وقد وضعت ثلاثة فحوصات، بما في ذلك تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) القائم على الفحص، فحص الجرعة والاستجابة والوقت من بين الجمع (قسم) مقايسة، إلى أقصى حد، والتحقق من صحة استخدامها لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق رواية (BTV)، فضلا لتحديد آلية ممكنة من بين العمل (وزارة الزراعة) لمضادات الفيروسات التي تم تشخيصها حديثا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات محتملة ضد BTV، وضعنا، والتحقق من صحتها ثلاثة الأمثل المقايسات المقدمة هنا. وكان الفحص القائم على CPE الفحص الأولى وضعت لتقييم ما إذا كان مركب أظهر أي فعالية المضادة للفيروسات والتي استخدمت لفحص مكتبة مجمع كبير. وفي الوقت نفسه، ويمكن أيضا أن يتم تقييم السمسة من الأدوية المضادة للفيروسات باستخدام مقايسة على أساس CPE. وقد تم تصميم مقايسة بين الجرعة والاستجابة لتحديد نطاق فعالية للفيروسات المحدد، أي 50٪ تركيز المثبطة (IC 50) أو التركيز الفعال (EC 50)، فضلا عن مجموعة من السمية الخلوية (CC 50). كان يعمل مقايسة قسم لدراسة وزارة الزراعة الأولية لتحديد الآلية الأساسية من الأدوية المضادة للفيروسات الرواية خلال دورة حياة BTV الفيروسية أو تأثير ممكن على المضيف الآلات الخلوية. هذه المقايسات الحيوية لتقييم فعالية المضادة للفيروسات في نظام الثقافة الخلية، واستخدمت لأبحاثنا الأخيرة تؤديجي إلى تحديد عدد من الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV.
المقدمة
BTV هو النموذج المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي للفيروس في جنس الفيروسة الوقبية، والأسرة Reoviridae. BTV هي واحدة من أهم الأمراض من الماشية المحلية، بما في ذلك الأغنام والماعز والأبقار والحيوانات الأليفة الأخرى، مع 3000000000 $ / سنوات الضياع في جميع أنحاء العالم 1،2. وBTV المصلي الغريبة هو الممرض الحيوانية الهامة المدرجة في "وزارة الزراعة الأميركية العليا العواقب الثروة الحيوانية مسببات الأمراض." في الآونة الأخيرة، وإعادة الظهور BTV وقد تسبب انتشار واسع للمرض في الماشية والأغنام في العديد من البلدان في جميع أنحاء شمال أوروبا 3،4. نتيجة للأهمية الاقتصادية وكنظام نموذج، كان BTV ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الخلايا، والفيروسات والمركبات المضادة للفيروسات
- الحفاظ على خلايا BSR، وهو مشتق من الطفل الهامستر الكلى (BHK) الخلايا 10، في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) تحتوي على 5٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين.
- لجميع المقايسات الثلاث، لوحة الخلايا في DMEM مع 1٪ FCS، 100U/ml البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، كما الأمثل سابقا 5. يشار هذه الوسيلة كما مقايسة المتوسطة لجميع المقايسات الثلاثة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
1. فعالية المضادة للفيروسات من مجمع
تم تطوير CPE فحص خلية مقرها، إلى أقصى حد والتحقق من صحتها في المختبر باستخدام القائمة على الانارة CTG عدة لتحديد الأدوية المضادة للفيروسات رواية ضد BTV كما هو موضح سابقا 2،5. كان يعمل الاستجابة فحص جرعة عشرة لتعكس فعالية المضادة للفيروسات والسمسة من مركب الرصاص حددت من خلال قياس عدد خلايا قابلة للحياة عملية الأيض في الثقافة على أساس الكميات من ATP الخلوية المقد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لتحديد الأولي من الزيارات المضادة للفيروسات، واحدة من الخطوات الرئيسية لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات والتنمية هو وضع المقايسات قوية، والذي يتضمن اختيار علامة للقياس الكمي، ووضع بروتوكول بسيطة، والحصول على إشارات كافية وأقل من 10٪ السيرة الذاتية. وقد صممت معظم شاشات البيوكيميائية أو خلية مقرها لتوفير نقطة انطلاق الكيميائية على أساس أقوى وبسيطة وغير مكلفة الفحص، ويرجع ذلك إلى استنساخ المطلوبة في عملية الفرز وعدد كبير محتمل من الجزيئات ليتم عرضه. عين مقايسة على أساس CPE لتلبية هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
شكر وتقدير
وأيد هذا المشروع من خلال منحة 1R03MH08127-01-02 و7R03MH08127 من المعاهد الوطنية للصحة لQ. لي، والأموال IMPACT من قسم الطب في البنك العربي المتحد إلى Q. لى. هو محل تقدير الدعم من صندوق Molette وجامعة أوبورن. نحن نشكر أيضا المساعدات الفنية من السيدة Pulin تشي والسيد فولوديمير Musiienko أثناء العمل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM 1134218 | جيبكو | لزراعة الخلايا | |
| FBS | Gibco | 16000044 | لزراعة الخلايا |
| 0.05٪ Trypsin-EDTA | Gibco | 1000185 | لزراعة الخلايا |
| DPBS | Gbico | 1049769 | لزراعة الخلايا |
| مجموعة CellTiter-Glo (CTG) | Promega | TB288 | لقياس بقاء الخلية |
| 70٪ الإيثانول | فيشر | S25309B | مخفف من 95٪ |
| مركبات huashilcompounds المضادة للفيروسات | NIH MLSMR و de novo تخليق | ||
| BTV-10 | ATCC | VR-187 | |
| BSR | تم تطويره في المنزل | ||
| قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع Synergy-II | BioTek | لقراءة إشارة الإنارة | |
| موزع | اختيار MicroFloBioTek | إضافة الخلايا والفيروسات والكواشف | |
| 384 بئر صفيحة دقيقة مسطحة | القاع CORNING | 28908031 | لزراعة الخلايا |
| برنامج Gen. 5 | BioTek | لتحليل مخرجات القراءة من قارئ الألواح الدقيقة متعدد الأوضاع Synergy-II | |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad الإصدار 5 | للتحليل الحيوي والمؤامرة |
المراجع
- Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
- Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341(2012).
- Meiswinkel, R., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
