Method Article

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

DOI:

10.3791/50836

⸱

February 26th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute Oswaldo Cruz, Laboratory of Cellular Communication, Oswaldo Cruz Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقاطعات الفجوة هي قنوات بين الخلايا تسمح بالاتصال بالخلايا المجاورة. يعتمد هذا الاتصال على مساهمة نصف قناة من قبل كل خلية مجاورة لتشكيل تقاطع الفجوة. في خلايا الثدييات ، تتكون القناة النصفية من ستة كونيكسين ، ومونومرات ذات أربعة مجالات عبر الغشاء ومحطة C و N داخل السيتوبلازم. تسمح تقاطعات الفجوة بتبادل الأيونات والرسل الثاني والمستقلبات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، لديهم أدوار مهمة في العديد من أشكال الاتصال الخلوي في العمليات الفسيولوجية مثل الانتقال المشبكي ، وتقلص القلب ، ونمو الخلايا والتمايز. نحن بالتفصيل كيفية إجراء حقن مجهري أحادي الخلية من Lucifer Yellow لتصور الاتصال الخلوي عبر تقاطعات الفجوة في الخلايا الحية. من المتوقع أنه في تقاطعات الفجوة الوظيفية ، ستنتشر الصبغة من الخلية المحملة إلى الخلايا المتصلة. إنها تقنية مفيدة للغاية لدراسة تقاطعات الفجوة حيث يمكنك تقييم انتشار التألق في الوقت الفعلي. نناقش كيفية تحضير الخلايا والماصة الدقيقة ، وكيفية استخدام معالج دقيق وحقن صبغة فلورية منخفضة الوزن الجزيئي في خط الخلايا الظهارية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقاطعات الفجوة هي قنوات intercellular التي تسمح للالتواصل بين الخلايا المجاورة 1. هذا التواصل يربط اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة، حيث يساهم كل واحد مع connexon أو hemichannel لتشكيل قناة intercellular. في خلايا الثدييات، ويتم تشكيل connexon ستة connexins، أحادية مع أربعة مجالات الغشاء وC ومحطة N داخل السيتوبلازم 2. تقاطعات الفجوة لا تسمح فقط تدفق الأيونات، رسل الثانية والأيض صغيرة، ولكن تسهم أيضا في العديد من أشكال الاتصالات الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل انتقال متشابك، تقلص القلب ونمو الخلايا والتمايز 3،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلايا

  1. الحفاظ على الثقافة من خط الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (IT76M1) أو خلية لفحصها في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2).
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X (اكرر هذا البند 3X).
  3. إضافة التربسين إلى الخلايا لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة المتوسطة (مرتين من حجم التربسين المضافة في البند 1.3) مع 10٪ FBS (الجنين المصل البقري) إلى الخلايا مع التربسين وأجهزة الطرد المركزي (800 x ج لمدة 5 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمت الغدة الصعترية خط الخلايا الظهارية IT-76MI لتقييم اقتران صبغ من قبل تقاطعات الفجوة كما وصفت هذه الخلايا للتعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية التي شكلتها connexin 43 21. ويبين الشكل (1) وحقن لوسيفر الأصفر عند تطبيقها في خلية واحدة تحت غيض من ماصة. بعد بضع دقائق، تصبح الخلايا على اتصال الفلورسنت (النجمة) مما يدل على انتشار صبغة الفلورسنت من خلال تقاطعات الفجوة. ويرتبط عدد من الخلايا والوقت لأصبح الفلورسنت مباشرة مع درجة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل التحقق من وجود وظيفية تقاطع الفجوة بين الخلايا، واستخدام استشفاف، وهي غشاء كتيمة، وإن قابلة للاختراق من قبل قنوات بين الخلايا المطلوبة 16. فلوريسئين، أول صبغة الفلورسنت لمراقبة الخلية الى خلية اقتران 22، غير قابلة للاختراق بين الأغشية غير صلي 3 و لذا فقد تم استبداله من قبل إبليس صبغة صفراء 15. في الوقت الراهن، لنجد أن الخيار الأفضل من بين العديد من أنواع مختلفة من استشفاف الفلورس.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكرس المؤلفون هذه الورقة تكريما للبروفيسور جيلبرتو أوليفيرا كاسترو الذي قدم بحثا في الاتصال بين الخلايا عن طريق تقاطعات الفجوة في البرازيل. تم تمويل هذا العمل من قبل Capes و CNPQ و Faperj.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أقراص لوسيفر الأصفرسيجماL0259
كلوريد الليثيومسيجماL4408
PBSسيجما  P4417
RPMISigmaR4130
مصل الجنين البقريCultilab
TrypsinSigmaT4799
طاولة معزولة للاهتزاز   ؛NewportVH3036W-OPTهناك حاجة إلى طاولة معزولة بالاهتزاز لحماية التجارب من الاهتزاز وتجنب تلف الخلايا
MicromanipulatorNarishigeMMO-203يسمح هذا الجهاز بإجراء تعديلات دقيقة للماصة الدقيقة ، وهو أمر ضروري للحقن الدقيق للخلية.
المولد الحالي DigitimerDS2لإنتاج تدفق الصبغة عبر الماصة الدقيقة ، تم إعطاء تيار أقل من نانو أمبير واحد باستخدام مولد تيار مع قطب كهربائي داخل الماصة الدقيقة أو مكبر للصوت يحتوي على دائرة تعويض السعة (مقياس كهربائي قديم) أو وظائف حقن التيار لمضخمات مشبك التصحيح الجديدة ، والسلك الأرضي مغمور في طبق اللوحة. بدلا من ذلك ، يمكن حقن الصبغة بواسطة حاقن دقيق هوائي ، وفقا لتوصيات المصنع.    
أقراص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
  2. Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell MicroinjectionGap Junction AnalysisLucifer Yellow DyeFluorescence MicroscopyMicromanipulator TechniqueCellular Communication StudyEpithelial Cell LineGap Junction FunctionDye Diffusion AssayThymic Epithelial Cells

Related Articles