فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

BTV هو النموذج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي للفيروس في جنس الفيروسة الوقبية، والأسرة Reoviridae. BTV هي واحدة من أهم الأمراض من الماشية المحلية، بما في ذلك الأغنام والماعز والأبقار والحيوانات الأليفة الأخرى، مع 3000000000 $ / سنوات الضياع في جميع أنحاء العالم ^1،2. وBTV المصلي الغريبة هو الممرض الحيوانية الهامة المدرجة في "وزارة الزراعة الأميركية العليا العواقب الثروة الحيوانية مسببات الأمراض." في الآونة الأخيرة، وإعادة الظهور BTV وقد تسبب انتشار واسع للمرض في الماشية والأغنام في العديد من البلدان في جميع أنحاء شمال أوروبا ^3،4. نتيجة للأهمية الاقتصادية وكنظام نموذج، كان BTV موضوع الدراسات الجزيئية والجينية وهيكلية واسعة النطاق كما تم تطوير العديد من اللقاحات. ولكن نظرا لعدم وجود فحوصات المناسبة لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات، لا توجد الأدوية المضادة للفيروسات المتاحة ضد BTV.

في الآونة الأخيرة إنتاجية عالية الفرز (HTS) الحملة باستخدام BTV كما في النظام النموذجي، ونحن دeveloped، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها مقايسة على أساس CPE لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف محتملة ضد arboviruses ^5. مقايسة على أساس CPE هو فحص معترف بها التي استخدمت في اكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد عدد من الفيروسات التي يسببها السريع ويمكن ملاحظتها CPE / موت الخلايا المبرمج ^5-7. في نظامنا، بعد الإصابة BTV، CPE هو واضح في خلايا الفقاريات، بما في ذلك هيلا، BSR، وكلوة الجنين البشري 293T ^8. ويمكن رصد CPE BTV التي يسببها وكميا باستخدام مختلف أساليب الكشف عن خلية الجدوى، بما في ذلك CellTiter جلو عدة بقاء الخلية كاشف (CTG عدة) ^9. يحدد هذه المجموعة عدد من خلايا قابلة للحياة في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة، وهو ما يشير إلى وجود الخلايا الحية عملية الأيض نشطة. في ظل الظروف الأمثل، القائم على الفحص CPE المقدمة هنا أظهر جدواه مع "مزيج وقياس" البروتوكول خطوة واحدة، والمرونة مع إشارات الانارة مستقرة. وفي الوقت نفسه، المركبات السامة reduالوراثة بقاء الخلية سيتم استبعاد في هذا الاختبار القائم على CPE. وأظهر الفحص القائم على CPE متانة وموثوقية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات ضد BTV، واستخدمت لفحص NIH المكتبات الجزيئية الصغيرة جزيء مستودع (MLSMR)، الأمر الذي يؤدي إلى تحديد ستة العنقودية رواية المحتملة المضادة للفيروسات مركب الرصاص (ق ) ^5.

عندما تم التعرف على مركب مضاد للفيروسات المحتملة باستخدام مقايسة على أساس CPE، وسوف تحتاج إلى أن تخضع لعشرة تركيز الجرعة والاستجابة فحص لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات والسمسة ^2. فعالية المضادة للفيروسات، ممثلة على النحو تركيز 50٪ المثبطة (IC ₅₀₎ أو التركيز الفعال 50٪ (EC _50)، هو تركيز للدواء الذي يثبط التي يسببها فيروس CPE في منتصف الطريق بين خط الأساس والحد الأقصى. السمسة الأدوية المضادة للفيروسات، أي تركيز السمسة 50٪ (CC _50)، هو تركيزمن المخدرات حمل 50٪ من السمسة بين خط الأساس والحد الأقصى. ويتم احتساب المؤشر انتقائية (SI)، كما تدل 50٪ SI (SI ₅₀₎ من CC _50/50 IC الذي يحدد خصوصية المضادة للفيروسات ضد CPE التي يسببها الفيروس. وIC ₅₀ (أو EC _50)، CC ₅₀ و ₅₀ SI القيم هي تدابير حاسمة لتحديد ما إذا كان مركب مضاد للفيروسات هو قوية وانتقائية لمزيد من التطوير المخدرات.

عندما أظهرت المضادة للفيروسات لا سمية العلني في المختبر، ولكن الفيروس منعت يسببها CPE والفيروسية دورة الحياة الإنتاجية، فمن المهم لتوصيف وزارة الزراعة ² منها. بدأنا هذا التوصيف من خلال تنفيذ قسم فحص لتحديد الخطوات الممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي يتأثر المضادة للفيروسات. عموما، أضيفت مجمع المضادة للفيروسات إلى الخلايا في أوقات مختلفة قبل أو عدوى فيروس آخر. إذا أضيفت مضادات الفيروسات إلى الخلايا المصابة إضافة إلى المستهدف قTEP أثناء الإصابة، فإنه من شأنه أن يؤدي إلى انخفاض النشاط بالمقارنة مع واحد والتي تم إضافتها قبل الخطوة. وبالتالي، دراسة قسم هو أمر حاسم لتحديد مدى فعالية المضادة للفيروسات من مركب، والهدف إمكاناته، إما على دورة الحياة الفيروسية أو آلات المضيفة المشاركة في دورة الحياة الفيروسية.

لجميع المقايسات الثلاثة، تم تحديد بقاء الخلية باستخدام عدة CTG التالية تعليمات الشركة الصانعة ^5. هذا النظام بإخراج الإشارات الكشف التلألؤ الكافية التي يمكن تحليلها باستخدام برامج مختلفة في المنزل. تم التحقق من صحة كل فحص، وأجرى على الأقل في ثلاث نسخ مع ثمانية النسخ المتماثلة. لجميع البيانات التي تم الحصول عليها، تم تحليل ثلاثة معايير، بما في ذلك القيمة المتوسطة (AVE) والانحراف المعياري (STDEV)، وشارك في كفاءة الاختلاف (CV) لتحديد متانة مقايسة. مرة واحدة وقد تم تحديد متانة الفحص، سيتم زيادة تحليل البيانات ورسم باستخدام مختلف الاستاتيكا البيولوجية والجرافيكأدوات ج ^2.

1. الخلايا، والفيروسات والمركبات المضادة للفيروسات

1. الحفاظ على خلايا BSR، وهو مشتق من الطفل الهامستر الكلى (BHK) الخلايا ^10، في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
2. لجميع المقايسات الثلاث، لوحة الخلايا في DMEM مع 1٪ FCS، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، كما الأمثل سابقا ^5. يشار هذه الوسيلة كما مقايسة المتوسطة لجميع المقايسات الثلاثة.
3. احتضان كل الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO ₂ و 80-95٪ الرطوبة.
4. لوحة، وتنقية نشر 10 نوع BTV (BTV-10) كما هو موضح سابقا ^8. تمييع BTV-10 في مقايسة المتوسطة لكل فحوصات معينة.
5. حل جميع مركبات اختبار في DMSO لتشكيل الأوراق المالية مع التركيز على 10 ملي. تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية.
6. تمييع مركبات لتركيزات المطلوب باستخدام مقايسة المتوسطة لالمكلفد المقايسات ^2.

2. الفحص استنادا CPE-باستخدام CTG كيت

1. خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق MicroFlo حدد موزع. كثافة البذر هو 5،000 خلية / جيدا، وحجم البذر هو 20 ميكرولتر لتحليل فعالية المضادة للفيروسات.
2. احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة حتى الحصول على خلايا ملتصقة إلى لوحة بدقة.
3. إضافة مركب مضاد للفيروسات مع تركيز النهائي من 10 ميكرومتر إلى كل بئر. مزجها تماما.
4. تمييع BTV لعيار المطلوب وإضافة 5 ميكرولتر BTV مع تدل وزارة الداخلية إلى كل بئر. للتحكم بشكل جيد، إضافة 5 ميكرولتر من وسائل الاعلام الفحص. احتضان الخلايا المصابة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO ₂ و 80-95٪ الرطوبة.
5. في 72 HPI، ذوبان الجليد وتتوازن CTG العازلة وحكومة تصريف الأعمال الركيزة مجفف بالتجميد إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها. إعادة تشكيل متجانس حل كاشف CTG عن طريق خلط مجفف بالتجميد انزيم / الركيزة وكاشف العازلة وفقا لالتعليمات الشركة الإلكترونية لل.
6. تتوازن لوحات مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
7. إضافة حجم مساو (25 ميكرولتر) من الكواشف CTG إلى كل بئر من قبل موزع. بعد احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وقياس الإشارات التلألؤ باستخدام قارئ متعدد الأوضاع مع الوقت التكامل من 0.1 ثانية.

3. الفحص الجرعة والاستجابة

1. خلايا BSR البذور إلى 384 صفيحة ميكروسكوبية جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع، مع كثافة البذر من 5،000 خلية / جيدا في حجم البذر من 20 ميكرولتر لفحص فعالية المضادة للفيروسات و 25 ميكرولتر من أجل سمية الخلايا الفحص، على التوالي .
2. احتضان الخلايا لمدة 2-3 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO ₂ و 80-95٪ الرطوبة حتى الخلايا هي التي تعلق على لوحة جيدا.
3. فحص عملية في منطقة الربع من لوحة 384 جيدا لكل مركب (أي ما يعادل 96 لوحة جيدا)، كما هو مبين في الجدول رقم 1. تخصيص ثمانية مكررات لكل تركيزفي فحص واحد. تعيين العمود الأول باسم مراقبة إيجابية دون إضافة مركب والفيروسات، والعمود الأخير ^(ال 12)، والسيطرة السلبية بإضافة الفيروس فقط دون المركبات.
4. تمييع المركبات إلى 50 ميكرومتر في مقايسة المتوسطة وإضافة إلى العمود 2 ^{الثانية} في 20 ميكرولتر / جيد للفيروسات فعالية الفحص. مزج مركب خمس مرات باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي إلى تركيز 25 ميكرومتر.
5. باستخدام ماصة 8 قنوات شبه التلقائي، ونقل 20 ميكرولتر خليط 2 في العمود ^الثاني إلى العمود التالي (3 ^ش)، وتخلط جيدا لتشكيل تركيز 12.5 ميكرومتر. كرر هذه العملية عن طريق نقل 20 ميكرولتر من خليط العمود 3 ^{الثالثة} إلى العمود التالي (4 ^عشر) لتشكيل التخفيف شقين آخر مع تركيز 6.25 ميكرومتر. كرر هذا التخفيف المسلسل شقين حتى العمود ^ال 11. نضح وتجاهل 20 ميكرولتر من الخليط في العمود ^ال 11 بعد إضافة وخلط شركاتس اوند.
6. إضافة BTV-10، على أساس من 0.01 وزارة الداخلية، إلى كل بئر من العمود إلى العمود 2 11 مع حجم 5 ميكرولتر / جيد. بعد إضافة الفيروس، ينبغي تركيز مركب النهائي في كل عمود يكون: 20 ميكرومتر في العمود 2، 10 ميكرومتر في العمود 3، واستمر مع التخفيف من شقين وصولا الى العمود 11 مع تركيز النهائي من 0.04 ميكرومتر.
7. إضافة 5 ميكرولتر من المتوسطة إلى العمود 1 كما خلية التحكم فقط (إيجابية) و 5 ميكرولتر / جيد من BTV إلى العمود 12 كما العدوى BTV التحكم فقط (سلبي).
8. تمييع المركبات إلى التركيز الأولي من 200 ميكرومتر لسمية الخلايا الفحص. وبالمثل، إضافة 25 ميكرولتر / جيد من مركب إلى العمود 2 5x ومختلطة مع 8 قنوات ماصة شبه التلقائي إلى تركيز 100 ميكرومتر. لا تضيف BTV.
9. تنفيذ سلسلة التخفيف من شقين بواسطة الشفط 25 ميكرولتر من العمود إلى العمود 2 3 المجاورة، واستمرت حتى العمود الأخير ^(ال 12). في العمود 12، وبعد الاختلاط، ونضح وتجاهل 25 ميكرولتر من مixture. تركيز النهائي في العمود 2 ينبغي أن تكون 100 ميكرومتر ويجب أن يكون العمود 12 ^عشر عند 0.2 ميكرومتر. العمود 1 هو سيطرة خلية فقط.
10. لكل فعالية وسمية الخلايا المضادة للفيروسات المقايسات، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO ₂ و 80-95٪ الرطوبة لمدة 72 ساعة بعد العلاج. قياس بقاء الخلية باستخدام عدة CTG كما هو موضح أعلاه (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7).

4. الوقت من إضافة (قسم) الفحص

1. خلايا BSR البذور من 1-24 عمود في صفيحة ميكروسكوبية 384 جيدا (أسود، شكل قبل 16 × 24) عن طريق موزع على 5،000 خلية / جيدا وحجم البذر هو 15 ميكرولتر / جيد.
2. لكل مركب، والاستفادة من كافة الأعمدة الأربعة والعشرين مع ثمانية النسخ المتماثلة لكل نقطة في نصف الساعة من لوحة 384 جيدا (الجدول 2). تعيين العمود 1 كخلايا التحكم فقط عن طريق إضافة 10 ميكرولتر / جيد المتوسطة الفحص. العمود علامة 24 كما العدوى BTV التحكم فقط (مراقبة سلبية) وذلك بإضافة 5 ميكروليتر / الفحص جيدا والمتوسطةفيروس د 5 ميكرولتر / جيد في وزارة الداخلية من 0.01 إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد.
3. حدد الأعمدة الزوجية من العمود 2-22 المضادة للفيروسات كما عمود تقييم فعالية في مختلف عدوى آخر ساعة (HPI). في هذه الأعمدة، تصيب الخلايا مع 5 ميكرولتر / جيد BTV في وزارة الداخلية من 0.01. في HPI مختلفة، وأيضا إضافة 5 ميكرولتر / مجمع المخفف جيدا إلى كل بئر لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد. لتدل -2 و -1 HPI إضافة المجمع لخلايا BSR قبل الإصابة BTV. ل0 HPI، إضافة المجمع وBTV للثقافة في وقت واحد.
4. في موازاة ذلك، تعيين الأعمدة الفردية من العمود 3-23 كما مركب تسيطر فقط، منها مجمع أضيفت في مختلف نقاط الوقت كما المعينة (-2، -1، 0، 1، 2، 4، 8، 16، 24، 48 HPI). في هذه الأعمدة، إضافة 5 ميكرولتر المتوسطة / الفحص جيدا و5 ميكرولتر / جيد المخفف مجمع لتشكيل الحجم النهائي من 25 ميكرولتر / جيد.
5. بعد العلاج، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ مع 80-95٪ الرطوبة.
6. تحديد بقاء الخلية في 72 HPI استخدام عدة CellTiter-جلو كما هو موضح سابقا (بروتوكول الخطوات 2،5-2،7).

5. تحليل البيانات

1. معالجة كافة البيانات أولا باستخدام المناسبة البرمجيات في المنزل استنادا إلى إشارات الانارة التي تم الحصول عليها عن طريق قارئ متعدد الأوضاع. تحديد القيمة المتوسطة (متوسط) والانحراف المعياري (STDEV) لكل معاملة، فضلا عن الاختلافات معامل (CV)، الأمر الذي يتطلب قيمة لا يزيد عن 10٪.
2. نقل البيانات التي تتم معالجتها من البرنامج أعلاه إلى أداة البرمجيات biostatic والرسوم البيانية. تنفيذ تحليل الانحدار غير الخطية لتحديد قيم EC ₅₀ CC _و50.

1. فعالية المضادة للفيروسات من مجمع

تم تطوير CPE فحص خلية مقرها، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها في المختبر باستخدام القائمة على الانارة CTG عدة لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV كما هو موضح سابقا 2،5. كان يعمل الاستجابة فحص جرعة عشرة لتعكس فعالية المضادة للفيروسات والسمسة من مركب الرصاص حددت من خلال قياس عدد خلايا قابلة للحياة عملية الأيض في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقدمة في الخلايا الحية 5،11. في تقريرنا السابق، تم تقييم عدد من المركبات المضادة للفيروسات المحتملة، بما في ذلك مركبات من كل مجموعة تحديد عبر HTS ضد BTV 5، ومشتقاتها عن طريق دي نوفو توليف 2. استنادا EC الخاصة 50، 50 CC وSI 50، تم تحديد العديد من مركبات الرصاص واعدة مع فعالية المضادة للفيروسات قويا، سمية منخفضة والانتقائية العالية. على سبيل المثال، compound052 (C052)تقرر أن يكون لها EC 50 0.27 ± 0.12 ميكرومتر (الشكل 1) 2 وCC 50 من 82.69 ميكرومتر، على حد سواء تظهر منحنيات تنازلية نموذجية تحت الانحدار غير الخطية تحليل 2. وSI 50 من C052 تم تحديده في 306 استنادا EC 50 CC 50 وقيمها. وأشار فعالية على نطاق وnanomolar المضادة للفيروسات، سمية منخفضة، وبالتالي ارتفاع SI 50 C052 التي قد تكون مضادة للفيروسات قوية وانتقائية ضد BTV.

2. وزارة الزراعة المحتملة لمجمع المضادة للفيروسات

ويهدف الفحص إلى قسم تحديد مرحلة ممكنة (ق) من دورة الحياة الفيروسية التي استهدفتها المركبات. عند إضافة C052 في 1 أو 2 ساعة قبل العدوى BTV، أي -1 و -2 HPI، ظلت كفاءات المضادة للفيروسات على المستوى nanomolar (الشكل 2) 2، مشيرا إلى أن C052 قد تتصرف خارج مرحلة مبكرة من دورة الحياة الفيروسية، مثل دخول الفيروس. ابعد من ذلكrmore، ظلت فعالية المضادة للفيروسات دون تغيير حتى أضاف C052 إلى الخلايا المصابة في وقت لاحق إلى 24 HPI. عندما تضاف في 32 HPI، انخفضت النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة في الخلايا المعالجة C052، مشيرا إلى أن C052 كان أقل واقية في هذه المرحلة من دورة الحياة الفيروسية. عندما تضاف في 48 HPI، لم يكن هناك حماية للخلايا BSR من CPE BTV التي يسببها. منذ الدورة الأولى من تكاثر الفيروس BTV الانتهاء عادة في الخلايا المصابة خلال 24 HPI، اقترح نتائجنا أن C052 قد تتصرف في المراحل المتأخرة من BTV الفيروسية دورة الحياة، مثل تكاثر الفيروس، والتغليف، والنضج والخروج. وفي الوقت نفسه، فمن الممكن أيضا أن C052 قد تعمل على المضيف الأجهزة الخلوية التي شاركت في أواخر الفيروسية دورة الحياة 2.

الجدول 1. وكانت فعالية المضادة للفيروسات من C052 تخطيط لوحة لفحص الاستجابة للجرعة تقييم د في نطاق 96 جيدا داخل لوحة 384 جيدا. تم إجراء كل معاملة، بما في ذلك العدوى BTV بالإضافة إلى تركيزات مختلفة C052، مع ثمانية النسخ المتماثلة. في 72 HPI، تقرر بقاء الخلية باستخدام عدة CTG.

الجدول. 2 تخطيط لوحة للمرة عمرها بالإضافة إلى ذلك (قسم) مقايسة. تم تقييم الاختبار من قسم C052 في لوحة 384 جيدا كما هو مبين في التخطيط. كل معاملة، بما في ذلك العدوى BTV بالإضافة إلى وقت مضيفا C052، أجريت مع ثمانية النسخ المتماثلة. وHPI -2 -1 وتشير إلى أن C052 تم إضافتها إلى خلايا قبل الإصابة BTV. في 0 HPI، أضيفت BTV وC052 في وقت واحد. في 72 HPI، تقرر بقاء الخلية باستخدام عدة CTG. اضغط هنا لمشاهدة الجدول .

ithin صفحة = "دائما">
الشكل 1. أصيب فعالية المضادة للفيروسات من C052. الخلايا مع BTV في وزارة الداخلية من 0.01 في وجود تركيزات مختلفة من عشرة C052، كما هو مبين في الشكل. تقرر بقاء الخلية في 72 HPI، وذلك باستخدام عدة CTG. تمثل كل نقطة بيانات الوسائل وSD من خمس مكررات. تم تعديل هذا الرقم من قو وآخرون. 2012 2.

الشكل 2. تم إضافة فحص وقت من إضافة لC052. C052 عند 2.5 ملي و 0.27 ملم، على التوالي، إلى الخلايا المصابة في BTV HPI مختلفة كما هو مبين، وحماية ضد C052 CPE BTV التي يسببها، أو بقاء الخلية، تم قياسها باستخدام CTG مجموعة في 72 HPI كل نقاط البيانات يمثل قيمة المتوسطق و SD من ثمانية مكررات مستقلة. تم تعديل هذا الرقم من قو وآخرون 2012 2.

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.