مقالة منهجية

تصور التدفق السيتوبلازمي أثناء التئام الجروح أحادية الخلية في Stentor coeruleus

DOI:

10.3791/50848

⸱

ديسمبر 19, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Physiology Course, Marine Biological Laboratory, 2Department of Biochemistry & Biophysics, University of California San Francisco, 3Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit Amsterdam, 4Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 5Department of Physics, University of Illinois Urbana-Champaign

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدب العملاق Stentor coeruleus هو نظام كلاسيكي لدراسة التجديد والتئام الجروح في الخلايا المفردة. من خلال تصوير خلايا Stentor في وقت واحد بتكبير منخفض وعالي ، من الممكن قياس التدفقات السيتوبلازمية قبل الجرح وأثناءه وبعده.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن التئام الجروح غالبا ما يتم تناوله على مستوى الأنسجة الكاملة ، إلا أنه في كثير من الحالات تكون الخلايا الفردية قادرة على التئام الجروح داخل نفسها ، وإصلاح غشاء الخلية المكسور قبل تسرب المحتويات الخلوية. كان الكائن الحي العملاق أحادي الخلية Stentor coeruleus ، حيث يمكن أن يزيد حجم الخلايا عن ملليمتر واحد ، كائنا نموذجيا كلاسيكيا لدراسة التئام الجروح في الخلايا المفردة. يمكن قطع الخلايا الدعامة إلى نصفين دون فقدان قابليتها للحياة ، ويمكن حتى قطعها وتطعيمها معا. لكن هذا التسامح العالي للقطع يثير التساؤل عن سبب عدم تدفق السيتوبلازم ببساطة من حجم القطع. نقدم هنا طريقة لقطع خلايا Stentor مع تصوير حركة السيتوبلازم بالقرب من القطع بدقة مكانية وزمانية عالية. مفتاح طريقتنا هو استخدام تكوين مجهر "ذو طابقين" يتم فيه إجراء الجراحة تحت مجهر تشريح يركز على غرفة يتم عرضها في نفس الوقت من الأسفل بدقة عالية باستخدام مجهر مقلوب بعدسة NA عالية. يسمح هذا الإعداد بمستوى عال من التحكم في الإجراء الجراحي مع السماح بتتبع السيتوبلازم عالي الدقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التجديد والتئام الجروح من العمليات البيولوجية المهمة التي تظل آلياتها مجالات للتحقيق النشط. في الواقع ، تعد القدرة على التئام الجروح وتجديد الأجزاء التالفة إحدى الميزات التي تميز الكائنات الحية عن الأشياء غير الحية. عادة ، يعتقد أن التجديد يتم بوساطة تمايز الخلايا الجذعية إلى أنواع مختلفة من الخلايا اللازمة لإعادة بناء جزء حيواني تالف أو مقطوع ، بينما ينظر إلى التئام الجروح من حيث الخلايا الجديدة التي تغزو الجرح لإعادة بناء ظهارة سليمة. وهكذا يبدو أن كلتا العمليتين توسطان عن طريق مجموعات من الخلايا الفردية ، وبالتالي يبدو أنهما عمليتان متعددة الخلايا بشكل جوهري. لذلك من المدهش أن تكون الخلايا الفردية ، في بعض الحالات ، قادرة على إصلاح الجروح وتجديد المكوناتالمفقودة 1. يمكن أن يتضمن التئام الجروح داخل الخلايا المفردة مسارات متعددة بما في ذلك تقلص سلسلة محفظة الأكتين الميوسين حول الجرح وترقيع الغشاء عن طريق الاندماج السريع للحويصلات الخارجية1-3. على الرغم من أن العديد من أنواع الخلايا قادرة على درجة معينة من التئام الجروح4-6 ، إلا أن المثال الأكثر دراماتيكية هو الهدب العملاق Stentor coeruelus7 ، كما هو موضح في الشكل 1. يبلغ طول خلايا Stentor الفردية 1 مم ، وهي مغطاة بصفوف من الأهداب. الخلايا الدنية مخروطية الشكل مع جهاز فموي ، يتكون من آلاف الأهداب ، في أحد طرفيها ، وهيكل ضيق في الطرف الآخر. كان Stentor كائنا نموذجيا كلاسيكيا لدراسة التجديد لأنه إذا تم قطع أي جزء من الخلية ، فيمكنه التجدد7. على سبيل المثال ، في سلسلة كلاسيكية من التجارب ، أظهر توماس هانت مورغان8 أنه يمكن قطع خلية Stentor إلى نصفين وأن كل نصف سيجدد خلية متناسبة بشكل طبيعي في غضون ساعات8. لا تزال المسارات الجزيئية المسؤولة عن التجديد في Stentor غير معروفة تماما.

تعتمد قدرة خلايا Stentor على العمل كنظام نموذج تجديد على القدرة المذهلة لهذه الخلايا على شفاء نفسها بعد قطعها. لماذا لا يتسرب سيتوبلازم خلية Stentor عند قطع الخلية؟ لا يرجع التئام الجروح إلى الانقباض الفوري لقشرة الخلية ، لأنه من الممكن أخذ خليتين من Stentor ، وقطعهما ، ثم ربط الخليتين المقطوعة معا في تكوينات مختلفة7. خلال تجارب التطعيم هذه ، يجب أن يظل سيتوبلازم الخليتين مكشوفا لأنه يندمج عندما يتم دفع الخلايا معا. بطريقة ما ، يتعرض السيتوبلازم بدرجة كافية للوسائط المحيطة للسماح بالتطعيم ، لكنه لا يتدفق خارج الخلية. هل سيتوبلازم Stentor مرن بدرجة كافية بحيث لا يمكن أن يتدفق حتى عند عمل ثقب كبير في غشاء البلازما؟ هل تزيد الخلايا من لزوجة السيتوبلازم محليا حول الجرح لمنع السيتوبلازم من التدفق؟ السيتوبلازم هو مادة نشطة معقدةللغاية 9-11 ، وتمثل استجابة التئام الجروح Stentor فرصة فريدة لدراسة التدفقات والميكانيكا السيتوبلازمية أثناء التئام الجروح أحادية الخلية. ومع ذلك ، فإن استخدام الأساليب الجراحية للحث على الجرح في Stentor يشكل تحديا تقنيا. من أجل قطع خلية بطول 1 مم باستخدام إبر زجاجية ، وهو النموذج الجراحي التقليدي ، من الضروري العمل بتكبير منخفض مع مسافة عمل طويلة. في ظل ظروف التصوير هذه ، لا يمكن تتبع تدفق السيتوبلازم ، وكل ما يمكن للمرء تحديده هو ما إذا كان السيتوبلازم يبقى داخل الخلية أم لا. السؤال الحقيقي الذي نود طرحه هو كيف يمكن أن تتغير حركة ولزوجة السيتوبلازم أثناء القطع والشفاء. هذا يتطلب تصويرا عالي الدقة. نقدم هنا تكيفا لبروتوكول Tartar لقطع Stentor7 الذي يسمح بإجراء القطع تحت بصريات تكبير أقل لرؤية الخلية بأكملها مع مراقبة تدفق السيتوبلازم بدقة عالية في نفس الوقت ، مما يسمح باستخدام هذا النظام كمنصة لاستكشاف آليات التئام الجروح أحادية الخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. ثقافة الخلايا وجمعها

  1. احصل على خلايا Stentor coeruleus إما من الأحواض الطبيعية كما هو موضح في الجير7 أو من مورد تجاري (انظر الكواشف).
  2. حافظ على الثقافات عن طريق النمو في الظلام عند 20 درجة مئوية في وسط الدعامات المعدل (MSM) ، والذي تم تكييفه من الوصفات التي وصفها Tartar7 و De Terra12 التي تحتوي على 0.75 ملي Na2CO3 ، 0.15 ملي مولار KHCO3 ، 0.15 ملي NaNO3 ، 0.15 ملي KH2PO4 ، 0.15 ملي مللي كلوريد الكالسيوم2 ، و 1.47 ملي كلوريد الصوديوم.
  3. استكمل وسط MSM بمصدر كربون عن طريق إضافة فريسة حية إلى الوسط. زراعة مزارع وسط Chlamydomonas reinhardtii TAP باستخدام طرق الاستزراع القياسية13. قبل الرضاعة ، اغسل خلايا الكلاميدوموناس في MSM. إطعام 300 مل مزارع Stentor ~ 3 × 107 خلايا Chlamydomonas 2-3x في الأسبوع.
  4. اجمع خلايا الدعامة للجراحة باستخدام ماصة. يميل Stentor إلى التثبيت في قاع وجوانب طبق الثقافة ، وبالتالي ، من أجل جمع الخلايا ، قم بتحريك الثقافة عن طريق فقاعات الهواء من خلال طرف ماصة حتى تبدأ الخلايا في الانفصال والسباحة بحرية.
  5. التقط خلايا السباحة باستخدام ماصة مزودة بطرف واسع التجويف لتجنب قص الخلايا.
  6. اغسل الخلايا المجمعة في MSM الطازج.
< p class = "jove_title" >2. تحضير أدوات الجراحة المجهرية

  1. امسك قضيبي تقليب زجاجيين فوق موقد بنسن أو لهب آخر حتى تبدأ الأطراف في الذوبان.
  2. المس طرفي القضيبين معا حتى يندمج الزجاج المصهور.
  3. بعد إنشاء قطرة صغيرة من الزجاج المصهور بين القضيبين ، قم بإزالتها من اللهب ، واتركها لتبرد لمدة 1-2 ثانية ، ثم افصلها عن بعضها البعض لعمل استراحة نظيفة. من الناحية المثالية ، سوف ينسحب الزجاج إلى خيوط رفيعة وينكسر بسلاسة عندما يبرد الزجاج مما ينتج عنه إبرة يبلغ طولها حوالي 1-2 سم مع نقطة دقيقة في النهاية (الشكل 2).
  4. إذا كانت الإبرة الناتجة دون المستوى الأمثل ، فقد يتم تقسيم الأطراف إلى نفايات زجاجية ويمكن إعادة استخدام القضبان.
< p class = "jove_title" >3. تركيب الخلايا للجراحة المجهرية والمراقبة (الجراحة العادية)

  1. قم بإعداد غرفة مربعة محاطة بالفازلين باستخدام ختم مطاطي مربع مطلي بالفازلين وضغطه على غطاء زجاجي.
  2. أضف MSM الذي يحتوي على 2٪ ميثيل السليلوز إلى مربع الفازلين.
  3. ضع الغطاء في محول بلاستيكي ، مما يسمح بوضع الغطاء على مجهر بحامل منزلق قياسي (الشكل 3).
  4. أضف الخلايا المغسولة من الخطوة 1.6 إلى MSM بالإضافة إلى ميثيل السليلوز لإعاقة حركة خلايا Stentor بحيث تظل في مكانها أثناء الجراحة.
  5. رتب الخلايا في ميثيل السليلوز بحيث تكون متباعدة بشكل متساو ويتم دفعها بالقرب من سطح الغطاء لتكون في بؤرة التركيز أثناء التصوير.
< p class = "jove_title" >4. تصوير عالي الدقة لالتئام الجروح في الدعامات الحية

لتصوير خلية Stentor بدقة عالية في وقت واحد أثناء قصها جراحيا تحت تكبير منخفض ، قم ببناء مجهر "ذو طابقين" مع نطاق تشريح متصل برأس العدسة للنطاق المقلوب بحيث يتم تركيزه على الجزء العلوي من الشريحة بينما يتم تركيز النطاق المقلوب من أسفل الشريحة.

  1. ضع شريحة على النطاق المقلوب (استخدم إما Zeiss Axiovert 200M أو Olympus IX80).
  2. قم بإزالة جسم المجهر التشريح من حامله وحدد الموضع التقريبي فوق عدسة المجهر المقلوب لوضع نطاق التشريح للسماح بتصور الشريحة بتكبير منخفض.
  3. قم بتعديل صندوق من الورق المقوى ليكون له نفس سمك التباعد المطلوب بين رأس العدسة المقلوب ونطاق التشريح ، ثم قم بتثبيته في نطاق مقلوب باستخدام شريط المختبر الذي يمكن إزالته بسهولة عند اكتمال التجربة. اضبط سمك الصندوق وفقا للتكوين الدقيق لرأس العدسة في المجهر المقلوب وعلى حجم المجهر التشريح بحيث تكون العينة في مجال الرؤية دون الحاجة إلى تحريك نطاق التشريح بعد توصيله.
  4. أمسك نطاق التشريح مقابل الصندوق ، وحركه حتى تصبح الشريحة في بؤرة التركيز ، ثم قم بلصقها على الصندوق مرة أخرى باستخدام شريط المختبر. يظهر التكوين النهائي في الشكل 4.
  5. صور الخلايا من خلال النطاق المقلوب باستخدام بصريات DIC وعدسة موضوعية هوائية 20X. استخدم مكثف DIC لمسافة العمل الطويلة لتوفير مساحة كافية لإجراء الجراحة المجهرية من الأعلى.
  6. احصل على صور بمعدل إطارات 2 صورة / ثانية باستخدام كاميرا CCD بدقة 512 × 512.
  7. ابدأ في الاستحواذ قبل البدء في قطع الخلايا لالتقاط نمط التدفق السيتوبلازمي الأولي ومراقبة جميع مراحل عملية الجرح والتئام الجروح.
  8. إنهاء الاستحواذ عندما تستأنف الخلية المظهر الطبيعي و / أو الحركة النشطة ، من أجل تصور وقياس الحركات السيتوبلازمية طوال عملية التجديد.
< p class = "jove_title" >5. تحليل التدفق السيتوبلازمي أثناء التئام الجروح

< p class = "jove_content" > قياس التدفق السيتوبلازمي باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات (PIV). هذه التقنية روتينية في دراسة ديناميكيات السوائل ، ويمكن أن تولد حقول تدفق في حالة عدم وجود جزيئات يمكن تتبعها بشكل فردي في السائل. تم استخدام PIV لقياس تدفقات السيتوبلازم بناء على تصوير الحويصلات تحت الخلوية والميزات الأخرى المرئية في السيتوبلازم عن طريق المجهر الضوئي المنقول14.

  1. قم بتنزيل PIVLab ، وهي حزمة MATLAB ل PIV ، من موقع الويب http://pivlab.blogspot.com/.
  2. قم بتحميل مكدس الصور tiff لكل تسلسل فيديو في برنامج PIV داخل MATLAB.
  3. قم بإنشاء قناع يدويا لكل مكدس صور لإخفاء مناطق البيانات الأولية خارج نص Stentor.
  4. اضبط PIVLab لاستخدام إعداد تحويل فورييه السريع وحجم سلة 64 × 64 بكسل ، والذي سيضع وحدات البكسل في كل إطار في وحدات بكسل مربعة أكبر.
  5. قم بتشغيل PIVLab لحساب الارتباطات المتبادلة بين وحدات البكسل في كل إطار مع وحدات البكسل القريبة في الإطار التالي لإنتاج متجه تدفق يعتمد على الوقت متمركز في كل بكسل مدمج ، والذي له نفس دقة الوقت مثل بياناتنا الأولية.
  6. احسب المتوسطات الزمنية لمخرجات حقل المتجه الناتج لإنشاء خطوط انسيابية للمقارنة بين البيانات المأخوذة باستخدام Stentor قبل القطع وأثناء التئام الجروح ، وحساب الرسوم البيانية لسرعات التدفق (لدراسة قوة التدفق) وتغير السرعة عند بكسل معين بمرور الوقت (لدراسة تقلبات التدفق).
  7. بالنسبة لتسلسلات الصور مع شق Stentor إلى نصفين وتسرب السيتوبلازم بشكل واضح إلى المخزن المؤقت المحيط ، احسب التدفق الكلي للسيتوبلازم مرة أخرى إلى جسم الخلية بشكل صحيح عن طريق ضرب متوسط سرعة التدفق في مساحة المقطع العرضي لقاعدة فقاعة السيتوبلازم خارج الخلية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام البروتوكولات الموضحة أعلاه ، وجد أن سيتوبلازم Stentor ديناميكي بشكل ملحوظ ، قبل القطع وبعده. يظهر الفيديو 1 التدفق المكثف للسيتوبلازم الموجود في الخلايا غير المقطوعة. على الرغم من توقعاتنا الأصلية بأن قدرة Stintor على البقاء على قيد الحياة من القطع ستتضمن تصلب أو تبلور السيتوبلازم ، في الواقع عندما يتم قطع خلايا Stentor بعنف كاف لسحب السيتوبلازم من الخلية ، يظل السيتوبلازم ديناميكيا للغاية ويتمكن من التدفق مرة أخرى إلى الخلية بطريقة موجهة للغاية (فيديو 2).

بالإضافة إلى إظهار درجة غير متوقعة سابقا من الحركة السيتوبلازمية أثناء التئام الجروح ، يمكن استخدام الدقة العالية للتصوير في الفحص لتحديد معدلات التدفق باستخدام قياس سرعة صورة الجسيمات. ستسمح القدرة على إجراء مثل هذه القياسات باختبار تأثير المثبطات الكيميائية بدقة.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-1
الشكل 1. مورفولوجيا خلية Stentor الحية. صورة الحقل المظلم لخلية Stentor الحية التي تم تغذيتها بالكلاميدوموناس كما هو موضح في الإجراء 1.3 ، مرئية كمادة خضراء داخل فجوات الطعام. يمكن رؤية الجهاز الفموي الذي تأكل الخلية من خلاله كحافة من الأهداب في الجزء العلوي من الصورة. انقر هنا لعرض صورة أكبر. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-2
الشكل 2. تحضير إبرة زجاجية للجراحة. (أ) يتم سحب الإبرة من نهاية قضيب زجاجي صلب. (ب) عرض تكبير عالي لطرف الإبرة يشير إلى الطول والحدة اللازمين للجراحة. انقر هنا لعرض صورة أكبر. < p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "دائما" >figure-results-3
الشكل 3. حامل غطاء مخصص للجراحة المجهرية. من أجل السماح بالوصول المفتوح للجراحة مع السماح بظروف التصوير المثلى ، يتم تثبيت الخلايا على غطاء بدلا من شريحة فئة سميكة. من أجل السماح للغطاء بالملاءمة لمرحلة المجهر ، يمكن تصنيع حامل بلاستيكي باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد. يحتوي الحامل على نفس أبعاد شريحة المجهر القياسية بينما يتطابق المنخفض في المنتصف مع أبعاد الغطاء. يسمح الثقب الموجود في إحدى الزوايا بإخراج الغطاء من الحامل. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

figure-results-4
الشكل 4. تكوين مجهر ذو طابقين. يتم تثبيت رأس مجهر تشريح أعلى رأس العدسة في المجهر المقلوب. يسمح شريط المختبر بتجميع الجهاز وتفكيكه بسرعة عند اكتمال التجربة. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

< p class = "jove_content" >فيديو 1. مثال على التدفق السيتوبلازمي لوحظ في خلية Stentor الحية. تم تصوير الخلية بهدف 10X مع بصريات المجال المظلم بمعدل 2 إطار / ثانية. < p class = "jove_content" >فيديو 2. أناأفكر في خلية Stentor أثناء قطعها وتعطلها بإبرة زجاجية. بعد قطع كمية كبيرة من السيتوبلازم تم سحبها من جسم الخلية الرئيسي ، لكنها تتدفق بسرعة مرة أخرى إلى الخلية.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سيكون أهم تطبيق لهذه الطريقة هو استخدامها لتحديد المسارات الجزيئية التي تنظم التدفق السيتوبلازمي أثناء التئام الجروح في Stentor. تتوفر مجموعة واسعة من المثبطات الكيميائية التي تستهدف البروتينات الحركية وكذلك مكونات الهيكل الخلوي. مثبطات إشارات الكالسيوم ستكون أيضا مرشحة محتملة. سيكون من المفيد أيضا إزالة أو تقليل حبيبات الصباغ (الطارد) التي تحتوي على الصبغة الزرقاء Stentorin ، والتي يتم إطلاقها من الخلية تحت الضغط ، والسؤال عن كيفية تأثير إطلاق الخلايا الخارجية ل Stentorin على تدفق السيتوبلازم القريب. يمكن استنفاد الصبغة باستخدام علاج تبييض بسيط15 والذي يمكن إجراؤه قبل القطع مباشرة. لا يبدو أن هناك أي طريقة بسيطة لإجراء فحص التئام الجروح بطريقة موازية لأن الخلايا تحتاج إلى قطع وتصوير واحدة تلو الأخرى. وبالتالي باستخدام مجهر واحد ، سيكون من الممكن العمل على الخلايا وقياسها بمعدل 1 تقريبا لكل 0.5 ساعة ، بحيث يكون من الممكن خلال يوم واحد من العمل الحصول على نقاط بيانات كافية لمركب واحد لتحديد ما إذا كان له تأثير ذي دلالة إحصائية على العملية. في حين أن الطريقة ليست بأي حال من الأحوال إنتاجية عالية ، إلا أنه سيكون من الممكن تماما فحص مجموعة مختارة من المركبات المرشحة المحددة لعدد قليل من المسارات المستهدفة المختارة بعناية.

أحد القيود الرئيسية للنهج الحالي هو الطريقة الخام نسبيا لتجميع المجهر ذو الطابقين. بافتراض أن المجهر المقلوب المستخدم في التصوير هو أداة استخدام عام يحتاج العمال الآخرون إلى استخدامها لأغراض أخرى ، فإن أحد الاعتبارات المهمة هو السهولة التي يمكن بها تفكيك الجهاز وإعادة تجميعه. في حين أن الطريقة الحالية باستخدام شريط المختبر سريعة بالفعل ويمكن تفكيكها بسهولة ، إلا أنها تتطلب محاذاة دقيقة من قبل المستخدم أثناء التجميع في كل مرة. لذلك ، سيكون التعديل المهم هو بناء حامل قابل للإزالة مخصص مع فتحات لرأس العدسة للنطاق المقلوب وجسم نطاق التشريح. يجب أن يكون من السهل تصنيع هذا باستخدام تقنية الطابعة ثلاثية الأبعاد الحديثة.

القيد الثاني لهذا النهج هو الاعتماد على تصوير DIC للعضيات داخل الخلايا كعلامات على التدفق. نظرا لأن هوية هذه العضيات التي لوحظت في المجهر غير معروفة حاليا ، فلا يمكن معرفة حجمها أو تفاعلاتها المحتملة مع المكونات الخلوية الأخرى. لذلك قد يكون من المفيد حقن أدوات التتبع الخارجية مثل حبات الفلورسنت واستخدامها لتتبع التدفق. ومع ذلك ، سيتطلب هذا خطوة إضافية - الحقن المجهري - قبل إجراء التجربة ، وبالتالي زيادة إبطاء الفحص.

القيد الرئيسي النهائي هو الاعتماد على مستوى صورة واحد للحصول على البيانات. تكمن الأهمية الأساسية لهذا الاختبار في أنه يتجاوز مجرد السؤال عما إذا كان الجرح يلتئم أم لا ، ويسمح بالحصول على تحليل مفصل لنمط التدفق. في هذا الصدد ، سيكون من المهم للغاية توسيع التصوير إلى التصوير ثلاثي الأبعاد. تصور الطريقة الحالية مستوى بؤريا واحدا ، وبالتالي عندما يتم إجراء تحليل PIV ، تكون النتيجة شريحة عبر حقل التدفق ثلاثي الأبعاد الكامل. هذا مفيد ولكنه غير مكتمل. من خلال الحصول على صور ثلاثية الأبعاد في كل خطوة زمنية ، يجب أن يكون من الممكن الحصول على مجال تدفق ثلاثي الأبعاد بالكامل. سيكون هذا أمرا بالغ الأهمية بشكل خاص لمراقبة كيفية تحرك السيتوبلازم بالضبط في المنطقة المجاورة مباشرة لموقع الجرح.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 GM090305 (WFM). تم تطوير الإجراء الموصوف هنا في دورة علم وظائف الأعضاء في المختبر البيولوجي البحري خلال صيف عام 2012 ، ونشكر الطلاب والمدربين ومديري الدورات على العديد من المناقشات المفيدة والمحفزة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Stentor coeruleus< / em> الثقافة الحيةكاروليناالبيولوجية 131598
ميثيل السليلوز ، 1،500 cPSigmaM0387

المعدات: < / p>

اسم المادةرقمكتالوج
قضيب تحريك زجاجي ناعم 5 في طويلفيشر ساينتفيك11-380A
صحن ثقافة 4.5 في 250 مل  زجاجكارولينا بيولوجي741004
IX81 مجهر مقلوبأوليمبوس
أكسيفرت 200 متر مجهر مقلوبزايس
ستيمي 2000 مجهر ستيريوزايس
إيفولف 512 × 512 كاميرا EMCCDالقياسات
خطة أبو 20X الهدفأوليمبوسUPLSAPO
الشركةالضوئية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 237-264 (2011).
  2. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends Cell Biol. 18 (11), 552-559 (2008).
  3. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106 (2), 157-169 (2001).
  4. Foissner, I., Wastenays, G. O. The characean internodal cell as a model system for studying wound healing. J. Microsc. 247 (1), 10-12 (2012).
  5. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Curr. Biol. 9 (11), 579-587 (1999).
  6. Kim, H. G., Klotchkova, T. A., Kang, Y. M. Life without a cell membrane: regeneration of protoplasts from disintegrated cells of the marine green alga Bryopsis plumosa. J. Cell Sci. 114 (11), 2009-2014 (2001).
  7. Tartar, V. The Biology of Stentor. , Pergamon Press. 434 (1961).
  8. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. Biol. Bull. 2 (6), 311-328 (1901).
  9. Heidemann, S. R., Wirtz, D. Towards a regional approach to cell mechanics. Trends Cell Biol. 14 (4), 160-166 (2004).
  10. Kasza, K. E., Rowat, A. C., Liu, J., Angelini, T. E., Brangwynne, C. P., Koenderinck, G. H., Weitz, D. A. The cell as a material. Curr. Opin. Cell Biol. 19 (1), 101-107 (2007).
  11. Mitchison, T. J., Charras, G. T., Mahadevan, L. Implications of a poroelastic cytoplasm for the dynamics of animal cell shape. Sem. Cell Dev. Biol. 19 (3), 215-223 (2008).
  12. De Terra, N. Culture of Stentor coeruleus on Colpidium campylum. J. Eukar. Microbiol. 13 (3), 491-492 (1966).
  13. Harris, E. H. The Chlamydomonas Sourcebok. 1, (2009).
  14. Vallotton, P., Ponti, A., Waterman-Storer, C. M., Salmon, E. D., Danuser, G. Recovery, visualization, and analysis of actin and tubulin polymer flow in live cells: a fluorescent speckle microscopy study. Biophys. J. 85 (2), 1289-1306 (2003).
  15. Miyake, A., Harumoto, T., Iio, H. Defence function of pigment granules in Stentor coeruleus. Eur. J. Protistol. 37 (1), 7-88 (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة