مقالة منهجية

الأغشية الحيوية الميكروبية النشطة كهربائيا المشتقة من مياه الصرف الصحي: النمو والصيانة والتوصيف الأساسي

16.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50800

⸱

ديسمبر 29, 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

في هذه المقالة

ملخص

يتم توضيح النمو الزمني للأغشية الحيوية الميكروبية الكهربية الأنودية في مفاعل دفعة فيد باستخدام إعداد ثلاثي الأقطاب الكهربائية ، يتم التحكم فيه بواسطة potentiostat. يتميز نقل الإلكترون خارج الخلية باستخدام قياس الفولتامتر الدوري في وجود المانح للإلكترون وفي غياب المانح للإلكترون. يتم عرض تحليل البيانات الأساسية.

الملخص

يتم إثبات نمو الأغشية الحيوية الميكروبية الكهربية الأنودية من لقاح مياه الصرف الصحي في مفاعل دفعة فيد باستخدام إعداد ثلاثي الأقطاب التي يتم التحكم فيها بواسطة بوتينسيوستات. وبالتالي ، فإن استخدام potentiostats يسمح بالتعديل الدقيق لإمكانات القطب الكهربائي ويضمن ظروف زراعة ميكروبية قابلة للتكرار. أثناء النمو ، تتم مراقبة الإنتاج الحالي باستخدام قياس التيار الزمني (CA). بناء على هذه البيانات ، تمت مناقشة كثافة التيار القصوى (jmax) والكفاءة الكولومية (CE) كمقاييس لتوصيف الأداء الكهربائي الحيوي. قياس الفولتامتر الدوري (CV) ، غير مدمر ، أي تستخدم الطريقة غير الغازية لدراسة نقل الإلكترون خارج الخلية (EET) للبكتيريا النشطة بالكهرباء. يتم إجراء قياسات السيرة الذاتية على أقطاب الأغشية الحيوية الأنودية في وجود الركيزة الميكروبية ، أي ظروف الدوران ، وفي حالة عدم وجود الركيزة ، أي ظروف عدم الدوران ، باستخدام معدلات مسح مختلفة. بعد ذلك ، يتم توضيح تحليل البيانات ويتم اشتقاق وشرح المعلمات الديناميكية الحرارية الأساسية ل EET الميكروبي: ذروة الجهد (Ep) ، وكثافة التيار الأقصى (jp) ، والإمكانات الرسمية (Ef) وفصل الذروة (ΔEp). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تناول حدود الطريقة وتحليل البيانات الحديث. وبالتالي ، يجب أن توفر مقالة الفيديو هذه دليلا للخطوات التجريبية الأساسية وتحليل البيانات الأساسية.

المقدمة

يعد توضيح أساسيات نقل الإلكترون الميكروبي خارج الخلية (EET) واستغلاله في الأنظمة الهندسية مجالا حيويا وسريع النمو للبحث والتطوير1-3. تتطلب دراسة هذه الكائنات الحية الدقيقة النشطة كهربائيا (أو التحفيز الحيوي أو النشطة كهروكيميائيا) ، بما في ذلك السلالات النقية بالإضافة إلى المزارع المشتركة المحددة والاتحادات المعقدة ، ترسانة معقدة من التقنيات والأساليب والبروتوكولات4. تستمد هذه الأساليب من تخصصات علمية متنوعة ، مثل الكيمياء الكهربائية ، وعلوم المواد ، وعلم الأحياء الدقيقة ، وتوفر رؤى حول المستويات الهرمية المختلفة ، أي. من الأغشية الحيوية الميكروبية بأكملها إلى الجزيئات المفردة. وبالتالي ، تمثل الكيمياء الكهربية والطرق الكهروكيميائية أساس جميع الأنشطة.

< p class = "jove_content"> تقليديا ، غالبا ما تستخدم إعدادات نوع خلايا الوقود لنمو وصيانة الثقافات الميكروبية الكهربية في النموذج الأصلي لهذه الأنظمة الهندسية: خلايا الوقود الميكروبية (MFCs) 5. لسوء الحظ ، غالبا ما لا تسمح هذه الأنواع من MFCs بمراقبة أو حتى التحكم في إمكانات قطب كهربائي واحد ، وبالتالي ، كانت الأفكار المحدودة فقط ممكنة في عمليات القطب الكهربائي - تم الإبلاغ عن جهد الخلية فقط. الآن من المسلم به أكثر فأكثر أن المراقبة الفردية والتحكم في إمكانات الأقطاب الكهربائية المفردة في MFCs تمثل ميزة واضحة ، ليس فقط للبحث الأساسي ولكن أيضا للهندسة. علاوة على ذلك ، مع تنويع تطبيقات التقنيات الكهروكيميائية الميكروبية التي تشمل الآن ، على سبيل المثال المعالجة ، وتحلية المياه ، والتوليفات ، وحتى الحوسبة الحيوية ، في ما يسمى بالأنظمة الكهروكيميائية الحيوية الميكروبية (BES) 2،6،7 غالبا ما يكون التحكم الخارجي في إمكانات القطب الفردي كبيرا. عادة ما يتم تحقيق هذا التحكم باستخدام مصادر طاقة خارجية أو potentiostats. وبالتالي ، فإن استخدام potentiostats يسمح - على عكس الأنواع الأخرى من الإعدادات - بتعديل دقيق لإمكانات القطب الفردي. هذا له أهمية كبيرة لأن القطب يمثل متقبل الإلكترون الميكروبي النهائي (للأنودات) أو المانح للإلكترون (للكاثود) لنقل الإلكترون خارج الخلية. يوضح الشكل 1 الحالة الحالية للمعرفة حول EET الميكروبي في الأنودات - انظر للحصول على التفاصيل على سبيل المثال 2،4،6،8،9 لا يزال EET في الكاثود غير مستغلبشكل أساسي 10.

وبالتالي فإن التحكم في إمكانات القطب لا يتيح فقط استخدام ظروف زراعة ميكروبية قابلة للتكرار ولكن أيضا تكييفها من حيث الديناميكا الحرارية EET11. في هذه المقالة ، تم توضيح كيف يمكن استخراج المعلمات المميزة للأغشية الحيوية الميكروبية الكهربية من تجارب مفاعلات الدفعات التغذوية باستخدام قياس التوازن الزمني (CA) وقياس الجهد الدوري (CV). يتضمن ذلك معلمات الأداء والحد الأقصى لكثافة التيار (jmax) والكفاءة الكولونمية (CE) بالإضافة إلى خصائص EET. هنا سيكون تحديد الإمكانات الرسمية (Ef) لمواقع نقل الإلكترون المحتملة والفعلية في بؤرة التركيز. يظهر استخراج هذه المعلمات على سبيل المثال من الأغشية الحيوية المستمدة من مياه الصرف الصحي المختلطة التي تهيمن عليها مواصفات Geobacter. 12 يتم الحصول على هذه الأغشية الحيوية المشتقة من مياه الصرف الصحي من خلال إجراء اختيار كهروكيميائي بسيط كما هو موضح من قبل العديد من المجموعات البحثية حول العالم13-16.

التقنيات الكهروكيميائية الديناميكية لدراسة نقل الإلكترون الميكروبي خارج الخلية

من أجل التوصيف الديناميكي الحراري ل EET للثقافات الميكروبية النشطة كهربائيا ، هناك حاجة إلى تقنيات كهروكيميائية ديناميكية. بشكل عام ، تشمل هذه التقنيات التحكم في الإمكانات ، أي الفولتامتري ، والتحكم في التيار ، أي الديناميكا الجلفانودية ، التقنيات17. لذلك التقنيات المحتملة التي تضبط أكثر انتشارا وتشمل على سبيل المثال, قياس الفولتمتر الموجة المربعة وقياس الفولتمتر الخطي18. الأكثر شيوعا ، ومع ذلك ، هو قياس الفولتامتر الدوري (CV) 19،20. السيرة الذاتية معروفة ومنتشرة على نطاق واسع في مجالات مختلفة من الكيمياء الكهربية بدءا من أبحاث البطاريات عبر علوم المواد إلى الكيمياء الكهربية الحيوية للإنزيم21. لا يمكن أن يعود تاريخ تطبيقه على الخلايا الميكروبية الحية إلا إلى أكثر من عقدواحد 22 ويزداد بشكل ملحوظ خلال السنوات الماضية23،24. قدم الجمع بين السيرة الذاتية والطرق الطيفية بشكل خاص رؤى غير مسبوقة في آليات EET وطبيعتها الجزيئية ، على سبيل المثال 25 ، 26 في موازاة ذلك ، تم توسيع وتعميق الإطار النظري لاستخراج الخصائص الديناميكية الحرارية والنظرية ل EET الميكروبي27-30. في المقابل ، ومع ذلك ، فإن سوء التعامل التجريبي أو تحليل البيانات غير الكافي غالبا ما يعيق التطبيق المناسب للسيرة الذاتية في مجال الكيمياء الكهربية الحيوية الميكروبية. لذلك ، بالإضافة إلى ورش العمل (على سبيل المثال في EU-ISMET 2012) والبرامجالتعليمية 19 ، يجب أن توفر مقالة الفيديو هذه دليلا أساسيا لإجراء التجارب الفولتامتري الدورية على البكتيريا الكهربائية. وبالتالي فهي تركز على الخطوات التجريبية الأساسية وتحليل البيانات الأساسية ولا يقصد بها توفير أحدث بروتوكولات التحليل الحركي. يتم تلخيص أهم المحطات للمناقشة التالية في المربع 1 (مقتبس من Harnisch and Freguia19 وتم تعديله).

البروتوكول

< p class = "jove_content" >نظرا لأن إجراء الاختيار في مفاعل الدفعة الكهروكيميائية الحيوية محدد للغاية بسبب اختيار الركيزة وظروف نقص الأكسجين ، فإن العمل في ظروف معقمة ليس ضروريا للمثال المظهر.

< p class = "jove_title" >1. تحضير وسط النمو

  1. قم بإعداد كمية مناسبة من وسط النمو باستخدام مخزن مؤقت للفوسفات وفقا ل Kim et al.(انظر الجدول 1). هنا ، يعمل أسيتات الصوديوم (10 ملليمتر) كركيزة. وسيط النمو المستخدم في هذه المقالة هو مثال واحد فقط ، واعتمادا على الغرض التجريبي يمكن أن يختلف في مكوناته.
  2. أضف 1 مل من مياه الصرف الصحي الأولية لكل 20 مل من وسط النمو كلقاح. تؤخذ عينة مياه الصرف الصحي من محطة معالجة مياه الصرف الصحي البلدية بعد الترشيح الميكانيكي (انظر على سبيل المثال الشكل 2) ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر حتى استخدامها في حاوية مغلقة عند 4 درجات مئوية.
    (ملاحظة: اعتمادا على الهدف من التجربة ، يمكن أن يكون العدد الأولي الدقيق للخلايا مهما ومن ثم يجب تحديده. في المثال الموضح ، فإن العدد الأولي للخلايا ليس مهما ، حيث يصل الأغشية الحيوية إلى ظروف الحالة المستقرة.)
  3. اغسل الوسط بما في ذلك اللقاح بالنيتروجين لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة الهواء ، عن طريق إدخال إبرة في الوسط وتشغيل تيار النيتروجين. يجب أن يكون التيار قويا بما يكفي بحيث يمكنك ملاحظة خلط كامل للوسط.
    (ملاحظة: اعتمادا على حجم الوسط ، يجب على المرء أن يفكر في تمديد وقت إزالة الهواء. أثناء إعداد إزالة الهواء ، يقوم مفاعل الدفعة الفيدرالية (الخطوات 2.1-2.2))

2. إعداد مفاعل الدفعة الفيدرالية

  1. خذ وعاء مفاعل مناسب- هنا يتم استخدام قارورة مستديرة القاع ذات 4 رقبة معدلة سعة 250 مل.
    (ملاحظة: بشكل عام يجب أن تحتوي السفينة على أربعة مداخل على الأقل. هذه ضرورية للأقطاب الكهربائية الثلاثة ولأخذ العينات / تبادل الوسائط. يمكن إهمال أحجام الغاز المنتجة عند فتح المفاعل بانتظام بسبب أخذ العينات أو التغيير المتوسط ، بدلا من ذلك يجب تركيب عداد فقاعات. من أجل تجنب النمو الضوئي غير المرغوب فيه ، يجب حماية المفاعلات من التعرض المباشر للضوء.)
  2. لإعداد الأقطاب الكهربائية الثلاثة (انظر الشكل 3 والقسم 3 للحصول على التفاصيل) ضع القطب المرجعي (RE) (هنا Ag / AgCl ، sat. KCl ، 0.197 V مقابل SHE) ، القطب الكهربائي العامل (WE) والقطب المضاد (CE) في القارورة من خلال المداخل الفردية عبر سدادات السيليكون - ختم محكم الغلق.
    (ملاحظة: كما يتم استخدام قضبان الجرافيت WE و CE. يتم سحب سلك الأقطاب الكهربائية من خلال سدادة السيليكون وتثبيته خارجيا. يتم وضع القطب المرجعي من خلال سدادة السيليكون عبر ثقب محفور. لتجنب الدوائر القصيرة ، تأكد من عدم وجود اتصال مادي للأقطاب الكهربائية ، حتى أثناء التقليب أو إعادة تدوير الوسائط. ضع الأقطاب الكهربائية التي تم تغطيتها بالكامل بمحلول متوسط. للختم ، لف سدادة السيليكون لكل مدخل باستخدام Parafilm.)
  3. صب وسط النمو بما في ذلك اللقاح (هنا 250 مل) من خلال منفذ أخذ العينات في المفاعل أثناء التنظيف بالنيتروجين.
  4. أغلق المدخل الأخير بسدادة سيليكون وأغلقه بإحكام الهواء. ملاحظة: آثار الأكسجين لن تضر بالأغشية الحيوية للأنواع المختلطة. إنهم قادرون على تحمل وحتى استهلاك مستويات منخفضة من الأكسجين والتي بدورها قد تقلل من CE.
< p class = "jove_title" >3. نمو الأغشية الحيوية الكرونوأمبيرومترية

  1. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بالكابلات الخاصة ب potentiostat. ضع الوعاء في غرفة يتم التحكم في درجة الحرارة ، وهنا يتم استخدام 35 درجة مئوية31 ، من أجل ضمان الظروف البيئية الثابتة.
  2. افتح البرنامج للتحكم في الجهد واختر التقنية: قياس الدوران والانفعال. اضبط المعلمات على سبيل المثال على النحو التالي: جهد ثابت EWE يبلغ 0.2 فولت (مقابل Ag / AgCl) لمدة t 500 ساعة (≈ 20 يوما). يتم تسجيل التيار في الخطوات الزمنية dti كل دقيقة.
    ملاحظة: يعتمد اختيار الإمكانات المطبقة على النظام / الكائنات الحية الدقيقة المدروسة. بشكل عام ، تتم دراسة عمليات الأنود في الإمكانات الموجبة وعمليات الكاثود عند الإمكانات السلبية. يمكن للمرء أيضا استنتاج إمكانات مناسبة من الإمكانات القياسية للمانح / المتقبل للإلكترون والإمكانات الرسمية لموقع نقل الإلكترون الميكروبي المتوقع ، هنا كنقطة انطلاق ، يرجى الرجوع إلى الأدبيات الحديثة.
  3. ابدأ قياس التوازن الزمني. يتم رسم رسم بياني للتيار المقاس بمرور الوقت بواسطة البرنامج ، والحد الأقصى للتيار المرصود (imax) هو معلمة مهمة عبر الإنترنت ، كما تمت مناقشته في القسمين 4 و 5.
فئة

4. صيانة الأغشية الحيوية

  1. اعتمادا على الظروف البيئية ، على سبيل المثال درجة الحرارة ، يبدأ التيار التأكسدي في التدفق ويصل إلى هضبة (انظر الشكل 4). بعد الوصول إلى تيار الصفر مرة أخرى ، أوقف القياس الزمني مؤقتا وقم بتجديد المحلول المتوسط. لنمو الأغشية الحيوية بشكل أسرع ، استبدل الوسط مباشرة بعد الوصول إلى هضبة الحد الأقصى للتيار. افتح منفذ أخذ العينات وبعناية ، دون تدمير الأغشية الحيوية الرقيقة ، قم بتفريغ الوسيط. أثناء إعادة ملء الوسط مرة أخرى بالنيتروجين. أغلق منفذ أخذ العينات وأغلقه بإحكام الهواء.
  2. كرر إجراء الخطوة 4.1. حتى يصل الحد الأقصى للتيار التأكسدي إلى حالة مستقرة (انظر الشكل 4).
    (ملاحظة: يعتقد أن الثابت imax يشير إلى تكوين غشاء حيوي مستقر في الحالة المستقرة.)
  3. خذ عينات 1 مل من المحاليل المتوسطة الطازجة والمتبادلة لتحليل الركيزة ، على سبيل المثال بواسطة HPLC. هناك حاجة لاحقا إلى تركيز الركيزة الأولي (الأسيتات) (c0) بالإضافة إلى تركيز محلول الركيزة المتبقي (c1) لحسابات الكفاءة (انظر قسم تحليل البيانات).
    ملاحظة: لتحقيق نتائج غير معدلة ، على سبيل المثال بسبب زيادة استهلاك الركيزة ، قم بتحليل عينات الركيزة على الفور. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فقم بتخزين العينات في الفريزر على درجة حرارة لا تقل عن -18 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن شهر.)
فئة

5. تطبيق قياس الجهد الدوري لدراسة EET

  1. قم بإجراء قياس الفولتامتر الدوري عند الحد الأقصى والحد الأدنى لتدفق التيار كما هو موضح (الشكل 4). اعتمادا على مسألة الاهتمام ، عادة ما يتم تنفيذ السيرة الذاتية عندما يصل النظام إلى حالة مستقرة للحصول على نتائج قابلة للمقارنة. (ملاحظة: يطلق على توليد التيار ظروف دوران ويرتبط بالأكسدة الميكروبية للركيزة ونقل الإلكترون اللاحق: التحفيز الكهربائي الحيوي الميكروبي ؛ في حين يتم تنفيذ السير الذاتية غير الدورانية عند (تقريبا) تدفق تيار صفري في CA.)
  2. اختر في برنامج التحكم في الجهد التقنية: قياس الفولتازات الدوري ، وقم بتعيين المعلمات المناسبة ، هنا على سبيل المثال: إمكانات أولية ل EWE إلى Ei من -0.5 V مقابل RE بمعدل مسح v = dE / dt من 1 مللي فولت / ثانية إلى رأس محتمل E1 من 0.3 فولت مقابل RE والعودة إلى إمكانات البداية E2 = Ei من -0.5 V.
    ملاحظة: عند استخدام قياس الفولتامتر الدوري ، يتم تغيير الجهد المطبق في WE خطيا مع مرور الوقت بواسطة الجهد (انظر الشكل 5) - يوفر المربع 2 القواعد الأساسية لاختيار معلمات التجربة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
  3. ابدأ قياس الفولتامتر الدوري وسجل العديد من الدورات حسب الحاجة لإجراء سيرة ذاتية قابلة للتكرار. تسمى المخطط الناتج بالرسم الفولتمامي الدوري (انظر أيضا الشكل 7). ملاحظة: اعتمادا على ظروف القياس ، يمكن الحصول على معلومات مختلفة كما هو موضح في القسم التالي.

6. رسم البيانات

هنا تتم مناقشة رسم البيانات فقط. يتبع القسم التالي أطروحة أكثر تفصيلا.

  1. استخدم برنامج تحليل البيانات المناسب ، حيث يتم تصدير جميع البيانات كنص واستيرادها كملف ASCII.
  2. حساب واستخدام الكثافة الحالية التفضيلية (j) وليس التيارات المطلقة (i).
    (ملاحظة: ومع ذلك ، نظرا لوجود بروتوكولات مختلفة لحساب j ، وضح أيها تم استخدامه. هنا الكثافة الحالية لكل هندسية ، أي يتم استخدام مساحة سطح القطب المتوقعة.)
  3. قياس التوازن الزمني: ارسم كثافة التيار المقاسة كدالة للوقت.
  4. الفولتامتر الدوري: ارسم كثافة التيار المقاسة كدالة لإمكانات WE Eنحن.

النتائج

1. قياس التيار الزمني (Chronoamperometry)

يمكن حساب خاصيتين تشغيليتين من قياسات قياس التيار الزمني: كثافة التيار القصوى (جالحد الأقصى), أي، الحد الأقصى لتدفق الإلكترونات في الثانية، والكفاءة الكولومبية (الرحلان الكهربائي الشعري), أيْإجمالي تدفق التيار بالنسبة للركيزة المستهلكة. الشكل 4 يوضح منحنى نمو الغشاء الحيوي الكرونو-أمبيرومتري النموذجي لعدة دورات نمو باستخدام مفاعل التغذية المتقطعة. بعد مرحلة السكون الأولية، يبدأ الحد الأقصى الأول لكثافة التيار، ثم ينخفض التيار مرة أخرى بسبب نضوب الركيزة. وعندما يصل تدفق التيار إلى الصفر (تقريبًا)، يتم استبدال الوسط كما هو موضح. وبعد تعويض الركيزة هذا، تزداد كثافة التيار مرة أخرى، وتكون كثافة التيار القصوى التالية أعلى من الأولى. وبعد عدة دورات نمو جالحد الأقصى ثابت - مما يشير إلى تكون غشاء حيوي في حالة مستقرة14بينما تكون الحالة المستقرة جالحد الأقصى تعتمد القيمة على عدة معايير، على سبيل المثال مادة القطب الكهربائي، ودرجة حرارة المفاعل، وتكوين الغشاء الحيوي، وغالباً ما تُعتبر هذه العوامل خاصية لنظام معين من الغشاء الحيوي الميكروبي النشط كهربائياً/ القطب الكهربائي. (في حالة المفاعلات ذات التدفق المستمر لا جالحد الأقصى، ولكن يتم استخدام كثافة التيار الثابتة في الحالة المستقرة.) أما الخاصية التشغيلية الثانية فهي الكفاءة الكولومية (CE) (المعادلة 1). وهذا هو عدد الإلكترونات التي يتم تسجيلها على شكل تدفق تيار كهربائي، سp لكل دورة تغذية مجمعة (fed-batch) فيما يتعلق بالعدد الأقصى النظري للإلكترونات سth, والتي تُحسب من استهلاك الركيزة خلال هذه الدورة.

صيغة الاتزان الساكن CE=QP/Qth×100؛ حساب الكفاءة في مخطط العملية.

(المعادلة 1)

يمكن الحصول على إجمالي الشحنة المنقولة من خلال تكامل منحنى CA (انظر أيضاً الشكل 6):

حساب الشحنة الكهربائية، المعادلة، \( Q_P = \int_0^t i \, dt \)، طريقة التكامل.

(المعادلة 2)

يتم حساب الشحنة الكهربائية الممكنة نظرياً وفقاً لقانون فاراداي:

معادلة الديناميكا الحرارية Qth=ΔcVzF، تحليل الجهد الكيميائي، للاستخدام التعليمي.

(المعادلة 3)

حيث يمثل V حجم وسط النمو، و F ثابت فاراداي (F = 96,485.34 C/mol)، و z عدد الإلكترونات المتحررة من الركيزة المؤكسدة (في حالة الأسيتات، يتم تحرير 8 إلكترونات أثناء الأكسدة إلى CO2)، و Δc = c0-c1، والتي تمثل استهلاك الركيزة (يتم تحديدها بواسطة طرق التحليل الكيميائي، على سبيل المثال بواسطة HPLC).

2. الفولتاميتري الحلقية:

يتم تسجيل مخططات الفولتاميتري الحلقية في ظروف عدم التحويل وظروف التحويل (كما هو موضح في الشكل 4). وفي كلتا الحالتين، يمكن الحصول على أنواع مختلفة من المعلومات. ويتم مناقشة كيفية تحديد مواقع انتقال الإلكترونات خارج الخلية (EET) المحتملة والفعلية فيما يلي.

2.1 ظروف عدم الدوران – تحديد مواقع EET المحتملة:

يوضح الشكل 7 منحنيات الفولتاميتري الحلقية (CVs) النموذجية في ظروف عدم التحول، أي في غياب الركيزة. ويظهر الشكل 7A منحنى الفولتاميتري الحلقية لغشاء حيوي (biofilm) عند معدلات مسح عالية (هنا 50 mV/sec) حيث يمكن تحديد زوج واحد فقط من القمم، وبالتالي جهد رسمي واحد Ef. وبشكل عام، يمكن حساب الجهد الرسمي لزوج أكسدة واختزال من جهد قمة أكسدة EpA وجهد قمة اختزال للأنواع المعنية EpC عن طريق حساب المتوسط الحسابي (انظر أيضاً الشكل 7C):

معادلة الكيمياء الكهربائية: Ej = (EpA + Epc)/2، لتحليل جهد الأكسدة والاختزال في دراسات الفولتامتري.

(المعادلة 4)

عند تطبيق معدل مسح منخفض بما يكفي على الغشاء الحيوي الرقيق ذاته (في هذه الحالة 1 mV/sec)، يمكن تحديد ما يصل إلى أربعة أزواج أكسدة واختزال (تم توضيح الجهود الرسمية المقابلة لها في الشكل 7B). والسبب في ذلك هو أن تيار الخلفية السعوي ينخفض عند استخدام معدلات مسح أقل، انظر أيضاً المربع 1 وعلى سبيل المثال17,21 لمزيد من التفاصيل. ومع ذلك، فإن فولتامتريا الحلقة (CV) غير التحويلية تظهر فقط جميع المركبات النشطة كيميائياً عند القطب، وبالتالي تُظهر Ef لمواقع انتقال الإلكترونات خارج الخلية (EET) المحتملة. فقط تحليل فولتامتريا الحلقة التحويلية هو الذي يوفر Ef لمواقع انتقال EET الفعلية (انظر الخطوة 2.2.).

عند إجراء تحليل إضافي لمنحنيات الفولتاميتري الحلقية (CVs) غير المرتدة، يمكن تحليل معايير مميزة أخرى مثل فصل القمم ΔEp (المعادلة 5) أو تيار القمة الأقصى ipA وتيار القمة الأدنى ipC (انظر الشكل 7C).

معادلة التوازن الساكن ΔEP=EpA-EpC؛ مخطط صيغة لأغراض تعليمية.

(المعادلة 5)

يمكن استخدام هذه المعايير، خاصة عند تسجيلها لمعدلات مسح مختلفة، في التحليل الميكانيكي والحركي لعمليات نقل الإلكترونات عند الأقطاب الكهربائية. ومع ذلك، فإن هذا التحليل الحركي، والمؤصل جيداً في الأنظمة الكيميائية، ليس بسيطاً بالنسبة للأغشية الحيوية الميكروبية النشطة كهربائياً، انظر على سبيل المثال19,30

  1. ظروف التدوير – تحديد مواقع EET الفعلية:

عند إجراء قياس CV في وجود الركيزة، يتم الحصول على CV التحول (انظر الشكل 8A). بعد رسم البيانات، يمكنك رؤية المنحنى التقليدي الذي يتخذ شكل حرف s، والذي يسمى بالمنحنى التحفيزي الكهربائي الحيوي17-19. عند إجراء تحليل إضافي للبيانات، توفر القيمة القصوى للمشتقة الأولى، أي نقطة الانقلاب في منحنى CV، الجهد الرسمي Ef لموقع (أو مواقع) EET الفعلية (انظر الشكل 8B). في حالة الغشاء الحيوي الفتي، أي الرقيق، والمهيمن عليه من قبل Geobacteraceae، هنا بعد 168 h من بدء CA، يمكن ملاحظة نقطتي انقلاب. لاحقاً، تظهر المشتقة قيمتين قصويين تتوافقان مع الجهد الرسمي لمواقع EET النشطة تحفيزياً كهربائياً حيوياً: -0.376 V و -0.295 V مقابل Ag/AgCl (sat. KCl, 0.197 V مقابل SHE). في الشكل 7B، يتم تسمية هذه المواقع بـ Ef,2 و Ef,3 على التوالي. توضح هذه النتيجة أيضاً أن عمليات الأكسدة والاختزال المرتبطة بالجهد الرسمي Ef,1 و Ef,4 (في CV غير التحولي) لا علاقة لها بالتحفيز الكهربائي الحيوي. ومع نمو الغشاء الحيوي وزيادة سمكه، يظهر CV نقطة انقلاب واحدة فقط، أي قيمة قصوى واحدة في منحنى المشتقة. هذا الجهد الرسمي Ef، والذي يبلغ هنا -0.32 V مقابل Ag/AgCl (sat KCl)، يساوي (تقريباً) المتوسط الحسابي للجهدين الرسميين المخصصين لـ EET في الغشاء الحيوي الرقيق (على سبيل المثال هنا Ef,2 و Ef,3) – انظر الشكل 9. يوضح هذا أن تحليل CV الأساسي جداً هذا يوفر بالفعل رؤى حول ديناميكا EET الحرارية بطريقة سريعة وغير جراحية، ولكن من الجدير بالذكر أنه لا يسمح باستخلاص استنتاجات ميكانيكية أو حركية إضافية.

ومن الجدير بالذكر أن الأغشية الحيوية التي يتم الحصول عليها من خلال الظروف المحددة في هذا البروتوكول تكون مهيمنة للغاية من قبل أنواع Geobacter (غير موضح هنا)12,15. كما أن تغيير معايير مختارة e.g. الركيزة، ودرجة الحرارة، etc. سيؤثر أيضاً على التركيب الميكروبي وبالتالي على الخصائص الكهروكيميائية.

الجدول 1. وسط النمو وفقًا لـ Kim et al.32

مكوّن(ملجم/لتر) / (مل/لتر)   
هيدريد الصوديوم2أمر شراء4•H2أو2,690.00
Na2التحسين المفرط للمعلمات (HPO)44,330.00
NH4كلور310.00
KCl130.00
أسيتات الصوديوم820.00
محلول معدني12.50
محلول فيتامين12.50
الجدول 2. مكونات محلول المعادن والفيتامينات33.
محلول العناصر الزهيدةأيون:محلول الفيتامين:
مكونملجم/لتر   المكونملجم/لتر   
حمض النيتريلوأسيتيك1,500.0بيوتين2.0
كبريتات المغنيسيوم4•7 ساعات2أو         3,000.0حمض الفوليك2.0
MnSO₄4•2 ساعة2أو         500.0هيدروكلوريد البيريدوكسين10.0
NaCl  1,000.0هيدروكلوريد الثيامين5.0
FeSO₄4•7 ساعات2O          100.0ريبوفلافين5.0
CoSO4 أو CoCl22     100.0حمض النيكوتينيك5.0
CaCl₂2•2 ساعة2أو            100.0دي إل-بانتوثونات الكالسيوم5.0
كبريتات الخارصين4   130.0فيتامين B120.1
CuSO₄4•H2O10.0حمض ب-أمينوبنزويك5.0
AlK(SO4)4)2               10.0حمض الليبويك5.0
هـ3BO3 10.0
صوديوم2MoO4•ساعتان2أو     10.0
ملاحظة: أذب حمض النيتريلوأسيتيك باستخدام هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) حتى يصل الرقم الهيدروجيني (pH) إلى 6.5، ثم ابدأ بإضافة المعادن.


مخطط للمصطلحات الكهروميكانيكية الحيوية؛ يتضمن المعادلات والصيغ في الكيمياء الكهربائية.
دليل إعدادات معاملات الفولتامتري الحلقي واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، مع التركيز على نافذة الجهد وتعديلات معدل المسح لإجراء تجارب CV مثالية.

مخطط لنقل الإلكترونات الميكروبي؛ مسارات MET وDET وMIET وDIET؛ تحليل نقل الإلكترونات.
الشكل 1. مخطط لآليات نقل الإلكترونات خارج الخلية الميكروبية المحتملة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

عملية أخذ عينات المياه؛ جامع عينات دلو يجمع عينات من تدفق معالجة مياه الصرف الصحي.
الشكل 2. أخذ العينات في محطة معالجة مياه الصرف الصحي بعد المجمّع الشبكي (محطة معالجة مياه الصرف الصحي في ألمانيا). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مخطط وصورة لخلية كهروكيميائية مع جهاز بوتنشيوستات، وإعداد الأقطاب الكهربائية؛ مع توضيح CE و RE و WE.
الشكل 3. إعداد ثلاثي الأقطاب. (A) مخطط، (B) مفاعل حقيقي؛ CE = القطب المقابل، RE = القطب المرجعي، WE = القطب العامل مع غشاء حيوي ميكروبي نشط كهربائياً، SP = منفذ أخذ العينات. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني كهركيميائي؛ تحليل CV؛ التيار مقابل الزمن؛ منهج الحالة المستقرة؛ البيانات بالميكروأمبير والساعات.
الشكل 4. مخطط لنمو الغشاء الحيوي القائم على لقاح مياه صرف صحي بنظام التغذية المتقطعة باستخدام قياس الأمبير الزمني. يصل تيار الأكسدة إلى حالة مستقرة بعد ثلاث دورات من تغيير الوسط. يتم توضيح طور السكون ونقاط الزمن الخاصة بتغيير الوسط وإجراء قياس الفولتية الحلقي (CV) التحويلي وغير التحويلي لظروف الغشاء الحيوي في الحالة المستقرة (البيانات الخام من Liu14). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

التحليل الكهروكيميائي، مخطط E-t، الفولتاميتري الحلقية، الجهد مقابل الزمن، الكيمياء التحليلية.
الشكل 5. مبدأ مسار الجهد-الزمن خلال دورة واحدة من الفولتاميتري الحلقية. تبدأ الفولتاميتري الحلقية (CV) عند الجهد الأولي Ei. ثم يتغير الجهد المطبق خطياً مع الزمن بمعدل مسح v. وعند جهد ذروة مختار E1، يعود الجهد إلى جهد النهاية E2، وحيث أن E2 = Ei. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني للتحليل الكهركيميائي يوضح كثافة التيار j مقابل الزمن t، مع تبيان ذروة jmax.
الشكل 6. مخطط كرونوامبيرومتري نموذجي لدورة نمو واحدة لغشاء حيوي مستخلص من مياه الصرف الصحي؛ حيث تم تحديد أقصى كثافة تيار jmax، والشحنة الكهربائية المتدفقة (العملية) Qp، وأخذ عينة من تركيز الركيزة الأولي c0 وتركيز الركيزة بعد دورة نمو واحدة c1 . انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني للتحليل الكهركيميائي؛ مخططات الفولتاميتري الحلقية التي توضح نتائج التيار مقابل الجهد.
الشكل 7. مخططات الفولتاميتري الحلقية غير التحويلية لغشاء حيوي من G. sulfurreducens. معدل المسح: (A) 50 mV/sec، (B) 1 mV/sec 23؛ (C) جزء مكبر من B، يوضح كثافة تيار الذروة (jpA) وجهد الذروة المقابل (EpA) للمصعد عند القيم القصوى. وبالمثل عند القيم الدنيا، تظهر كثافة تيار الذروة (jpC) وجهد الذروة المقابل (EpC) للمهبط. ينتج الجهد الشكلي Ef وفصل الذروة ΔEp من المعادلة 4 و المعادلة 5 على التوالي (للتفاصيل انظر النص أدناه). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

تحليل كهروكيميائي؛ رسم بياني للفولتاميتري؛ التيار مقابل الجهد؛ اكتشاف القمة؛ تحليل البيانات.
شكل 8. (A) فولتاميتري حلقي لدوران مادة في غشاء حيوي من G. sulfurreducens مستهلك للمواد الغذائية. كان معدل المسح 5 mV/sec. (B) المشتقات الأولى لمنحنى الفولتاميتري23. يشار إلى الجهود الرسمية لمواقع EET الفعلية: Ef,2 و Ef,3. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

رسم بياني للفولتاميتري الحلقية؛ التيار مقابل الجهد؛ تحليل كهروكيميائي؛ نتائج البيانات.
الشكل 9. (أ) مخطط الفولتاميتري الحلقية لمعدل الدوران و(ب) المشتقات الأولى لغشاء حيوي أكثر سمكاً من G. sulfurreducens يقوم بعملية التمثيل الغذائي. كان معدل المسح 5 mV/sec (قارن الشكل 8). انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المناقشة

يوضح البروتوكول المقدم طريقة سهلة ومباشرة لزراعة الأغشية الحيوية الميكروبية النشطة كهربائيا من تلقيح مياه الصرف الصحي باستخدام إعداد ثلاثي الأقطاب الكهربائية في مفاعل دفعة التغذية. يتيح قياس الكرونوأمبيرومتر نمو واختيار الأغشية الحيوية الميكروبية النشطة كهربائيا من لقاحات متنوعة بالإضافة إلى التوصيف الأساسي للأغشية الحيوية من حيث كثافة التيار القصوى وكفاءة الكولومب. يسمح قياس الفولتمترية الدوري ، كونه تقنية غير جراحية ، بإجراء دراسات أساسية حول الديناميكا الحرارية EET للأغشية الحيوية الميكروبية وبالتالي تحديد مواقع نقل EET المحتملة والفعلية. تسمح هذه المعلمات معا ب 1) توصيف ومقارنة الأغشية الحيوية الميكروبية المختلفة لظروف متطابقة وكذلك ب) دراسة تأثير الظروف التشغيلية المختلفة على الأغشية الحيوية الميكروبية النشطة كهربائيا المتطابقة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه التجارب مجرد نقطة انطلاق. من ناحية ، يتطلب المجال متعدد الأوجه للكيمياء الكهربائية الحيوية الميكروبية مزيدا من الاستغلال المتعمق للطرق والبروتوكولات الكهروكيميائية. وهذا يشمل ، على سبيل المثال ، نماذج لاستخراج البيانات الحركية والميكانيكية بالإضافة إلى طرق أخرى مثل التحليل الطيفي للمقاومة الكهروكيميائية34،35. من ناحية أخرى ، لا يمكن للطرق الكهروكيميائية أن توفر أي معلومات عن الطبيعة الجزيئية ، والتركيب الميكروبي ، والتنظيم الميكروبي المكاني ، وما إلى ذلك. هنا هناك حاجة إلى مزيد من التقنيات ، كونها إما غير جراحية ومقترنة بالكيمياء الكهربائية أو الغازية4. يوفر الإطار 2 مناقشة قصيرة حول الخطوات الحاسمة عند إجراء التجارب وكذلك حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولي.

من المنظور الهندسي ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن أنود الأغشية الحيوية الكهربائي هو مكون واحد فقط من الأنظمة الكهروكيميائية الحيوية الميكروبية الحالية ويجب تحليل العديد من العوامل الأخرى للأنظمة الكاملة36. ومع ذلك ، نأمل أن تساعد مقالة الفيديو هذه في فهم وتكييف العناصر الأساسية ل BES ، أي الأقطاب الكهربائية الميكروبية ، في المستقبل.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

F.H. يقر بالدعم المقدم من BMBF (جائزة البحث "عمليات التكنولوجيا الحيوية من الجيل القادم - التكنولوجيا الحيوية 2020+") وجمعية هيلمهولتز (مجموعة الباحثين الشباب).

المواد

محطة ،
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
معالجةمياه الصرف الصحي الأوليةمأخوذة بعد الترشيح الميكانيكي
250 مل قوارير مستديرة القاع مع ثلاثة مداخل إضافيةTh.Geyer Berlin GmbH ، ألمانيا9.011 845تم إرفاق مداخل إضافية بواسطة القطب المرجعي للمنفاخ الزجاجي
Ag / AgCl الداخلي (Sat. KCl ، 0.195 V مقابل SHE) مع غشاء سيراميكSensortechnik Meinsberg ، ألمانياSE 11
قضبان الجرافيت (Ø ؛ = 1 سم ، L = 3 و 5 سم)CP-Handels-GmbH ، Wachtberg ، ألمانياتستخدم كمادة كهربائية
من الفولاذ المقاوم للصدأ ، رقم 1.4301 ، سلك Fe / Cr18 / Ni10Goodfellow GmbH ، باد نوهايم ، ألمانيا155-923-05
سدادات السيليكونTh.Geyer Berlin GmbH ، ألمانيا9.230 512 و
ParafilmneoLab ، هايدلبرغ ، ألمانيا3-1011للختم للحفاظ على الظروف اللاهوائية
نموذج Potentiostat / Galvanostat MPG2BioLogic Science Instruments ، فرنسا
EC-LabBioLogic Science Instruments ، فرنسابرنامج لإجراء قياسات الكيمياء الكهربائية
Origin 8.6برنامج تحليل البياناتOriginLab

المراجع

  1. Rabaey, K., Angenent, L., Schröder, U., Keller, J. Integrated Environmental Technology Series. Lens, P. , IWA Publishing. London, New York. (2010).
  2. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals using microbial electrochemical technologies. Science. 337, 686-690 (2012).
  3. Rabaey, K., Rozendal, R. A. Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production. Nat. Rev. Microbiol. 8, 706-716 (2010).
  4. Harnisch, F., Rabaey, K. The Diversity of Techniques to Study Electrochemically Active Biofilms Highlights the Need for Standardization. ChemSusChem. 5, 1027-1038 (2012).
  5. Logan, B. E., et al. Microbial Fuel Cells: Methodology and Technology. Environ. Sci. Technol. 40, 5181-5192 (2006).
  6. Harnisch, F., Schröder, U. From MFC to MXC: chemical and biological cathodes and their potential for microbial bioelectrochemical systems. Chem. Soc. Rev. 39, 4433-4448 (2010).
  7. TerAvest, M. A., Li, Z., Angenent, L. T. Bacteria-based biocomputing with Cellular Computing Circuits to sense, decide, signal, and act. Energy Environ Sci. 4, 4907-4916 (2011).
  8. Lovley, D. R. Bug juice: harvesting electricity with microorganisms. Nat. Rev. Microbiol. 4, 12 (2006).
  9. Lovley, D. R. Reach out and touch someone: potential impact of DIET (direct interspecies energy transfer) on anaerobic biogeochemistry, bioremediation, and bioenergy. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 10, 101-105 (2011).
  10. Rosenbaum, M., Aulenta, F., Villano, M., Angenent, L. T. Cathodes as electron donors for microbial metabolism: Which extracellular electron transfer mechanisms are involved. Bioresource Technol. 102, 324-333 (2011).
  11. Schröder, U. Anodic electron transfer mechanisms in microbial fuel cells and their energy efficiency. Phys. Chem. Chem. Phys. 9, 2619-2629 (2007).
  12. Harnisch, F., et al. Revealing the electrochemically driven selection in natural community derived microbial biofilms using flow-cytometry. Energy Environ. Sci. 4, 1265 (2011).
  13. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  14. Liu, Y., Harnisch, F., Fricke, K., Sietmann, R., Schröder, U. Improvement of the anodic bioelectrocatalytic activity of mixed culture biofilms by a simple consecutive electrochemical selection procedure. Biosens. Bioelectron. 24, 1006-1011 (2008).
  15. Torres, C. sI., et al. Selecting Anode-Respiring Bacteria Based on Anode Potential Phylogenetic, Electrochemical, and Microscopic Characterization. Environ. Sci. Technol. 43, 9519-9524 (2009).
  16. Virdis, B., Harnisch, F., Batstone, D. J., Rabaey, K., Donose, B. C. Non-invasive characterization of electrochemically active microbial biofilms using confocal Raman microscopy. Energy Environ. Sci. 5, 7017-7024 (2012).
  17. Scholz, F., Bond, A. M. Electroanalytical Methods: Guide to experiments and applications. 2, edn,(2010).
  18. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  19. Harnisch, F., Freguia, S. A Basic Tutorial on Cyclic Voltammetry for the Investigation of Electroactive Microbial Biofilms. Chemistry. 7, 466-475 (2012).
  20. Marsili, E., et al. Shewanella secretes flavins that mediate extracellular electron transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3968-3973 (2008).
  21. Bard, A. J., Inzelt, G., Scholz, F. Electrochemical Dictionary. , Springer. (2008).
  22. Kim, B. H., et al. Electrochemical activity of an Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens IR-1, in the presence of alternative electron acceptors. Biotechnol. Tech. 13, 475-478 (1999).
  23. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energy Environ. Sci. 1, 144 (2008).
  24. Marsili, E., Sun, J., Bond, D. R. Voltammetry and Growth Physiology of Geobacter sulfurreducens Biofilms as a Function of Growth Stage and Imposed Electrode Potential. Electroanalysis. 22, 865-874 (2010).
  25. Busalmen, J. P., Esteve-Núñez, A., Berná, A., Feliu, J. M. C-Type Cytochromes Wire Electricity-Producing Bacteria to Electrodes. Angew. Chem. 120, 4952-4955 (2008).
  26. Millo, D., et al. In Situ Spectroelectrochemical Investigation of Electrocatalytic Microbial Biofilms by Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 50, 2625-2627 (2011).
  27. Hamelers, H. V., et al. New applications and performance of bioelectrochemical systems. Applied Microbiol. Biotechnol. 85, 1673-1685 (2010).
  28. Richter, H., et al. Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer. Energy Environ. Sci.. 2, 506 (2009).
  29. Torres, C. I., Kato Marcus, A., Rittmann, B. E. Proton transport inside the biofilm limits electrical current generation by anode-respiring bacteria. Biotechnol. Bioeng. 100, 872-881 (2008).
  30. Torres, C. I., et al. A kinetic perspective on extracellular electron transfer by anode-respiring bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 34, 3-17 (2010).
  31. Patil, S. A., Harnisch, F., Kapadnis, B., Schröder, U. Electroactive mixed culture biofilms in microbial bioelectrochemical systems: The role of temperature for biofilm formation and performance. Biosens. Bioelectron. 26, 803-808 (2010).
  32. Kim, J. R., Min, B., Logan, B. E. Evaluation of procedures to acclimate a microbial fuel cell for electricity production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 23-30 (2005).
  33. Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43, 260-296 (1979).
  34. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ. Sci. 2, 215-219 (2009).
  35. Ter Heijne, A., et al. Identifying charge and mass transfer resistances of an oxygen reducing biocathode. Energy Environ. Sci. 4, 5035-5043 (2011).
  36. Logan, B. Scaling up microbial fuel cells and other bioelectrochemical systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85, 1665-1671 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة