مقالة منهجية

التسجيل الفيزيولوجي الكهربي المتزامن وتصوير الكالسيوم للخلايا العصبية للنواة فوق الوظيفية

DOI:

10.3791/50794

⸱

ديسمبر 8, 2013

 , 
1Center for Research on Occupational and Environmental Toxicology, Oregon Health & Science University, 2Department of Behavioral Neuroscience, Oregon Health & Science University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف الإجراءات لإجراء تسجيلات متزامنة لإمكانات الغشاء أو التيار والتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. تمتلئ الخلايا العصبية للنواة فوق البلاشية بمؤشر الكالسيوم bis-fura-2 باستخدام قطب مشبك التصحيح في تكوين مشبك تصحيح الخلية بالكامل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > تم استخدام طرق تسجيل التصوير الفيزيولوجي الكهربي والفلوري المتزامنة لدراسة دور التغيرات في إمكانات الغشاء أو التيار في تنظيم تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. يمكن أن تؤدي الظروف البيئية المتغيرة ، مثل دورة الضوء والظلام ، إلى تعديل نشاط الشبكة العصبية والعصبية والتعبير عن عائلة من جينات الساعة البيولوجية داخل النواة فوق التصادمية (SCN) ، وهي موقع الساعة البيولوجية الرئيسية في دماغ الثدييات. يؤدي الإرسال المشبكي الاستثاري إلى زيادة تركيز Ca2+ بعد المشبكي الذي يعتقد أنه ينشط مسارات الإشارات التي تغير التعبير الإيقاعي لجينات الساعة البيولوجية. تم تثبيت شرائح ما تحت المهاد التي تحتوي على SCN باستخدام أقطاب كهربائية دقيقة مملوءة بمحلول داخلي يحتوي على مؤشر الكالسيوم bis-fura-2. بعد تشكيل ختم بين القطب الصغير والغشاء العصبي SCN ، تم تمزق الغشاء باستخدام شفط لطيف وانتشر مسبار الكالسيوم في الخلايا العصبية التي تملأ كل من سوما والتشعبات. تم تسجيل قياسات النسبة الكمية لتركيز الكالسيوم داخل الخلايا في وقت واحد مع إمكانات الغشاء أو التيار. باستخدام هذه الطرق ، من الممكن دراسة دور التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناتج عن النشاط المشبكي وإطلاق إمكانات الفعل للخلايا العصبية الفردية. في هذا العرض التقديمي نوضح طرق تسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي في وقت واحد جنبا إلى جنب مع الكالسيوم داخل الخلايا من الخلايا العصبية الفردية SCN المحفوظة في شرائح الدماغ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المعروف أن التغييرات في التعبير الجيني تحدث في الخلايا العصبية نتيجة للإشارات المتشابكة. يمكن أن تؤدي الإشارات بواسطة الناقل العصبي المثير الغلوتامات إلى إزالة استقطاب إمكانات الغشاء العصبي مما يؤدي في النهاية إلى نسخ الجينات وترجمتها1،2. يسمح تنشيط المستقبلات المتباينة بواسطة الغلوتامات لأيونات الكالسيوم خارج الخلية بدخول الخلية ، والتي يعتقد أنها تلعب دورا مهما كرسول ثان في تنشيط نسخ الجينات. يتطلب تقييم العلاقة بين النشاط الكهربائي للغشاء ، مثل تردد إطلاق جهد الفعل ، والتغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا مزيجا من طريقتين - لقط رقعة الخلية بأكملها والتصوير الكمي لمسبار الكالسيوم الفلوري3-5 ، مما يسمح بدراسة العلاقة في الخلايا العصبية الفردية. تسمح تقنية تسجيل الخلية المفردة بتسجيل نشاط الخلايا العصبية الفردية في أجزاء يمكن تحديدها من الدماغ. تسمح تقنية تسجيل الخلية بأكملها بالتحكم في جهد الغشاء أو التيار مما يسمح بالتلاعب التجريبي بتيارات القناة الأيونية المحددة. يضمن استخدام الماصات الدقيقة المملوءة بمجسات الكالسيوم الفلورية أيضا امتلاء الخلايا العصبية جيدا بمسبار الكالسيوم. تتمتع هذه التقنية بميزة واضحة عند العمل مع مستحضرات شرائح الدماغ من مستحضرات شرائح البالغين ، نظرا لأنه يصعب تحميل هذه الخلايا العصبية بشكل خاص باستخدام مجسات الخلية الأكثر شيوعا وتقلل من مشكلات تألق الخلفيةالمحتملة 6-8.

Light هي الطريقة الرئيسية التي تضبط بها الثدييات ساعتها البيولوجية ، والتي تقع في النواة فوق المهاد (SCN). تنتقل المعلومات الضوئية المنقولة في شبكية العين من 9 إلى 11 عبر الشبكية تحت المهاد (RHT) حيث يتم إطلاق الغلوتامات في SCN12،13. يفتح الغلوتامات مستقبلات الإشارات المؤيونية NMDA و AMPA الموجودة على الخلايا العصبية SCN التي تنتج تدفقا من الكالسيوم والصوديوم ، وتبدأ سلسلة إشارات داخل الخلايا تؤدي في النهاية إلى تغيير التعبير عن عائلة من جينات الساعة14-17 وتحولات في مرحلة الساعة البيولوجية18-20. ومع ذلك ، يمكن أن يدخل الكالسيوم الخلايا العصبية إما مباشرة من خلال مستقبلات الغلوتامات المؤثرة في الأيونات أو من خلال إزالة الاستقطاب الغشائي وتنشيط قنوات الكالسيوم المعتمدة على الجهد (VDCC) 21. لذلك قمنا بتطوير بروتوكول تجريبي للتحقيق في العلاقة بين تركيز الكالسيوم داخل الخلايا والنشاط الكهربائي للغشاء في الخلايا العصبية SCN ، مثل ما يحدث مع إطلاق جهد الفعل ومن المدخلات المشبكية22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير شرائح الدماغ تحت المهاد

  1. احصل مسبقا على موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) لأي إجراء يتعلق بالحيوانات. تتوافق الإجراءات الحيوانية الموضحة هنا مع إرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات لعام 2013 وتمت الموافقة عليها مسبقا من قبل جامعة أوريغون للصحة والعلوم IACUC.
  2. قم بإعداد 500 مل من المخزن المؤقت للتقطيع بدون MgCl2 و CaCl2 (الجدول 1). قم بفقاعة المحلول بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2 في درجة حرارة الغرفة ثم أضف MgCl2 و CaCl2 مع الاستمرار في التهوية. اضبط الأسمولية على 300 مللي أسمول باستخدام السكروز. يتم قياس الأسمولية باستخدام مقياس أسموية ضغط البخار.
  3. قم بإعداد 1 لتر من وسائط التسجيل بدون MgCl2 و CaCl2 (الجدول 2). قم بفقاعة المحلول بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2 ثم أضف MgCl2 و CaCl2 مع الاستمرار في التهوية. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2-7.4 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (10 نيوتن) والأسمولية إلى 300 مللي أسمول مع السكروز. تعد إضافة المخزن المؤقت HEPES اختياريا وتم استخدامها لزيادة استقرار درجة الحموضة.
  4. يمكن تخزين محاليل التقطيع والتسجيل في الثلاجة لعدة أيام قبل الاستخدام.
  5. حضري 3٪ من الاغاروز واسكبيها في طبق بتري معقم (بعمق 6 مم) وضعيها في الثلاجة.
  6. قطع ثلاثة مكعبات من الاغاروز حوالي 6 مم × 6 مم × 6 مم.
  7. قم بتخدير فأر Sprague-Dawley البالغ من العمر أربعة إلى ثمانية أسابيع باستخدام الأيزوفلوران. اختبار عمق التخدير. يعتبر عمق التخدير مناسبا عندما لا يكون هناك منعكس انسحاب للطرف الخلفي بعد الضغط على وسادة القدم. بمجرد تخديره بشكل مناسب ، يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق قطع الرأس السريع.
  8. قم بإزالة الدماغ بسرعة مع الحرص على قطع الأعصاب البصرية أولا ، وضعها في محلول تقطيع مثلج مشبع بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ O2 واتركه ليبرد لمدة 2-3 دقائق.
  9. تقليم الدماغ. ضع الدماغ باستخدام ملقط على ورق ترشيح دائري مبلل (بمحلول تقطيع) موضوعة على طبق بتري زجاجي يرتكز على الثلج.
  10. اقطع الدماغ إكليليا لإزالة المخيخ المتبقي وجذع الدماغ ، ثم القشرة المنقارية والجانبين ، لترك كتلة من الدماغ تحتوي على منطقة ما تحت المهاد مع الحفاظ بعناية على الجانب الذي يحتوي على SCN والأعصاب البصرية والتصاب البصري.
  11. انشر طبقة رقيقة من غراء السيانوا أكريليك كبيرة بما يكفي لربط كتل الدماغ والأغاروز في غرفة تقطيع ميكروتوم مثلجة ولكن جافة.
  12. انقل الجانب الذيلي لكتلة الدماغ المثلجة لأسفل على الغراء مع وضع الجانب الذي يحتوي على SCN للقطع أولا مع تشكيل الأعصاب البصرية "V" مشيرا لأعلى.
  13. ضع كتل الاغاروز على 3 جوانب أخرى. املأ الغرفة بمخزن تقطيع مثلج بارد باستمرار مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 95٪ O2. سوف يتجمد غراء السيانو أكريليك مع الرطوبة التي تثبت الدماغ وكتل الاغاروز في مكانها.
  14. قطع شرائح ما تحت المهاد الإكليلية (بسمك 220-250 ميكرومتر) تحتوي على SCN باستخدام الشفرة الاهتزازية الدقيقة. عادة ما يتم اختيار شريحة حيث يبلغ عرض التصلب البصري حوالي 2-4 مم ، وتظهر مثل شريط أبيض مع SCN ظهري فقط يظهر على شكل "فجوتين" صغيرتين في chiasm البصري على جانبي البطين الثالث (الشكل 1 أ).
  15. ضع الشرائح في غرفة التسجيل (36 درجة مئوية) المثبتة على مسرح مجهر Leica DMLFS. تمتلئ الغرفة بمحلول تسجيل متدفق باستمرار (2 مل / دقيقة) مهواة بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2 ويتم تسخينها مسبقا بسخان مضمن.
  16. قم بإجراء تسجيلات تصوير مشبك التصحيح والكالسيوم للخلية الكاملة في الخلايا العصبية SCN بعد 0.5-8 ساعات من تحضير الشريحة.
< p class = "jove_title" >2. تسجيل مشبك التصحيح

  1. تحضير محلول القطب الكهربائي (داخل الخلية) في نصف الحجم النهائي الكلي للماء.
  2. اضبط المحلول على درجة الحموضة 7.3 باستخدام KOH (1 N).
  3. أضف الماء المتبقي. يجب أن تكون الأسمولية النهائية للمحلول في حدود 280-290 mOsm.
  4. قم بتمرير محلول القطب الكهربائي عبر مرشح 0.2 ميكرومتر ، وسعر (0.5 مل) في أنابيب الطرد الدقيق ، وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
  5. تحضير مسبار الكالسيوم مكرر فيورا -2 محلول ملح سداسي البوتاسيوم (10 ملليمتر) عن طريق خلط 1 مجم ملح سداسي البوتاسيوم مكرر فيورا -2 مع 99.29 ميكرولتر من الماء المصفى 0.2 ميكرومتر.
  6. Aliquot في أنابيب منفصلة (2-5 ميكرولتر لكل منهما) والتجميد (-20 درجة مئوية).
  7. قم بإذابة كمية من المحلول الداخلي ومسبار Ca2+ قبل الاستخدام بوقت قصير. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون bis-fura-2 إلى 400 ميكرولتر من المحلول الداخلي للحصول على تركيز نهائي من مسبار الكالسيوم 50 ميكرومتر. تريتوري لفترة وجيزة لخلط الحلول. يختلف تركيز مسبار الكالسيوم (10-250 ميكرومتر) اعتمادا على التصميم التجريبي ونظام التصوير. لاحظ أن bis-fura-2 يتكون من جزيئين مرتبطين من fura-2.
  8. اسحب أقطاب التصحيح كاملة الخلية ، على مرحلتين إلى قطر طرف خارجي يبلغ حوالي 1 ميكرومتر ومقاومة من 7-10 MΩ عند ملؤها بالمحلول داخل الخلايا.
  9. قم بإعادة ملء القطب الكهربائي ببضعة ميكرولتر من المحلول الداخلي الذي يحتوي على مسبار الكالسيوم الذي تمت ترشيحه بفلتر حقنة 4 مم (0.2 ميكرومتر) للحصول على عينات منخفضة الحجم عبر أنبوب Microfil.
  10. قم بتطبيق قدر صغير من الضغط الإيجابي على القطب الكهربائي أثناء توجيهه إلى غرفة التسجيل تحت إضاءة الضوء الأحمر أثناء عرضه على شاشة فيديو.
  11. ضع القطب الصغير فوق SCN باستخدام هدف منخفض الطاقة (4X). يتم تحديد SCN على أنهما منطقتان شفافتان على جانبي البطين الثالث والظهري للتصلب البصري (الشكل 1 أ).
  12. قم بتبديل المجهر إلى تكبير عالي الطاقة (40X أو 63X). يمكن استهداف المناطق الفرعية من SCN والخلايا العصبية الفردية SCN للتسجيل بتكبير أعلى.
  13. قم بتطبيق ضغط إيجابي لطيف على القطب الصغير أثناء تقدمه على سطح الخلايا العصبية.
  14. ضع ضغطا سلبيا لطيفا على القطب الصغير لتشكيل ختم بمقاومة 3-10 GΩ.
  15. اضبط جهد الغشاء على -60 مللي فولت باستخدام مكبر الصوت الذي يتم التحكم فيه باستخدام برنامج الاستحواذ.
  16. قم بتطبيق ضغط سلبي إضافي على القطب لتمزيق غشاء الخلية في وضع الخلية بأكملها.
  17. عند الدخول في وضع الخلية بأكملها ، تمتلئ الخلايا العصبية SCN soma والتشعبات بمسبار الفلورسنت.
  18. يتم قياس جهد الغشاء في وضع المشبك الحالي أو التيار في وضع مشبك الجهد أثناء مراقبة بيانات صورة مسبار الكالسيوم وتخزينها (كما هو موضح أدناه). شاهد الصور المكتسبة جنبا إلى جنب مع رسم بياني لبيانات مضان بنسبة 340 نانومتر / 380 نانومتر أثناء التجربة.
< p class = "jove_title" >3. قياس الكالسيومداخل الخلايا 2+

  1. يتم الحصول على القياسات الكمية Ca2+ عن طريق تسجيل زوج من الصور عن طريق إثارة الأنسجة بسرعة بضوء الأشعة فوق البنفسجية عند 340 نانومتر و 380 نانومتر عبر مقياس أحادي اللون بعرض نطاق ترددي 10 نانومتر وتمريره عبر مرشح بصري UG11 لتقييد الأطوال الموجية التوافقية فوق 400 نانومتر ، وثنائي اللون DCLP 400 نانومتر والضوء المنبعث من خلال مرشح انبعاث 510±40 نانومتر.
  2. يتم الحصول على الصور باستخدام كاميرا CCD مبردة مع ضبط وقت الاستحواذ والتجميع لتقليل التبييض الضوئي وزيادة سرعة التسجيل.
  3. يتم استخدام برنامج التصوير الكمي للحصول على الصور وعرضها.
  4. حدد مناطق الاهتمام من الصورة الأولية ليتم تحويلها إلى بيانات وحدة شدة التألق النسبية (مثل سوما ، التغصنات ، إلخ). حدد أيضا منطقة لقياس مضان الخلفية (الشكل 1 ب).
  5. يتم حفظ الصور الأولية والبيانات البصرية الكمية باستمرار أثناء التجربة. بعد التجربة ، يتم إعادة تحليل الصور المحفوظة بشكل عام عندما يمكن أخذ المزيد من الوقت لتحديد المناطق ذات الاهتمام المراد قياسها بشكل أكثر دقة.
  6. يمكن تقديم البيانات على أنها تركيز الكالسيوم المقدر داخل الخلايا (Est[Ca2+]i). يتم استخدام نسبة (R) للضوء المنبعث بعد الإثارة وطرح الخلفية عند 340 نانومتر مقسومة على 380 نانومتر جنبا إلى جنب مع الحد الأقصى والحد الأدنى من التألق عند 340 نانومتر و 380 نانومتر لحساب تركيز الكالسيوم4. يتم إجراء طرح الخلفية وحسابات أخرى باستخدام برنامج تحليل البيانات.
  7. يمكن إجراء التحديد المختبري للحد الأقصى والحد الأدنى من مضان bis-fura-2 باستخدام 10 ملي مولار CaCl2 لارتباط Ca2+ و 10 ملي مولار EGTA للظروف الخالية من Ca2+. يعتبر ثابت الانفصال Ca2+ ، Kd للمسبار 370 نانومتر ل bis-fura-2 (Invitrogen).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام شرائح الدماغ تحت المهاد ، سجلنا في نفس الوقت تغييرات في الكالسيوم داخل الخلايا في وضع الخلية بأكملها في كل من ظروف الجهد والمشبك الحالي. يتم إنزال القطب الصغير الموضح في الشكل 1 أ إلى موضعه تحت تكبير عال (أهداف الأشعة فوق البنفسجية 40X أو 63X) مع كمية صغيرة من الضغط الإيجابي المطبق. بعد لمس الخلايا العصبية ، يتم تشكيل ختم جيجا أوم بشفط لطيف. في وضع مشبك الجهد بعد ضبط إمكانات غشاء الخلية على -60 مللي فولت ، يكسر الشفط الإضافي الغشاء مما يؤدي إلى تكوين الخلية بالكامل. سوف تمتلئ الخلايا العصبية بسر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الطرق الموضحة أعلاه أداة قوية لتسجيل العلاقة بين النشاط الكهربائي لغشاء الخلايا العصبية وتركيز الكالسيوم داخل الخلايا في نفس الوقت. تتميز هذه الطريقة بعدد من نقاط القوة من حيث أنها تجمع بين طريقتين مميزتين جيدا - تسجيل مشبك رقعة الخلية الكاملة وقياسه وقياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام أصباغ الفلورسنت. نهجنا مشابه لتلك التي وصفها المحققون الآخرون6،23.

يجب أن يؤخذ عدد من العناصر في الاعتبار عند استخدام الطريقة. الأول هو استخدام تكوين رقعة الخلية بالكامل ، مما يؤدي إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل العمل بمنحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (GM096972).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كلوريد الصوديومفيشر العلميةS271-3
شركة KClفيشر العلميةP217-500
NaH2PO4• H2Oشركة سيجما للكيماوياتS-9638
MgCl 2 < / sub > & 6H2Oشركة فيشر العلميةM33-500
CaCl 2 < / sub > & bull ؛ 2H2Oشركة فيشر العلميةC79-500
د-الجلوكوزفيشر العلمية المحدودةD16-500
NaHCO3Fisher Scientific Co.S233-500
السكروزفيشر العلميةS5-500
البوتاسيوم D-gluconateSigma-AldrichG4500
HEPESSigma-AldrichH4034
Adenosine 5 & prime ;-ثلاثي فوسفات ثنائي البوتاسيوم ملح ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشA8937
Guanosine 5 & prime;-triphosphate tris saltSigma-AldrichG9002
Agarose (ultrapure)Life التقنيات15510-027جل المثقوب في طبق بتري معقم طبقة سميكة 6 مم
KOHSigma-AldrichP-6310
NaOHSigma-AldrichS-5881
Bis-fura-2 ، ملح سداسي البوتاسيومInvitrogenB6810خلية غير منيعة
اسم المعداترقمكتالوجتعليقات
MicrotomeLeicaVT1000Sالأنسجة
الغراء السيانواكريليك (Roti-Coll1) CarlRoth GmbH + CoArt-Nr. 0258.1
مجتذب الأقطاب الكهربائيةالدقيقة Narshige International USAPP-83
Microde Microde أنابيب الشعيرات الدمويةالعالمية للأدواتالدقيقة 1B150F-4
Microfil 34 جمأدوات الدقة العالميةMF34G-5
مرشح حقنةCorning# 431212
مجهرLeicaDM LFSمع أهداف 4X و 40X UV و 63X UV ،
وكاميرا CCDHamamatsuORCA ER12 بت CCD
Fura-2 FilterCube Chroma71500Aمع مرشح UG11
متعدد الألوان IVحتى الضوئيات GmBHmonochronometer
نظارات السلامة الحاجب بالأشعة فوق البنفسجيةالأشعة فوق البنفسجية
EPC-9 مكبر للصوتHEKA Eletronik
Metafluorالجزيئيةبرامج التصوير
PatchmasterHEKA EletronikData Acquisition
Software Igor الإصدار 6Wavemetricsالفيزيولوجيا الكهربية & Ca2 + < / sup> تحليل البيانات
VAPRO 5520التناضح بضغط بخارWestcor
شركة شركة الشركة تقطيع منتجات الأجهزة مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bading, H., Ginty, D. D., Greenberg, M. E. Regulation of gene expression in hippocampal neurons by distinct calcium signaling pathways. Science. 260, 181-186 (1993).
  2. Ghosh, A., Ginty, D. D., Bading, H., Greenberg, M. E. Calcium regulation of gene expression in neuronal cells. J. Neurobiol. 25, 294-303 (1994).
  3. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  4. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  5. Higley, M. J., Sabatini, B. L. Calcium signaling in dendrites and spines: practical and functional considerations. Neuron. 59, 902-913 (2008).
  6. Colwell, C. S. Circadian modulation of calcium levels in cells in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 12, 571-576 (2000).
  7. Ikeda, M., Yoshioka, T., Allen, C. N. Developmental and circadian changes in Ca2+ mobilization mediated by GABAA and NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 17, 58-70 (2003).
  8. Irwin, R. P., Allen, C. N. GABAergic signaling induces divergent neuronal Ca2+ responses in the suprachiasmatic nucleus network. Eur. J. Neurosci. 30, 1462-1475 (2009).
  9. Berson, D. M., Dunn, F. A., Takao, M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock. Science. 295, 1070-1073 (2002).
  10. Hattar, S., Liao, H. W., Takao, M., Berson, D. M., Yau, K. W. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 295, 1065-1070 (2002).
  11. Hartwick, A. T., et al. Light-Evoked Calcium Responses of Isolated Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells. J. Neurosci. 27, 13468-13480 (2007).
  12. Castel, M., Belenky, M., Cohen, S., Ottersen, O. P., Storm-Mathisen, J. Glutamate-like immunoreactivity in retinal terminals of the mouse suprachiasmatic nucleus. Eur. J. Neurosci. 5, 368-381 (1993).
  13. Card, J. P., Moore, R. Y. The organization of visual circuits influencing the circadian activity of the suprachiasmatic nucleus. In Suprachiasmatic Nucleus - The Mind's Clock. Reppert, S. M., Klein, D. C., Moore, R. Y. , Oxford University Press. Oxford. 51-76 (1991).
  14. Shigeyoshi, Y., et al. Light-induced resetting of a mammalian circadian clock is associated with rapid induction of the mPer1 transcript. Cell. 91, 1043-1053 (1997).
  15. Albrecht, U., Sun, Z. S., Eichele, G., Lee, C. C. A differential response of two putative mammalian circadian regulators, mper1 and mper2, to light. Cell. 91, 1055-1064 (1997).
  16. Yan, L., Silver, R. Differential induction and localization of mPer1 and mPer2 during advancing and delaying phase shifts. Eur. J. Neurosci. 16, 1531-1540 (2002).
  17. Lowrey, P. L., Takahashi, J. S. Genetics of the mammalian circadian system: Photic entrainment, circadian pacemaker mechanisms, and posttranslational regulation. Annu. Rev. Genet. 34, 533-562 (2000).
  18. Ding, J. M., et al. Resetting the biological clock: Mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 266, 1713-1717 (1994).
  19. Ding, J. M., Fairman, L. E., Hurst, W. J., Kuriashkina, L. R., Gillette, M. U. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal CREB phosphorylation via light, glutamate, and nitric oxide. J. Neurosci. 17, 667-675 (1997).
  20. Ding, J. M., et al. A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock. Nature. 394, 381-384 (1998).
  21. Bollmann, J. H., Helmchen, F., Borst, J. G., Sakmann, B. Postsynaptic Ca2+ influx mediated by three different pathways during synaptic transmission at a calyx-type synapse. J. Neurosci. 18, 10409-10419 (1998).
  22. Irwin, R. P., Allen, C. N. Calcium Response to Retinohypothalamic Tract Synaptic Transmission in Suprachiasmatic Nucleus Neurons. J. Neurosci. 27, 11748-11757 (2007).
  23. Smetters, D., Majewska, A., Yuste, R. Detecting action potentials in neuronal populations with calcium imaging. Methods. 18, 215-221 (1999).
  24. Spruston, N., Johnston, D. Perforated patch-clamp analysis of the passive membrane properties of three classes of hippocampal neurons. J. Neurophysiol. 67, 508-528 (1992).
  25. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).
  26. Marty, A., Neher, E. Tight-seal whole-cell recording. Single-channel recording. Sakmann, B., Neher, E. 2, Plenum Press. New York. 31-52 (1995).
  27. Sarantopoulos, C., McCallum, J. B., Kwok, W. M., Hogan, Q. Beta-escin diminishes voltage-gated calcium current rundown in perforated patch-clamp recordings from rat primary afferent neurons. J. Neurosci. Methods. 139, 61-68 (2004).
  28. Hatae, J., Fujishiro, N., Kawata, H. Spectroscopic properties of fluorescence dye fura-2 with various divalent cations. Jap. J. Physiol. 46, 423-429 (1996).
  29. Poenie, M. Alteration of intracellular Fura-2 fluorescence by viscosity: a simple correction. Cell Calcium. 11, 85-91 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Bis fura 2

مقالات ذات صلة