عن 36 ساعة للتثبيت الكامل. بعد التثبيت بين عشية وضحاها ، أفرغ PFA من الأنبوب المخروطي ولكن اترك الأدمغة بالداخل. صب 30٪ من السكروز في الأنبوب واغسل الدماغ لمدة 5 ثوان لإزالة أي بقايا من PFA. أخيرا ، املأ الأنبوب الذي يحتوي على الأدمغة بنسبة 30٪ من السكروز مرة أخرى. احتفظ بالأدمغة في السكروز عند 4 درجات مئوية حتى تغرق الأدمغة في قاع الأنبوب.
  3. قطع 40 ميكرومتر من أقسام الدماغ على ميكروتوم. استشر أطلس دماغ الفأر لبدء جمع الأقسام من بداية التلفيف المسنن حتى نهايته. احفظ الأقسام في محلول مضاد للتجمد (وصفة بسيطة هي 300 جرام سكروز في 500 مل و 0.1 م PBS و 300 مل من الإيثيلين جلايكول) حتى تصبح جاهزة للكيمياء المناعية.
  4. قم بتركيب الأنسجة المقطوعة على شرائح المجهر المصممة خصيصا للالتصاق بقوة بالأنسجة. توفر هذه الشرائح ثباتا قويا للأنسجة أثناء مرحلة الغليان. بعد تركيب المنديل ، يرجى ترك الشريحة تجف لمدة 10 دقائق أو حتى تجف تماما. يمكن تسريع التجفيف إذا كانت الشريحة مستقرة على سطح عمودي مع وضع الحافة السفلية للشريحة على منشفة ورقية. إذا تم تركيب أكثر من شريحة واحدة ، فقد تترك الشريحة (الشريحة) الأخرى جافة خلال ذلك الوقت (1-2 ساعة على ما يرام) حتى تصبح جاهزة للمتابعة إلى الخطوة التالية.
  5. بمجرد أن تجف الشريحة ، اغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها وجففها مرة أخرى (المخزن المؤقت PBS = 0.137 M NaCl ، 0.0027 M KCl ، 0.0119 M Na2PO4). هذا يضمن إزالة أي مادة كيميائية سابقة (مثل الجلسرين من محلول التخزين المضاد للتجمد) بشكل كاف ولا يمكن أن تضعف التصاق الأنسجة بالشريحة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الكواشف والمعدات الثانوية

  1. تحضير المحلول أ (0.1 م أو 19.21 جم / لتر حامض الستريك) والمحلول B (0.1 م أو 24.9 جم / لتر سترات ثلاثية الصوديوم) حيث سيتم غلي أقسام الأنسجة.
  2. في أسطوانة متدرجة ، اخلطي 9 مل من المحلول A و 41 مل من المحلول B. أضف 450 مل من ddH2O إلى هذا الخليط.
  3. صب هذا الخليط في وعاء فارغ (مثل صندوق أطراف ماصة فارغ) آمن للاستخدام في الميكروويف.
< p class = "jove_title" >3. استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة

  1. قم بغلي المحلول في الخطوة 2 لمدة 5 دقائق في الإعداد القياسي في ميكروويف قياسي. سيبدأ المحلول في الغليان عند 100 درجة مئوية أو أعلى.
  2. بمجرد اكتمال الغليان ، قم بإزالة الحاوية بعناية من الميكروويف وضع الشرائح المجففة فيه ، مع التأكد من أن الوجه المنزلق مع أقسام الحصين متجها لأسفل ومعرض تماما للسائل. إذا أمكن ، ضع الشرائح بزاوية على جدران الصندوق وقم بتكديس الشرائح الأخرى حولها. تأكد من أن "ملاءمتها" داخل الصندوق ضيقة حتى لا يكون للشرائح مجال للتحرك فوق بعضها البعض.
  3. اغلي هذا الخليط مع الشرائح لمدة 7 دقائق في الإعدادات القياسية في الميكروويف. سوف يغلي المحلول خلال هذا الوقت عند أو أعلى من 100 درجة مئوية.
  4. خلال مرحلة الغليان هذه ، املأ دلاءين من الثلج في منتصف الطريق بالثلج.
  5. بمجرد اكتمال الغليان في الخطوة 3.3 ، أخرج الحاوية من الميكروويف وضعها داخل أحد دلاء الثلج. صب باقي الثلج من الدلو الآخر في جميع أنحاء الحاوية وقم بتغطيته بالكامل. دعها تجلس لمدة 1 ساعة.
< p class = "jove_title" >4. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية

  1. في نهاية فترة الانتظار البالغة 1 ساعة ، قم بإزالة الشرائح من الحاوية واغسلها باستخدام TBS-T Buffer 3x لمدة 5 دقائق لكل منها. يمكن استخدام أي جهاز لأداء هذه الغسيل الأساسي. (المخزن المؤقت TBS = 50 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، TBS-T = 0.05٪ مخزن مؤقت Triton X-100 TBS ، TBS-TT = 4٪ مصل حمار TBS-T عازلة).
  2. بعد الغسيل ، اترك الشرائح تجف في مكان مظلم (على سبيل المثال داخل درج مقاعد البدلاء ، ضع منشفة ورقية داخل الدرج وقم بإمالة الشريحة عليها) لمدة 5-10 دقائق أو حتى تجف الشريحة تماما. خلال هذه الفترة ، قم بإعداد غرفة لتلوين الأجسام المضادة الأولية طوال الليل. قد تشتمل غرفة التلوين البسيطة على حاوية ذات مساحة سطح كبيرة مملوءة ب ddH2O ومرحلة داخل الحاوية ، يمكن وضع الشريحة فوقها فوق ddH2O.
  3. بمجرد أن تجف الشريحة ، ارسم مخططا حول أقسام الأنسجة باستخدام قلم طارد للماء. خلال الخطوة 4.5 ، يعمل هذا المخطط كحاجز يمنع خليط الجسم المضاد من التدفق.
  4. تحضير خليط الأجسام المضادة الأولية في TBS-TT. مطلوب ما لا يقل عن 500 ميكرولتر لتغطية شريحة واحدة كاملة على سبيل المثال ، إذا كان مخزون الأجسام المضادة بتركيز 1: 500 ، أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المعين إلى 500 ميكرولتر من TBS-TT). استخدم الأجسام المضادة الأولية كما هو مذكور في جدول الكواشف.
  5. ضع الشريحة المجففة أعلى المسرح في غرفة التلوين. أضف 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ببطء وقم بتغطية السطح بالكامل. قم بتغطية الجهاز بالكامل ولفه بورق الألمنيوم لحجب الضوء الخارجي. اتركه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  6. في اليوم التالي ، اغسل الشريحة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام مخزن TBS-T. اتركه يجف في منطقة مظلمة كما هو موضح في الخطوة 4.2.
  7. تحضير خليط الأجسام المضادة الثانوية المشابهة للخطوة 4.4. راجع جدول الكواشف للأجسام المضادة الثانوية.
  8. ضع الشريحة المجففة في غرفة التلوين كما هو موضح في الخطوتين 4.2 و 4.5. أضف 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية ببطء وقم بتغطية السطح بالكامل. لف حجرة التلوين بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء الخارجي. اتركه مغطى ومحمي من الضوء الخارجي لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  9. بعد الانتهاء من التلوين الثانوي ، اغسل الشريحة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها باستخدام مخزن TBS-T. دع الشريحة تجف في منطقة مظلمة. بعد التجفيف ، ضع محلول التثبيت وقم بتغطية الشريحة بزلة غطاء تمنع بعناية أي إدخال للفقاعات. دع الشريحة تجلس في منطقة مظلمة لمدة ساعتين على الأقل قبل التحليل اللاحق.
  10. إجراء تحليل بفاصل زمني أو متحد البؤر على الأنسجة الملطخة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد عملية تكوين الخلايا العصبية في الحصين لدى البالغين عملية تتابعية، حيث يمكن تحديد نوع الخلايا السلفية الممثل في كل مرحلة باستخدام مجموعة من العلامات. ويؤدي التثبيت الكيميائي الدقيق واستعادة المستضدات إلى تحسين فاعلية وإمكانية الوصول إلى العلامات التي يصعب اكتشافها بطرق أخرى. وأحد هذه العلامات هو nestin الذي يتم التعبير عنه في الخلايا الجذعية العصبية الشبيهة بالدبقية الشعاعية وبعض أنواع الخلايا السلفية النشطة المبكرة. يمكن أن يكون Nestin بروتيناً رئيسياً في تحديد أنواع الخلايا السلفية المبكرة، حيث يُفقد التعبير عنه عند...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية لاسترجاع المستضد الناجح وتلطيخ أنواع الخلايا السلفية هي: 1) استخدام الأنسجة الثابتة والمثبتة جيدا بسماكة الإكليل المثلى. 2) السماح بوقت كاف للغليان والتبريد اللاحق أثناء استرجاع المستضد ؛ 3) البراعة اليدوية في تركيب الأقسام الإكليلية الثابتة ومنع تلفها عند القيام بذلك.

من الأهمية بمكان في IHC استخدام الأنسجة المنحوبة التي خضعت لتثبيت كاف ولكن ليس التثبيت المفرط. يمكن أن تكون الصعوبة الأساسية هي عدم وصول المستضد إلى الجسم المضاد. تم تصميم طريقتنا لتحسين إمكانية الوصول. يعد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير المنهجية في الأصل في مختبر الدكتور هونغ جون سونغ في معهد هندسة الخلايا ، قسم طب الأعصاب ، كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز. تم تمويل هذا العمل من قبل NIMH (R00MH090115) و NARSAD وصندوق أبحاث Mayo لأبحاث السرطان التابع للمنظمة الأخوية للنسور وحزمة بدء التشغيل من مؤسسة Mayo الممنوحة إلى M.H.J. وبرنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا (A3014385) الممنوحة إلى W.R.K.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
يوفر SuperFrost Plus SlideFisherbrand12-550-15التصاق قوي بأنسجة الحصين أثناء الغليان
PVA / DABCO Mounting MediaSigma Aldrich10981-100 مل
Nestin (دجاج) Aves LabNESعلامة الخلايا الجذعية العصبية
GFAP (أرنب)Dako North AmericaZ033401-2Astrocyte وعلامة الخلايا الجذعية العصبية
MCM2 (فأر)مختبر BD Transduction610701علامة الانتشار
DCX (الماعز)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC8066علامة الخلايا العصبية غير الناضجة
Tbr2 (أرنب)AbcamAb23345تضخيم علامة
NeuN (فأر)MilliporeMAB377علامة الخلايا العصبية الناضجة
Cy2 (مضاد للأرانب)Jackson Immunoresearch111-226-047
Cy2 (مضاد للدجاج)Jackson Immunoresearch303-165-006
Cy5 (مضاد للفأر)Jackson Immunoresearch315-175-047
Cy5 (مضاد للماعز)Jackson Immunoresearch305-165-047
DAPILife Technologies CorporationD1306
Dako PenS2002Dakoقلم طارد للماء
السلف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system. Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).
  2. Santarelli, L., Saxe, M., et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 301 (5634), 805-809 (2003).
  3. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).
  4. Clelland, C. D., Choi, M., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325 (5937), 210-213 (2009).
  5. Wang, J. W., David, D. J., et al. Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells. Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).
  6. D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry. Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).
  7. Daneshtalab, N., et al. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).
  8. Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis. Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).
  10. Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system. FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).
  11. Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval. Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة