Method Article

حقن مكروي وحيدة الخلية لتحليل الاتصالات خلية

DOI:

10.3791/50836

⸱

February 26th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute Oswaldo Cruz, Laboratory of Cellular Communication, Oswaldo Cruz Foundation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية، وتقديم بعض النصائح المفيدة. ونحن نتوقع أن هذه الورقة سوف تساعد الجميع لتقييم درجة اقتران الخلوية بسبب تقاطعات الفجوة الوظيفية. كل شيء الموصوفة هنا يمكن أن يكون، من حيث المبدأ، وتكييفها لالأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من 1000 دالتون.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقاطعات الفجوة هي قنوات بين الخلايا تسمح بالاتصال بالخلايا المجاورة. يعتمد هذا الاتصال على مساهمة نصف قناة من قبل كل خلية مجاورة لتشكيل تقاطع الفجوة. في خلايا الثدييات ، تتكون القناة النصفية من ستة كونيكسين ، ومونومرات ذات أربعة مجالات عبر الغشاء ومحطة C و N داخل السيتوبلازم. تسمح تقاطعات الفجوة بتبادل الأيونات والرسل الثاني والمستقلبات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، لديهم أدوار مهمة في العديد من أشكال الاتصال الخلوي في العمليات الفسيولوجية مثل الانتقال المشبكي ، وتقلص القلب ، ونمو الخلايا والتمايز. نحن بالتفصيل كيفية إجراء حقن مجهري أحادي الخلية من Lucifer Yellow لتصور الاتصال الخلوي عبر تقاطعات الفجوة في الخلايا الحية. من المتوقع أنه في تقاطعات الفجوة الوظيفية ، ستنتشر الصبغة من الخلية المحملة إلى الخلايا المتصلة. إنها تقنية مفيدة للغاية لدراسة تقاطعات الفجوة حيث يمكنك تقييم انتشار التألق في الوقت الفعلي. نناقش كيفية تحضير الخلايا والماصة الدقيقة ، وكيفية استخدام معالج دقيق وحقن صبغة فلورية منخفضة الوزن الجزيئي في خط الخلايا الظهارية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقاطعات الفجوة هي قنوات intercellular التي تسمح للالتواصل بين الخلايا المجاورة 1. هذا التواصل يربط اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة، حيث يساهم كل واحد مع connexon أو hemichannel لتشكيل قناة intercellular. في خلايا الثدييات، ويتم تشكيل connexon ستة connexins، أحادية مع أربعة مجالات الغشاء وC ومحطة N داخل السيتوبلازم 2. تقاطعات الفجوة لا تسمح فقط تدفق الأيونات، رسل الثانية والأيض صغيرة، ولكن تسهم أيضا في العديد من أشكال الاتصالات الخلوية في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل انتقال متشابك، تقلص القلب ونمو الخلايا والتمايز 3، 4، 5، 6، 7، 8. وبالإضافة إلى ذلك ارتبطت تقاطعات الفجوة معالعديد من الأمراض بما فيها السرطان 9، 10، 11 ضمور العضلات، وبعض الأمراض الوراثية والمزيل للأمراض (12).

هذا النوع من الحديث المتبادل intercellular يمكن تقييمها من قبل العديد من الطرق 13، 14، 15، 16. في هذه الورقة، وتبين لنا كيفية إجراء حقن مكروي وحيدة الخلية لوسيفر الأصفر لتصور الاتصالات الخلوية عبر الفجوة تقاطعات في الخلايا الحية. نناقش كيفية تحضير الخلايا وmicropipette، واستخدام وmicromanipulator وحقن لوسيفر الصبغة الصفراء في خط الخلايا الظهارية الغدة الصعترية. عادة، يمكن تحليل هذا الإجراء التجريبي من المتوسط ​​من خلايا مرتبطة إلى الخلية محملة صبغ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع الأصباغ الفلورية الأخرى مع الوزن الجزيئي أقل من الفجوةتقاطعات قطع وهو ما يقرب من 1000 دالتون.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الخلايا

  1. الحفاظ على الثقافة من خط الغدة الصعترية الخلايا الظهارية (IT76M1) أو خلية لفحصها في حاضنة (37 ° C / 5٪ CO 2).
  2. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X (اكرر هذا البند 3X).
  3. إضافة التربسين إلى الخلايا لمدة 5 دقائق.
  4. إضافة المتوسطة (مرتين من حجم التربسين المضافة في البند 1.3) مع 10٪ FBS (الجنين المصل البقري) إلى الخلايا مع التربسين وأجهزة الطرد المركزي (800 x ج لمدة 5 دقائق).
  5. عد الخلايا في عدادة الكريات.
  6. ضبط كثافة الخلايا وفقا لنوع من الخلايا كما لديها خلايا لتكون على اتصال وثيق مع بعضها البعض للسماح للاقتران. ملاحظة: في حالتنا، كنا 3 × 10 5 خلايا لكل 35 مم طبق بيتري.

2. إعداد Micropipette

  1. سحب micropipette كما محدد من micropipette الزجاج الشعرية (1.5 مم) إلى 0.2 ميكرومتر النهائي من قطر وذلك لتحقيق مقاومة النهائية من حوالي 30 MΩو "> 17، 18.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن شراؤها ماصات الحقن. المقاومة تعتمد على حجم الخلية، على سبيل المثال مقاومة أعلى مسرى مكروي سيكون ضروريا لخلايا عنيبية البنكرياس، على سبيل المثال (100-150 MΩ) 19. وهناك مشكلة مشتركة التي يمكن أن تحدث هي هطول الأمطار لوسيفر حل الأصفر والتي يمكن بعد عرقلة micropipette وقد تتطلب ترشيح مسبق أو الطرد المركزي. قبل الحقن، وينبغي تحليل micropipette تحت المجهر للكشف عن ما إذا كان هناك انسداد أو أي نوع من التعطيل 13. وmicropipette يمكن اختبار عن طريق حقن LY مع طرف micropipette داخل محلول ملحي.

3. اختبار وMicropipette

  1. إعداد الحل الأصفر لوسيفر (5٪) في 150 مللي مول / لتر LiCI وتحميل micropipette باستخدام حقنة أو عن طريق الردم (وضع فيه LY الحل).
  2. وضع micropipeتتي على مدى 35 مم طبق بيتري مع الخلايا IT76M1 على محطة العمل حقن مكروي وغمر غيض من micropipette الزجاج في المتوسط ​​الخلية. التركيز على micropipette وإجراء اختبار الصبغة التي تتدفق من خلال تطبيق النبض.

4. وحيد الخلية لوسيفر الأصفر حقن مكروي

  1. التركيز المجهر الحق فوق طبقة الخلايا باستخدام عالية الموجبة فاي ماغني (40X)، ثم خفض ببطء ماصة للخلايا باستخدام micromanipulator.
  2. ثقب الخلية المستهدفة عندما غيض قريبة بما فيه الكفاية للمس الغشاء الخلوي، وتطبيق نبض hyperpolarizing صغير لإدخال LY في الخلية. الجهد المطبق سيعتمد على صافي شحنة من صبغ ليتم حقنه. بدلا من ذلك، بعض الأصباغ الأخرى يمكن استخدامها مع هذه التقنية كما هو موضح في الجدول 1.
    ملاحظة: من حيث المبدأ أي صبغة ماء مع ميغاواط أقل مما يمكن أن تستخدم 1KDa. ومع ذلك، يمكن أن يكون سعر التحويل تختلف وفقا لوزن وhydrophilicity. بالإضافة إلى ذلك، شيجب تقييم نقل nspecific من الصبغة المستخدمة.
  3. التقاط الصور خلية 3 دقيقة بعد حقن الصبغة أو صنع فيلم صغير مع مرور الوقت المجهري (30 إطارا في الثانية).
    ملاحظة: يمكن أن ينظر إلى نهج مماثل في هيتومي وآخرون (2015) 20. لتجنب الاتصال عن طريق الجسور والتواصل (الانقسام غير مكتمل)، وشارك في حقن ديكستران rhodamin (2-10 كيلو دالتون)، الذي لا يمر من خلال تقاطعات الفجوة لكن يمر من خلال الجسور والتواصل وأنواع معينة من nanotubules ينصح كما هو مبين في الشكل 2 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدمت الغدة الصعترية خط الخلايا الظهارية IT-76MI لتقييم اقتران صبغ من قبل تقاطعات الفجوة كما وصفت هذه الخلايا للتعبير عن تقاطعات الفجوة الوظيفية التي شكلتها connexin 43 21. ويبين الشكل (1) وحقن لوسيفر الأصفر عند تطبيقها في خلية واحدة تحت غيض من ماصة. بعد بضع دقائق، تصبح الخلايا على اتصال الفلورسنت (النجمة) مما يدل على انتشار صبغة الفلورسنت من خلال تقاطعات الفجوة. ويرتبط عدد من الخلايا والوقت لأصبح الفلورسنت مباشرة مع درجة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل التحقق من وجود وظيفية تقاطع الفجوة بين الخلايا، واستخدام استشفاف، وهي غشاء كتيمة، وإن قابلة للاختراق من قبل قنوات بين الخلايا المطلوبة 16. فلوريسئين، أول صبغة الفلورسنت لمراقبة الخلية الى خلية اقتران 22، غير قابلة للاختراق بين الأغشية غير صلي 3 و لذا فقد تم استبداله من قبل إبليس صبغة صفراء 15. في الوقت الراهن، لنجد أن الخيار الأفضل من بين العديد من أنواع مختلفة من استشفاف الفلورس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكرس المؤلفون هذه الورقة تكريما للبروفيسور جيلبرتو أوليفيرا كاسترو الذي قدم بحثا في الاتصال بين الخلايا عن طريق تقاطعات الفجوة في البرازيل. تم تمويل هذا العمل من قبل Capes و CNPQ و Faperj.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أقراص لوسيفر الأصفرسيجماL0259
كلوريد الليثيومسيجماL4408
PBSسيجما  P4417
RPMISigmaR4130
مصل الجنين البقريCultilab
TrypsinSigmaT4799
طاولة معزولة للاهتزاز   ؛NewportVH3036W-OPTهناك حاجة إلى طاولة معزولة بالاهتزاز لحماية التجارب من الاهتزاز وتجنب تلف الخلايا
MicromanipulatorNarishigeMMO-203يسمح هذا الجهاز بإجراء تعديلات دقيقة للماصة الدقيقة ، وهو أمر ضروري للحقن الدقيق للخلية.
المولد الحالي DigitimerDS2لإنتاج تدفق الصبغة عبر الماصة الدقيقة ، تم إعطاء تيار أقل من نانو أمبير واحد باستخدام مولد تيار مع قطب كهربائي داخل الماصة الدقيقة أو مكبر للصوت يحتوي على دائرة تعويض السعة (مقياس كهربائي قديم) أو وظائف حقن التيار لمضخمات مشبك التصحيح الجديدة ، والسلك الأرضي مغمور في طبق اللوحة. بدلا من ذلك ، يمكن حقن الصبغة بواسطة حاقن دقيق هوائي ، وفقا لتوصيات المصنع.    
أقراص

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
  2. Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
  3. Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
  4. Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
  5. Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
  6. Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
  7. Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
  8. Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3(2010).
  9. Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
  10. El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
  11. Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
  12. Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
  13. Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
  14. Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
  15. Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
  16. Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
  17. Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
  18. Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
  19. Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
  20. Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
  21. Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
  22. Kanno, Y., Loewenstein, W. R. Intercellular Diffusion. Science. 143 (3609), 959-960 (1964).
  23. Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell MicroinjectionGap Junction AnalysisLucifer Yellow DyeFluorescence MicroscopyMicromanipulator TechniqueCellular Communication StudyEpithelial Cell LineGap Junction FunctionDye Diffusion AssayThymic Epithelial Cells

Related Articles