يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون

70.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50783

⸱

فبراير 12, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Neuroscience, University of California at San Diego, 4National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

للحفاظ على العمليات العصبية لتحليل التركيبية، ونحن تصف بروتوكول للتصفيح من الخلايا العصبية في المقام الأول على شبكات المجهر الإلكتروني تليها فلاش تجميد، مما أسفر عن عينات معلقة في طبقة من الجليد الزجاجي. يمكن فحص هذه العينات باستخدام المجهر البرد الإلكترون لتصور هياكل على مقياس متناهي الصغر.

الملخص

neurites التي، على حد سواء التشعبات والمحاوير، هي العمليات الخلوية العصبية التي تمكن من توصيل النبضات الكهربائية بين الخلايا العصبية. تحديد هيكل neurites التي أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية نقل هذه المواد والعمليات التي تدعم إشارات الاتصالات متشابك. المجهر الإلكتروني (EM) وقد استخدمت تقليديا لتقييم ميزات التركيبية داخل neurites التي، إلا أن التعرض للمذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين يمكن أن تشوه الهياكل. هدف غير الملباة المهم هو صياغة الإجراءات التي تسمح للتقييمات الهيكلية لا تتأثر هذه القطع الأثرية. هنا، وضعنا بروتوكولا مفصلة وقابلة للتكرار لزراعة وتجميد فلاش neurites التي كاملة من الخلايا العصبية الأولية المختلفة على شبكات المجهر الإلكتروني تليها الفحص مع التصوير المقطعي البرد الإلكترون (البرد ET). هذا الأسلوب يسمح لل3-D التصور، neurites التي رطب مجمدة في القرار نانومتر، وتسهيل ASSEssment خلافاتها الشكلية. بروتوكول لدينا تعطي نظرة غير مسبوقة من الظهرية جذر عقدة (DRG) neurites التي، وتصور neurites التي الحصين في حالتها شبه الأم. على هذا النحو، وهذه الأساليب إنشاء مؤسسة للدراسات المستقبلية على neurites التي كل من الخلايا العصبية الطبيعية وتلك التي تأثرت الاضطرابات العصبية.

المقدمة

الخلايا العصبية إنشاء مجمع الدوائر الأساسية لوظيفة الجهاز العصبي المركزي والمحيطي من خلال وضع التشعبات لتلقي المعلومات والمحاور، وغالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وعلى التواصل مع الخلايا العصبية المصب. ثمرة neurite يلعب دورا أساسيا أثناء التطور الجنيني وتمايز الخلايا العصبية وصيانة neurites التي تدعم بشكل حاسم وظيفة الجهاز العصبي. عمليات التهاب الأعصاب أيضا ميزة بالغة في إصابة الخلايا العصبية والتجديد، فضلا عن اضطرابات الجهاز العصبي. دراسة الهندسة المعمارية العصبية أمر حاسم لفهم كل من المخ المعتادة والمريضة. لحسن الحظ، توجد نظم زراعة الخلايا العصبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي يمكن أن ألخص الهياكل الخلوية المعقدة وغير المتجانسة. استنادا إلى توضيح من المنصات التجريبية الصلبة والاستراتيجيات الفعالة التي تمكن التصور التحليلات الكمية والنوعية من مورفولوجيا الخلايا العصبية وهناك حاجة. سيكون مفيدا بشكل خاصتكون منهجية التفصيلية التي توفر منصة متسقة لتصور neurites التي، على حد سواء محاور عصبية والتشعبات على مقياس متناهي الصغر.

يتطلب المجهر الإلكتروني التقليدية استخدام المذيبات العضوية خلال الجفاف والراتنج التضمين، والتي يمكن أن تحدث تشوهات في عينات من الدولة الحقيقية. حتى الآن، وتستند معظم الأوصاف الهيكلية في مقياس متناهي الصغر على خلايا أكبر أو الأنسجة التي تتعرض لمثل هذه المواد الكيميائية القاسية - مما يحد من تفسير النتائج 4،9،25. علاوة على ذلك، لاختراق شعاع الالكترون، مطلوب باجتزاء للكائنات أو نتوءات الخلوية واظهار سمك أكبر من 1 ميكرون 12. أخيرا، مقطوع أو المضروب نتائج الأنسجة في مجموعة من مجموعات البيانات شريحة محددة منفصلة، ​​مما يجعل مرهقة تعريف ميزة ممدود من neurites التي. حتى لالبرد EM، التي باجتزاء عينة مجمدة رطب هو ممكن، وطريقة يدخل ضغط artifيتصرف 1.

في السنوات الأخيرة، عرف الباحثون كيفية زراعة الخلايا العصبية قرن آمون مباشرة على شبكات EM ولهم في الايثان السائل بعد ذلك لتصور neurites التي تستخدم البرد ET 8،10،18،23 تجميد فلاش. ومع ذلك، مثل هذه الدراسات إما استخدام جهاز حسب الطلب 10،23، أو عدم التفاصيل حول الخطوة النشاف لتوليد ما يكفي من الجليد رقيقة زجاجي لرؤية الروتينية 8،18. على سبيل المثال، توصي دراسة واحدة استخدام 30-40 ثانية لالنشاف الشبكة EM 10، ومع ذلك، تم تحسين هذه القيمة ليست للاستخدام العام ولكن هي محددة لهذا الجهاز تجميد يغرق حسب الطلب. يمكن استخدام الجهاز حسب الطلب بدلا من المتاحة تجاريا واحدة للحفاظ على الرطوبة 17 قبل العينة لتجميد يغرق-تشكل عقبة للاستنساخ على نطاق واسع.

في حين أن هذه الدراسات قد تم الرائدة في تصور neurites التي كتبها البرد ET، اتخذنا خطوة أخرى لاستكشاف ا ف بplicability من البرد ET إلى مجموعة متنوعة من العينات العصبية (قرن آمون والظهرية العقدة الجذر الخلايا العصبية). بالإضافة إلى ذلك، ونحن نناقش كل الأمثل والأمثل النتائج، فضلا عن القطع الأثرية المحتملة التي يمكن للمرء أن تواجه باستخدام البرد ET لمثل هذه العينات.

أن تعريف تقنية مفصلة للحفاظ على وتصور neurites التي كله على مقياس متناهي الصغر في حالة شبه الأصلي تعزيز قدرة لمزيد من الباحثين لإجراء دراسات التركيبية. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن تصف بروتوكول فعالة ومفصلة باستخدام المعدات المتاحة تجاريا لإعداد غير المثبتة، الخلايا العصبية غير ملوثين لتصور neurites التي. هذا هو خطوة أولى مهمة نحو تفاصيل التركيب الدقيق للneurites التي صحية ووضع الأساس لفهم ما هي موجودة في نماذج المرض الجهاز العصبي الاختلافات الهيكلية. منذ البرد ET يمكن حل غير المثبتة، وميزات محوار غير ملوثين في 3-D على مقياس متناهي الصغر، فإن الطريقة تجعل من الممكن أبدا أن يكون كماالصدارة لتعريف العمارة التهاب الأعصاب 12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أطباق مع EM شبكات لطلاء الخلايا العصبية الابتدائية

  1. فحص سلامة من الكربون المخرمة على شبكات EM الذهب باستخدام مجهر الضوء في التكبير من 25X على الأقل. جعل متأكد من الثقوب الكربون هي> 98٪ سليمة.
  2. لتصفيح الخلايا العصبية الأولية، واستخدام الموقد بنسن للهب تعقيم شبكات EM وبالتزامن جعلها ماء. استخدام ملاقط لالتقاط الشبكة EM كتبها حافته، وليس منطقة الشبكية المركزية. تنبيه: لا تترك الموقد بنسن مضاءة دون مراقبة، وعدم استخدام قفازات أو ملاقط مع المكونات البلاستيكية أثناء تنفيذ هذه الخطوات:
    1. قبل إضاءة الموقد بنسن، تعيين تعديلات الهواء والغاز إلى موقف فتح الحد الأدنى.
    2. تضيء الموقد بنسن باستخدام الصوان المهاجم أو البوتان أخف وزنا.
    3. تعديل التعديلات الهواء والغاز لتحقيق ذلك، اللهب الأزرق الداخلية الصغيرة داخل طولا وأخف وزنا الأزرق / البنفسجي اللهب. غيض من اللهب الداخلي هو أهم جزء من اللهب. مقبض تحتنيث الموقد يضبط كمية من الغاز يدخل أنبوب الموقد، في حين أن سعر برميل الموقد يمكن أن تتحول إلى ضبط كمية الهواء التي تدخل الموقد. تحول في اتجاه عقارب الساعة التكيف الهواء يقلل من الهواء (مما أدى إلى اللهب الأرجواني) وعكس يزيد من الهواء (مما أدى إلى لهب أصفر).
    4. استخدام ملاقط معدنية (أي قطع من البلاستيك) لعقد الشبكة EM، تمريرها بسرعة من خلال الشعلة مرتين، التي تواجه الجانب الكربون تصل. سوف تظهر الجانب الكربون أكثر ماتي (أقل لامعة) ومع أكثر من لون رمادي من الجانب الآخر.
    5. ونقل على الفور الشبكة (الجانب الكربون متابعة) في وسط طبق من الزجاج السفلي وضعت داخل 10 سم من ناسخ بنسن. استخدام واحد لكل طبق الشبكة EM (الشكل 1). فقط استخدام الأطباق الزجاجية القاع التي presterilized، أي عن طريق أشعة جاما.
  3. استخدام المجهر الضوئي للتحقق من سلامة الشبكة (الثقوب الكربون سليمة)، في حين لا تزال تحتفظ الشبكة EM داخل الزجاج بوتطبق ام (لتجنب التلوث). عند تطبيق أي مادة على الشبكة أو أي شيء من شأنها أن تأتي في اتصال مع الخلايا العصبية، استخدم الإجراء معقمة ونصائح ماصة معقمة.
  4. في غطاء الثقافة الأنسجة باستخدام الإجراء العقيمة، وتطبيق 250 ميكرولتر من مادة الطلاء المناسب ببطء وبعناية إلى المنطقة المركزية من الزجاج طبق بيتري. تأكد يغطي مادة الطلاء المناسب الشبكة EM بأكمله.
    1. لالخلايا العصبية قرن آمون، استخدم بولي-L-يسين (PLL، 1 ملغ / مل) كمادة طلاء، أعد كما هو موضح سابقا 19. نلاحظ أن هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، لذلك مقياس دفعة وفقا لذلك. لالعقدة الجذرية الظهرية (DRG) الخلايا العصبية، واستخدام خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما (انظر الجدول المواد والكواشف) كمادة طلاء، وإعداد النحو التالي. نلاحظ أن هناك حاجة إلى 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، لذلك مقياس دفعة وفقا لذلك.
      1. ذوبان الجليد زجاجة الأسهممن خليط من البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      2. حفاظ على برودة الخليط البروتين هلامي يفرز من Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما، وجميع مكونات تستخدم في صنع الحل، أي من خلال ابقائها على الجليد.
      3. بينما على الجليد، وتمييع هذا الخليط البروتين هلامي في المتوسطة Neurobasal أن تسفر عن تخفيف 01:20 (أي تمييع 500 ميكرولتر من خليط من البروتين هلامي في 10 مل من Neurobasal).
      4. الفجوة المخفف هلامي خليط من البروتين في 1 مل مأخوذة، وتخزين على الفور أي مأخوذة إضافية في -20 درجة مئوية.
      5. تطبيق 250 ميكرولتر في الشبكة EM، لكل طبق، كما هو موضح في القسم 1.4.
  5. تغطية طبق بتري مع كبار واحتضان (إما مع PLL لعينات قرن آمون، أو مع خليط من البروتين هلامي لعينات DRG) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في نسيج الثقافة هود.
  6. ASPIتقييم جميع PLL (لعينات الحصين) أو خليط من البروتين هلامي (لعينات DRG) من الأطباق. للقيام بذلك، استخدم نظام الفراغ في نسيج الثقافة هود. استخدام غيض ماصة معقمة تعلق على أنبوب فراغ. تجنب الاتصال المباشر مع شبكة EM.
  7. استخدام ماصة الهواء التشريد قابل للتعديل لتطبيق بعناية 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة (الفوسفات مخزنة المالحة) إلى شبكة EM في مجال الزجاج وسط كل طبق بيتري، مثل أن الشبكة EM مغطى بالكامل من قبل برنامج تلفزيوني. ثم، نضح في برنامج تلفزيوني من كل طبق. تكرار 3X.
  8. السماح للأطباق مع شبكات EM لتجف تحت غطاء الثقافة الأنسجة لمدة 15 دقيقة. تأكد من أنها جافة تماما عن طريق فحص تحت المجهر الضوء في غرفة زراعة الأنسجة. تأكد من عدم وجود فقاعات من الرطوبة في الشبكة. إذا كان الأمر كذلك، نضح بعناية بجانب الشبكة EM للقضاء على هذه الرطوبة الزائدة. وينبغي أن تستخدم الشبكة المغلفة على الفور لتصفيح الخلايا العصبية.

2. إعداد وررating الخلايا العصبية الابتدائية على شبكات EM

  1. لوحة الخلايا العصبية الأولية، تشريح الأولى، يعرض للتريبسين (باستخدام التربسين 2.5٪) ويسحن أن يفرق بين الحصين (أو الظهرية العقدة الجذرية لأجنة الفئران 18 يوما من العمر) في الخلايا الفردية، كما هو موضح سابقا 19.
    1. يسحن هو مصطلح شائع يستخدمه بيولوجيا عصبية لوصف كتل الانفصال من الخلايا في الخلايا الفردية، ولا سيما عن طريق استخدام ماصة الزجاج مع طرف مصقول النار. يتم تحقيق النتيجة التي كتبها بعناية وببطء الرسم والافراج عن الخلايا، صعودا وهبوطا، عدة مرات (~ 30) من خلال ماصة.
  2. اتبع الإجراءات المذكورة كما سبق للتشريح DRG والعزلة خلية 24، مع ملاحظة أن استخدام 0.25٪ التربسين (في HBSS) لعزل الخلايا العصبية DRG الفئران، بدلا من استخدام الإنزيمات اقترح (غراء، كولاجيناز / dispase) التي هي أكثر ملاءمة للماوس الخلايا العصبية DRG.
  3. حساب عدد الخلايا العصبية معزولة (أي باستخدام عدادة الكريات)واستخدام هذه القيمة لحساب حجم مناسب من الخلايا لتنطبق على كل طبق لتحقيق تركيز من 50،000 خلية / مل لكل طبق. وأقصى حجم لتقديم الطلبات هو 250 ميكرولتر. لاحظ أن هذا يملأ فقط منطقة وسط الزجاج، وليس الطبق بأكمله.
  4. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية. تسمح للخلايا للتعافي والالتزام.
  5. ببطء إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام تحسنت إلى كل طبق، مع الحرص على عدم تعكير صفو الشبكة EM. نوع من وسائل الإعلام يعتمد على نوع من الخلايا (قرن آمون أو DRG).
    1. إعداد وسائل الإعلام المناسبة لأي الخلايا العصبية الحصين 19 أو الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر 24، وهو أن تكون درجة حرارة في حمام مائي 37 ° C قبل استخدامها. احتضان الأطباق بين عشية وضحاها في حاضنة CO 2.
    2. لالخلايا العصبية قرن آمون، وتغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي. تغيير نصف وسائل الإعلام كل يومين فصاعدا لمدة 14 يوما. الحارة وسائل الإعلام في 37 ° C حمام الماء قبل استخدامها.
    3. لDRG الخلايا العصبية، في اليوم التالي تشريح / الطلاء، وإعداد مخزون جديدة من وسائل الإعلام مع وكيل المضادة للالإنقسامية (يوريدين و5'-الفلورية 2'-deoxyuridine) جعل محلول المخزون 10 ملي لكل منها، على حدة؛ استخدام النهائي تركيز من 10 ميكرومتر لكل منهما. إزالة نصف وسائل الإعلام DRG (875 ميكرولتر) وإضافة 875 ميكرولتر من وسائل الإعلام الجديدة مع وكيل المضادة للالإنقسامية.
      1. لDRG الخلايا العصبية، كل يومين في الأسبوع الأول، البديل تغيير وسائل الاعلام بين وسائل الإعلام المضادة للالإنقسامية وسائل الإعلام DRG القياسية. للأسبوع الثاني، تغيير سائل الإعلام DRG معيار كل يومين.

3. التزجيج الخلايا العصبية على شبكات EM

  1. إعداد المعدات وجميع المواد لتجميد وتخزين شبكات EM الذهب في درجة حرارة المبردة: جهاز التزجيج مع غرفة الرطوبة 17، ملاقط المتخصصة غرامة نقطة للآلة التزجيج، ملاقط نقطة مسطحة طويلة، ديوار (ق) من النيتروجين السائل (LN 2)، جحاوية oolant، EM الشبكة مربع التخزين، ورقة الترشيح خالية من الكالسيوم.
  2. بدء تشغيل الجهاز التزجيج. تعيين الرطوبة إلى 100٪ ودرجة الحرارة إلى 32 درجة مئوية. في المقطع "وحدة التحكم"، ضبط الوقت وصمة عار لصفر ثانية. وهذا يسمح للدليل النشاف من خلال الجانب نافذة غرفة الرطوبة آلة التزجيج لل.
  3. التعامل مع ورقة الترشيح خالية من الكالسيوم مع القفازات، وطبقات منهم بحيث ثلاث ورقات مكدسة. قطع مكدس في 0.5 سم شرائح واسعة التي هي ~ 2 سم طويلة. ينحني لهم في زاوية 90 درجة بحيث جانب واحد من الورق لديها 0.5 سم × 0.5 سم الوجه (الشكل 2). باستخدام الملقط، وإزالة ورقة المتوسطة ووضعه على ورق الترشيح خالية من الكالسيوم أخرى حتى الاستخدام.
  4. وضع زر تخزين الشبكة في حامل زر داخل غرفة التزجيج. ملء الغرفة الداخلية للحاوية سائل التبريد بالنتروجين السائل وانتظر حتى التبخر كاملة. ملء الغرفة الخارجي من اله المبرد الحاويات مع النيتروجين السائل حتى يبلغ درجة حرارة ثابتة للمضي قدما إلى الخطوة التالية. ملء الغرفة الداخلية مع عالية النقاء الإيثان الغازية التي سوف تتكثف إلى حالة سائلة داخل غرفة تبريد.
  5. تحريك الطبق (عناوين) من الحاضنة إلى 100 مم طبق كبير البوليسترين لنقلها إلى غرفة التزجيج، إن لم يكن في المنطقة المجاورة مباشرة. استخدام ملاقط التزجيج المتخصصة لاختيار بعناية الشبكة EM من الطبق. ملاحظة أي جانب الخلايا العصبية تنمو على الشبكة EM؛ فإن موقف يهم لاتخاذ الخطوة التالية. استخدام قفل الانزلاق سوداء على ملاقط لقفل آمن ملاقط على الشبكة EM.
  6. إدراج ملاقط في الجهاز التزجيج مثل هذا الجانب من الشبكة EM التي يتم الالتزام الخلايا العصبية وجوه إلى اليسار، بعيدا عن حفرة جانبية افتتاح آلة التزجيج. التراجع عن ملاقط المتخصصة في آلة التزجيج.
  7. وضع الحاوية في المبرد صاحب المناسبةآلة التزجيج. يجب ملأها LN كافية (2) والإيثان السائل. باستخدام الأمر الشاشة المناسبة للآلة التزجيج، ورفع غرفة التبريد التصاعدي حتى يتم مسح مع الجزء السفلي من غرفة الرطوبة.
  8. مع ملاقط نقطة مسطحة، فهم حافة واحدة من ورقة الترشيح على ان يكون الجانب أقصر (0.5 سم × 0.5 سم الوجه) هو عمودي على ملاقط. وهذا الوجه تتلامس مباشرة مع الشبكة EM لالنشاف (الشكل 2B). إدراج بعناية ورقة الترشيح الى جانب حفرة من غرفة الرطوبة آلة التزجيج في (الشكل 2A). عقد ثابت ورقة ضد الشبكة EM (التي تواجه الجانب بعيدا عن العينة) لمدة 10 ثانية. تجاهل الورقة بعد ذلك وعلى الفور يغرق-تجميد العينة في الإيثان السائل باستخدام الأتمتة آلة التزجيج لل.
  9. نقل بعناية لديك شبكة EM-المجمدة رطب إلى واحدة من فتحات في واحدة منأزرار تخزين الشبكة. كرر العملية لشبكات إضافية EM في الأطباق. يمكن للأزرار التخزين الشبكة EM المستخدمة في هذه التجارب تخزين متعددة شبكات EM-المجمدة رطب.

4. جمع الصورة، تجهيز، والشرح

  1. الشروع في جمع 2-D الميكروسكوب الالكتروني و / أو 3-D الميل سلسلة 5 من neurites التي باستخدام المجهر البرد الإلكترون تحت شرط جرعة منخفضة. كان القصد من الصور 2-D لتقييم جودة الشبكة من حيث سماكة الجليد والمجالات التي يمكن أن تكون مفيدة لمدة 3-D سلسلة الميل.
    1. في هذه الحالة، تم جمع كافة الصور باستخدام كاميرا CCD 4K X 4K تعلق على المجهر 200 كيلو فولت الإلكترون مجهزة حامل الميل السائل النيتروجين بالتبريد نقل واحدة، في 20K المجهر التكبير على هدف underfocus من 7 ميكرون وأخذ العينات من 4.4 Å / بكسل.
    2. للحصول على صورة مقطعية 3D من العينة، واتخاذ سلسلة من الصور الإسقاط في حين يميل تدريجيا العينة آلأونج محور واحد من المجهر الإلكتروني النافذ (TEM). نظرا لزوايا الميل وإعدادات تجريبية أخرى، هناك العديد من البرمجيات المختلفة المتاحة لجمع تلقائيا سلسلة الميل 5. تم جمع سلسلة الميل 3-D المعروضة هنا على نفس المجهر باستخدام شبه الآلي برنامج الحصول على سلسلة الميل 26 على مجموعة من -60 ° إلى 60 ° في 5 ° الزيادات مع جرعة تراكمية من ~ 60 ه / 2.
  2. إعادة بناء سلسلة من الميل neurites التي تستخدم برامج معالجة الصور 21 كما هو موضح سابقا لعينات أخرى 5،29.
  3. لون الحواشي الميزات 3-D من neurites التي كتبها بتجزئة أولا مقطعية وخلق نموذج السطح باستخدام 3-D برامج معالجة الصور كما هو موضح سابقا 5.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل تجميد والتصوير عبر البرد ET، ينبغي أن تؤخذ صور المجهر الضوئي من الشبكة EM على الخلايا العصبية التي تنمو. وينبغي أن تكون واضحة للعيان neurites التي دون تداخل كبير مع بعضها البعض. مربع الملونة في الشكل 3A يمثل المنطقة التي يتم التكبير في لإظهار التكبير العالي في الشكل 3B، الذي neurites التي تمتد عبر التشبيك من الشبكة. وتتكون كل شبكة مربع من فيلم الكربون المخرمة التي تدعم الخلايا العصبية وneurites التي بهم. هذه الثقوب واضحة في جرعة منخفضة من البر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتبين لنا أن الفئران الخلايا العصبية الجنينية (العقدة الجذرية الظهرية وقرن آمون) يمكن زراعتها على الذهب المجهر الإلكتروني (EM) شبكات ومجمدة في الجليد الزجاجي رقيقة بما يكفي لneurites التي ليمكن تصوير باستخدام 2-D البرد EM و 3-D البرد ET. في حين سبق تصويرها neurites التي الحصين باستخدام البرد ET 8،10،18،23، مفصل بروتوكول كافية للنسخ المتماثل ناجحة باستخدام الأجهزة المتوفرة تجاريا كان مفتقدا. وعلاوة على ذلك، في حين أبحاثهم رائدة في استخدام البرد ET لتصور neurites التي الح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح (PN2EY016525 وP41GM103832). وأيد SHS من قبل الزمالة من برنامج تدريب الخريجين Nanobiology التخصصات من مركز WM كيك لتدريب التخصصات العلوم البيولوجية من اتحادات ساحل الخليج (NIH منحة رقم T32EB009379).

SHS تشريح، نما والمزجج DRG وخلايا قرن آمون؛ جمعها البرد EM والبيانات البرد ET من DRG ومحاور الحصين؛ بناؤها والمشروح لون سلسلة الميل. التجمع تشريح وقدمت خلايا قرن آمون في مختبر MNR ل. SC ساعدت في سلسلة الميل الشرح. تم تدريب SHS بواسطة CW حول كيفية تشريح وتنمو الخلايا العصبية. SHS، WCM ومرحاض تصور التجارب. أعد SHS المخطوطة مع مدخلات من مؤلفين آخرين.

تم تصوير هذا الفيديو في مركز التصوير الخلوية وNanoAnalytics (C-سينا) من Biozentrum رانه جامعة بازل. تم دمج C-سينا في إدارة النظم البيولوجية للعلوم والهندسة (D-BSSE) ETH زيورخ لل، وتقع في بازل، سويسرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dumont # 7 Tweezersعلوم المجهر الإلكتروني72803-01للتعامل مع شبكات EM أطباق
القاع الزجاجيMatTek Corp.P35G-1.5-10Cلزراعة عينة
شبكات الفحص المجهريالإلكتروني QuantifoilHoley Carbon، Au 200، R 2/2لزراعة عينة
ورق ترشيح خال من الكالسيومWhatman1541-055لعينة نشاف
ملاقط طويلة كبيرة مسطحةExcelta CorporationE003-000590 ، 25-SAلعينة النشاف   ؛
جهاز التزجيج والملاقطFEIVitrobot Mark IIIلتجميد عينة
صناديق تخزين MinigridTed Pella، Inc.160-40لتخزين شبكات EM حامل
نقل التبريدGatan626 حامل نقل النيتروجين السائل أحادي الإمالةلعينات التصوير
برنامج اقتناء سلسلة الإمالة شبه الآليSerialEMhttp://bio3d.colorado.edu/SerialEM/لعينات التصوير
برنامج معالجة الصورIMOD eTomohttp://bio3d.colorado.edu/imod/لمعالجة الصور
مجهر إلكتروني ناقل الحركة ل cryoEMJEOL ، طوكيو200 كيلو فولت JEM2100 LaB 6 < / sub > المجهر الإلكترونيلعينات التصوير
4K × 4k كاميرا CCDGatanN / Aلعينات التصوير
برنامج التعليقات التوضيحية ثلاثية الأبعادVisage Imaging GmbHAmira / Avizoلمعالجة البيانات ثلاثية الأبعاد
برنامج لخياطة الصور ثنائية الأبعادAdobeAdobe Photoshopلمعالجة بيانات 2-D
DMEM ، ارتفاع الجلوكوزInvitrogen11965-118لثقافة الحصين
حمض البوريكSigma AldrichB-0252لثقافة الحصين
رباعي الصوديومSigma AldrichB-9876لثقافة الحصين
Poly-L-lysine   ؛Sigma AldrichP2636-500MGلثقافة الحصين
نظام التصفيةCorning430758لثقافة الحصين
الوسط العصبيInvitrogen21103-049لثقافة DRG
B-27 مكملInvitrogen17504-044لثقافة DRG
البنسلين / الستربتومايسينInvitrogen15140-122لثقافة DRG
GlutaMAXInvitrogen35050-061لثقافة DRG
الفئران المؤتلفة b-NGFR & أنظمة D556-NGلثقافة DRG
UridineSigmaU3003-5Gلثقافة DRG
5'-Fluoro-2'-deoxyuridineSigmaF0503-100MGلثقافة DRG
MatrigelBD Biosciences356234لثقافة DRG
رقميا

المراجع

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer's disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. Modern characterization methods of surfactant systems. , Marcel Dekker. New York, New York, USA. (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943(2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. Structural bioinformatics. , Wiley-Blackwell. Hoboken, New Jersey, USA. (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, W.H. Freeman. New York, New York, USA. (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329(2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406(2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146(2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770(2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. Fundamental neuroscience. , Academic Press. Amsterdam; Boston. (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson's disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neuroscience. 108, 493-506 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إعداد الخلايا العصبية الأولية للتصور neurites التي في دولة مجمدة رطب عن طريق التصوير المقطعي البرد الإلكترون
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.