نيوكاسل فيروس المرض (NDV) وقد درس على نطاق واسع في السنوات القليلة الماضية من أجل تطوير ناقلات جديدة للتطعيم والعلاج وغيرها. وكانت هذه الدراسات ممكن نظرا لتقنيات لانقاذ الفيروس المؤتلف من [كدنا]، مثل تلك التي وصفنا هنا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، عضو النموذج الأولي للجنس Avulavirus من عائلة الفيروسات المخاطانية 1، هو غير مجزأة، السلبية، بمعنى، واحد الذين تقطعت بهم السبل، ويلفها فيروس الحمض النووي الريبي (الشكل 1) مع التطبيقات المحتملة كناقل للتطعيم و علاج الأمراض التي تصيب الإنسان. أصبح في عمق استكشاف هذه التطبيقات ممكنا إلا بعد إنشاء الوراثة تقنيات العكسي لانقاذ الفيروسات المؤتلف من البلازميدات ترميز الجينوم الخاصة بهم على أكمل وجه [كدنا] 2-5. [كدنا] الفيروسية يمكن تعديلها بسهولة في المختبر باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية لتغيير التركيب الوراثي للفيروس و / أو لتشمل وحدات جديدة النسخي. إنقاذ مثل هذه الفيروسات المعدلة وراثيا يوفر أداة قيمة لفهم العوامل التي تؤثر على مراحل متعددة من العدوى، وكذلك يسمح لتطوير وتحسين ناقلات للتعبير وإيصال المستضداتللتطعيم والعلاج. نحن هنا وصف بروتوكول لإنقاذ NDVs المؤتلف.
المقدمة
نيوكاسل فيروس المرض (NDV)، والفيروسة المخاطانية الطيور تنتمي إلى جنس Avulavirus 1، هو وكيل الحيوانية ذات الصلة من الناحية الاقتصادية، وبالتالي بحثها على نطاق واسع وsurveilled، والتي يمكن أن تؤثر بشدة على تربية الدواجن في جميع أنحاء العالم. وإن لم يكن العامل الممرض الإنسان، NDV كما تم دراسة وافية وراء المجال البيطري على حد سواء باعتبارها نموذجا الفيروسة المخاطانية ونظرا لاهتمام للغاية، والخصائص الطبيعية حال الورم 6. البحث عن NDV استفادت كثيرا من تطوير تقنيات الوراثة العكسية لاحد الذين تقطعت بهم السبل، غير مجزأة فيروسات RNA-بالمعنى السلبي، وصف لأول مرة لفيروس داء الكلب من قبل Conzelmann وcoleagues <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد خلايا الثدييات (الشكل 4A، يوم 1)
تقسيم التهاب الكبد-2 أو A549 الخلايا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن في 6 لوحات جيدة. كثافة الخلايا ينبغي أن تصل إلى 80-90٪ التقاء في اليوم التالي. عادة، يمكن تقسيم متموجة 100 مم طبق في 8 آبار (حوالي 1 × 10 6 خلايا لكل بئر). لكل فيروس لانقاذهم، ينبغي أن تدرج 2-4 آبار مختلفة، فضلا عن 2 آبار اضافية لعناصر pCAGGs-GFP وpCITE-GFP 18، والتي تهدف إلى مراقبة ترنسفكأيشن وMVA-T7 الكفاءة العدوى، على التوالي.
2. إصابة خلايا الثدييات مع ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إنقاذ NDV هو إجراء راسخة، يقوم بشكل روتيني في المختبرات التي يمكنها الوصول إلى كدنا] كاملة من الفيروس. ومع ذلك، فإن الطبيعة العشوائية لا يتجزأ من أسلوب يجعل من الصعب تحقيق الكفاءة الإنقاذ 100٪. رصد خطوات مبكرة من العملية، خصيصا كفاءة ترنسفكأيشن والعدوى مع MVA-T7، ويساعد على تحديد المشاكل المحتملة ويبين الشكل 5A ترنسفكأيشن القياسية والكفاءة ترنسفكأيشن / العدوى التي تكفي لإنقاذ NDV ناجحة. بعد جولات من التضخيم في المشترك الثقافات الطيور والثدييات البيض المحتوي، تم ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
العديد من العوامل التي يتعين النظر فيها لتحقيق نتائج جيدة في حين إنقاذ NDV. أولا، كدنا] بناء كامل طول لاستخدامها يحتاج إلى أن تكون مصممة للسماح إدماج وظيفية من الجينات المحورة الجديدة / التعديلات في جينوم فيروس النيوكاسل. وهذا يعني، كما ذكر أعلاه، أن (ط) نهاية المناسبة الجين (GE)، بين الجينات (IG) وبداية الجين (GS) المتتاليات هي التي يمكن ان تضاف إذا لزم الأمر، (ب) لا توجد GE GS أو متواليات المفترضة في الخارجية الجين، و (iii) الجينوم الكامل المؤتلف يلي "حكم ستة".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أدولفو غارسيا ساستري، هو مخترع براءات الاختراع على المؤتلف فيروسات مرض نيوكاسل التي يملكها مدرسة ايكان الطب في جبل سيناء.
شكر وتقدير
سيكون الكتاب أود أن أشكر أعضاء في الماضي والحاضر في مختبرات الدكاترة. بيتر باليس وأدولفو غارسيا ساستري، لتطوير NDV عكس تقنيات الوراثة والمساعدة التقنية. ويتم تمويل البحوث في نيوكاسل فيروس المرض في AG-S المختبر جزئيا NIAD منح R01AI088770 وعن دائرة مركز الأمن الوطني للعلوم والتكنولوجيا التميز للالناشئة والأمراض الحيوانية المنشأ الحيواني (CEEZAD، الجائزة رقم 2010-ST-061-AG001). ويتم تمويل البحوث في LM-S المختبر من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1 AI077719، R21NS075611-01، R03AI099681-01A1، ومراكز المعدية التميز لأبحاث الأنفلونزا والمراقبة (HHSN266200700008C)، وجامعة روتشستر المركز عن الدفاع البيولوجي المناعي النمذجة (HHSN27220100....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
2< / sub> في DMEM 10٪ FBS ، 1٪ PS.
<قوي>بيض الدجاج المجلمن < / قوي >
يمكن الحصول على بيض الدجاج الجنين من مختبرات نهر تشارلز ، منتجات وخدمات الطيور ذات رسوم مسببات الأمراض المحددة (SPAFAS) (فرانكلين كومنز ، 106 الطريق 32 ، شمال فرانكلين ، CT 06254 ، الولايات المتحدة الأمريكية) ويتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية ، ويتم تقييم صلاحية الأجنة باستخدام شمعة البيض. يصاب البيض عندما يصل عمره إلى 8-10 أيام. تحدث كل من العدوى وحصاد السائل الآلانتوي في ظل ظروف معقمة. يتم تعقيم جميع البيض والتخلص منه وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المختبرية القياسية.
خلايا الدم الحمراء الديك الرومي (RBC) < / strong>
يمكن شراء كرات الدم الحمراء في تركيا من مزارع تروسلو (201 Valley Road ، تشيسترتاون ، ماريلاند 21620 ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. لتحضير كرات الدم الحمراء لمقايسة HA ، اغسل 5 مل من المخزون التجاري ب 45 مل من PBS 1x في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 1,000 دورة في الدقيقة وتخلص بعناية من المادة الطافية. قم بتخفيف كرات الدم الحمراء المحببة 1: 1,000 في PBS 1x للحصول على تركيز نهائي 0.5-1.0٪. يمكن تخزين كرات الدم الحمراء المغسولة عند 4 درجات ؛ C لعدة أيام.
Plasmids< / strong>
يتم الحصول على مستحضرات البلازميد مع أي مجموعة maxiprep المتاحة تجاريا بعد الشركة المصنعة & # 039; تعليمات s ، مخففة في ddH2< / sub>0 إلى تركيز نهائي من 1 & mu ؛ ز /&مو; ل وتخزينها عند -20 درجة مئوية يتم تقييم تركيز الحمض النووي ونقاءه عن طريق قياس الطيف الضوئي عند 260 و 280 نانومتر. تعتبر الاستعدادات التي تحتوي على نسبة 260/280 أعلى من 1.8 ذات جودة مقبولة للإنقاذ. يتم أيضا فحص جودة الحمض النووي البلازميد بشكل روتيني عن طريق كروماتوغرافيا هلام الاغاروز.
Viruses< / strong>
يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف لإنقاذ سلالة NDV Hitchner B1 تحت ظروف مستوى السلامة الحيوية (BSL) 2. تم وصف Vaccinia Ankara المعدل الذي يعبر عن بوليميراز T7 RNA RNA (MVA-T7) 34< / sup> وتم الحصول عليه من الدكتور برنارد موس. هذا الفيروس هو نمو في طبقات أحادية التقاء من الخلايا الليفية لجنين الدجاج ومعايرة في خلايا الثدييات (A549 أو HEp-2). تزرع مخزونات NDV في بيض الدجاج المجنم ويتم معايرتها بواسطة IFA باستخدام مصل متعدد النسيلة مربوع ضد الفيروسات المنقاة. يجب تعقيم جميع المواد الملوثة بأمان والتخلص منها وفقا لإجراءات السلامة الحيوية القياسية.
وسائط وحلول زراعة الأنسجة:
DMEM 10٪ FBS 1٪ PS: Dulbecco' ق تعديل النسر &# 039 ؛ s Medium (DMEM) مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (FBS) والبنسلين / الستربتومايسين (P / S): 445 مل من DMEM ، 50 مل من FBS المعطلة بالحرارة ، 5 مل من محلول P / S التجاري 100x. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): < / قوي> 80 جم من كلوريد الصوديوم ، 2 جم من KCl ، 11.5 جم من Na 2< / sub>HPO4< / sub>.7H2< / sub>O ، 2 غرام من KH2PO4. أضف ddH2O حتى 1 لتر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.3. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
1x PBS: < / قوي> تمييع 10x PBS 1:10 مع ddH2< / sub>O. تعقيم بالأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
100x Ca / Mg: < / قوي> 1.327 جم CaCl 2< / sub>.2H2< / sub>O ، 2.133 جم MgCl2.6H2O وأضف ddH2O حتى 100 مل. الأوتوكلاف وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
1x PBS / BA / PS: < / قوي> 50 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS) في 437 مل ddH 2< / sub>O. الأوتوكلاف وعندما يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، أضف 5 مل 100x البنسلين / الستربتومايسين 3 مل 35٪ بقري و 5 مل من 100x Ca / Mg. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية < / ص>
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | CORNING Cellgro | 10-013-CV | أي مورد |
| OptiMEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 (LPF2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| 35٪ ألبومين بقري (BA) | Sigma | 232-936-2 | أي مورد |
| Trypsin-EDTA | CORNING Cellgro | 25-052-CI | أي مورد |
| البنسلين / الستربتومايسين (PS) 100x | CORNING Cellgro | 30-002-CI | أي مورد |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | أي مورد |
المراجع
- Lamb, R. A., Parks, G. D. Fields Virology. Howley, P. H., Knipe, D. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1689 (2007).
- Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203 (1994).
- Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
![الانقاذ من الفيروسات المؤتلف مرض نيوكاسل من [كدنا]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F50830.jpg&w=3840&q=75)