Method Article

التحليل المنهجي لل في المختبر الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا

DOI:

10.3791/50866

⸱

October 16th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biomedical Engineering, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women's Hospital, 3Harvard Medical School, Harvard University, 4Harvard Stem Cell Institute, Harvard University, 5Harvard-MIT Division of Health Sciences and Technology, 6Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم هذه الدراسة نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا، وزيادة الإنتاجية بشكل كبير من الدراسات خلية المتداول تحت تدفق القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. نظرا لأهمية الخلية المتداول في الخلية متعددة الخطوات صاروخ موجه تتالي وأهمية صاروخ موجه الخلية بعد تسليم النظامية من السكان خارجية من الخلايا في المرضى، وهذا النظام يوفر إمكانية كمنبر الفحص لتحسين العلاج القائم على الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتمثل التحدي الرئيسي للعلاج القائم على الخلية هو عدم القدرة على استهداف بشكل منتظم كمية كبيرة من خلايا قابلة للحياة ذات كفاءة عالية لأنسجة الفائدة التالية التسريب في الوريد أو الشرياني. وبالتالي، زيادة صاروخ موجه الخلية تدرس حاليا كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على بطانة الأوعية الدموية هي خطوة هامة في عملية صاروخ موجه الخلية ويمكن بحثها في المختبر باستخدام تدفق موازية لوحة غرفة (PPFC). ومع ذلك، وهذا هو مملة للغاية، والإنتاجية المنخفضة الفحص، مع ظروف تدفق تسيطر بشكل سيئ. بدلا من ذلك، استخدمنا نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا أن تمكن دراسة الخصائص الخلوية المتداول في إنتاجية أعلى تحت تسيطر على وجه التحديد، ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تدفق القص 1،2. في هذه الورقة، وتبين لنا كيف أن خصائص المتداول من HL-60 (اللوكيميا الإنسان) الخلايا على الأسطح المطلية E-selectin-P وكذلك على الخلايا المغلفة السطوح يمكن أن يكون أحادي الطبقة readilدرست ذ. لمحاكاة أفضل الحالات الالتهابية، والمغلفة سطح قناة ميكروفلويديك مع الخلايا البطانية (ECS)، ثم جرى تفعيلها مع عامل نخر الورم-α (TNF-α)، زيادة كبيرة في التفاعل مع HL-60 الخلايا تحت الظروف الديناميكية. الإنتاجية المعززة والمتكاملة متعددة المعلمة منصة تحليل البرامج، التي تسمح التحليل السريع من المعلمات مثل المتداول السرعات والمتداول المسار، ومزايا هامة لتقييم الخلية المتداول خصائص في المختبر. يسمح تحليل سريع ودقيق الأساليب الهندسية المصممة للتأثير المتداول الخلية وصاروخ موجه، هذا المنبر قد يساعد العلاج القائم على الخلية الخارجية مسبقا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة السريرية نجاح العلاج القائم على الخلية هو تسليم غير فعال أو استهداف الخلايا التي غرست بشكل منتظم لمواقع المطلوب 3،4. وبالتالي، هناك بحث دائم عن النهج لتحسين صاروخ موجه الخلية، والخلية تحديدا المتداول، كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على الأوعية الدموية هي خطوة رئيسية في سلسلة الخلية صاروخ موجه، تعريف كلاسيكي للالكريات البيض التي يتم تجنيدهم للمواقع المرض 5. ويخضع هذا خطوة محددة التفاعلات بين selectins البطانية، أي ف وE-selectin (P-E-وقانون حالة الطوارئ)، وبروابط المرتدة على سطح الكريات البيض 5،6. فهم أفضل وتحسين كفاءة الخلية صاروخ موجه، وعلى وجه التحديد الخطوة المتداول، هي ذات أهمية كبيرة في السعي لمنصات جديدة لتحسين العلاج القائم على الخلية. حتى الآن هذا تم تحقيقه عن طريق استخدام لوحة موازية غرف تدفق (PPFCs)، التي تضم اثنين من بلات شقةوفاق مع طوقا بينهما، مع منفذ تدفق وتدفق تقع على لوحة العلوي، والتي من خلالها يتم perfused تعليق خلية وباستخدام حقنة لضخ 7،8، 9. سطح اللوحة السفلي يمكن أن تكون مغلفة مع أحادي الطبقة خلية / ركائز ذات الصلة والتفاعل بين الخلايا perfused والسطح تحت تدفق القص ثم يتم استكشافها 7. ومع ذلك، PPFC هو الإنتاجية منخفضة، كاشف المستهلكة، وطريقة مملة إلى حد ما، مع تشكيل فقاعة، والتسرب، وتدفق سيئة تسيطر تقديم العوائق الرئيسية.

تقنية بديلة للPPFC التقليدية هو لوحة النظام ميكروفلويديك متعددة جيدا، والسماح أداء أعلى من الإنتاجية المقايسات الخلوية (أعلى ما يصل إلى 10 مرة من PPFCs) تحت دقيقة، الكمبيوتر التي تسيطر عليها تدفق القص، مع انخفاض استهلاك كاشف 1،10. وتجرى التجارب المتداول خلية داخل قنوات ميكروفلويديك، والتي يمكن أن تكون مغلفة مع الطبقات الوحيدة الخلية أو ركائز هندسيا وتصويرها باليودنانوغرام المجهر، مع خصائص المتداول تحليلها بسهولة باستخدام البرمجيات المناسبة. في هذه الدراسة، ونحن لشرح قدرات هذا النظام لوحة ميكروفلويديك متعددة جيدا من خلال دراسة خصائص المتداول من اللوكيميا الإنسان (HL-60) الخلايا على الأسطح المختلفة. HL-60 المتداول على ركائز مثل P و E-SEL، فضلا عن الطبقات الوحيدة الخلية التعبير عن مستقبلات المتداول مختلفة، تم تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، تم الأضداد (أب) تستخدم الحجب لإثبات المشاركة المباشرة من selectins محددة في التوسط في الحركة المتداول من HL-60 على تلك السطوح. وأجريت التجارب المتداول مع زيادة الإنتاجية، في ظل تدفق مستقر القص، مع الحد الأدنى من استهلاك كاشف / خلية، مما يتيح تحليل كفاءة المعلمات المتداول الرئيسية مثل سرعة المتداول، وعدد الخلايا المتداول، والمتداول خصائص المسار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الثقافة الخلية

  1. اللوكيميا الإنسان (HL-60) الخلايا
    1. ثقافة HL-60 خلايا في 75 سم 2 القوارير مع 15 مل من Iscove في التعديل Dulbecco ومتوسطة (IMDM)، على أن تستكمل مع 20٪ (V / V) مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ (V / V) L-الجلوتامين و1 ٪ (ت / ت) البنسلين، الستربتوميسين.
    2. تغيير وسائل الاعلام كل 3 أيام عن طريق الشفط نصف حجم تعليق خلية واستبدالها كاملة سائل الإعلام IMDM.
    3. لcarboxyfluorescein ثنائي الأسيتات، استر succinimidyl (CFSE) تلطيخ، الطرد المركزي HL-60 تعليق خلية (400 x ج، 5 دقائق)، resuspend في محلول 1 ميكرومتر CFSE (المعد في برنامج تلفزيوني prewarmed)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم الطرد المركزي الخلايا، والخلايا نضح طاف resuspend في المتوسط ​​prewarmed الطازجة لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني ومن ثم استخدامها لتجارب المتداول (انظر الشكل 1B لصورة ممثل CFSE الملطخة HL-60 على الخلايا P-المغلفة SEL السطح).

ق ق = "jove_content"> ملاحظة: CFSE تلطيخ هو اختياري، ويرد هنا للتدليل على ظاهرة المتداول في قناة ميكروفلويديك. تم إجراء تحليل المعلمات المتداول المقدمة في هذه المخطوطة على الخلايا غير ملوثين باستخدام التصوير brightfield القياسية.

  1. الرئة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (LMVECs)
    1. معطف 100 ملم أطباق بتري مع 0.1٪ محلول الجيلاتين (ت / ت في برنامج تلفزيوني)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. LMVECs الثقافة على 100 ملم أطباق بتري المغلفة الجيلاتين في كامل متوسطة النمو البطاني (البطانية القاعدية المتوسطة 2 (EBM-2))، على أن تستكمل مع مجموعة محددة تكملة النمو، انظر الكواشف). تغيير وسائل الاعلام كل يوم والخلايا الثقافة الفرعية عند بلوغه 80-90٪ التقاء.
    3. للثقافة الفرعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثم فصل الخلايا مع 4 مل من 1X التربسين EDTA-لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية وتحييد في حجم مساو من اكتمال EBM-2 وسائل الاعلام. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 مل وcentrifugه (400 x ج، 5 دقائق). بعد الطرد المركزي، resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الإعلام البطانية كاملة وتعول الخلايا مع عدادة الكريات. لا الإفراط مرور الخلايا، وهذا يؤثر على التشكل والاستخدام وظيفة الخلايا إلا في ظل مرور 7 لجميع التجارب.
  1. الصينية الهامستر المبيض، ف selectin (CHO-P) خلايا
    1. خلايا CHO-P، وهي الخلايا CHO ستابلي للتعبير عن الإنسان P-SEL، وقدمت من قبل المتعاونين (مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي، كلية الطب بجامعة هارفارد) 11،12.
    2. خلايا الثقافة CHO-P في T175 سم 2 القوارير في 25 مل من F-12 وسائل الإعلام.
    3. لالركض، وغسل الخلايا مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 4-5 ثانية ثم يعرض للتريبسين في 10 مل من 1X التربسين EDTA-لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية، تليها تحييد كامل في وسائل الإعلام.
    4. الطرد المركزي تعليق خلية (400 x ج، 5 دقائق)، ونضح بعناية طاف، resuspend الكرية خلية في 1 مل من وسائل الإعلام الكامل وعدد الخلايا مععدادة الكريات.

2. تشغيل نظام ميكروفلويديك المتكاملة متعدد جيدا بلايت

  1. تأكد من توصيل كافة المعدات بشكل صحيح وتشغيل وحدات مختلفة: الكمبيوتر، وحدة تحكم، المجهر المقلوب، وكاميرا CCD.
  2. فتح برامج التصوير، تأكد من يتم عرض بشكل صحيح وحدة لوحة متعددة جيدا وحدة التصوير على الشاشة.
  3. توصيل أنابيب إلى فخ بخار (متصلة إلى وحدة تحكم) وكذلك ربطها واجهة الضغط.
  4. وضع لوحة متعددة جيدا في لوحة سخان / محول. إضافة الكواشف لآبار (موضح أدناه) ونعلق على رأس واجهة من لوحة. وضع لوحة للتصوير على خشبة المسرح الآلي.
  5. وتعلق واجهة إلى الأعلى من لوحة وينطبق ضغط هوائي من وحدة تحكم إلى الجزء العلوي من الآبار، والقيادة السائل من خلال القنوات ميكروفلويديك في معدل تدفق المعرفة، التي تسيطر عليها بسهولة باستخدام لوحة متعددة جيداالشاشة وحدة تحت وضع يدوي.
  6. الكواشف في تدفق قناة عبر منطقة المراقبة، وتقع بين الآبار. أبعاد قناة ميكروفلويديك هي 350 ميكرون واسعة س 70 ميكرون طويل القامة. طول القناة الخطي هو 1 مم ويضم الجزء السفلي من القنوات ساترة الزجاج 180 ميكرون، والذي يتوافق مع brightfield، المرحلة، ومتحد البؤر المجهري مضان.
  7. الحصول على أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا CCD (اقتناء تيار، 11 لقطة / ثانية) وتحليل عن طريق برنامج متوافق.

3. طلاء القنوات ميكروفلويديك مع الركيزة البروتين أو أحادي الطبقة خلية

  1. طلاء قناة ميكروفلويديك مع فبرونيكتين أو P-/E-selectin
    1. إعداد 1 مل من 20 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني. تغيير حجم استنادا إلى عدد من القنوات لتكون مغلفة (استخدام 25-50 ميكرولتر من فبرونيكتين لكل قناة).
    2. إضافة 25-50 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين على كل مدخل جيدا. تطبيق قوة القص من 2 داين / سم 2لمدة 5 دقائق ليروي القناة. يرجى ملاحظة حبة من السائل الظهور في منفذ بشكل جيد. احتضان لمدة 30-45 دقيقة في RT
    3. نضح الحل من الآبار (لا نضح مباشرة من الدائرة الوسطى التي تغذي قناة) 1،13. إضافة 200-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في منفذ جيدا ويغسل مع برنامج تلفزيوني قناة من خلال تطبيق تدفق القص من 2 داين / سم 2 لمدة 5 دقائق. الآن المغلفة القناة بشكل صحيح مع فبرونيكتين وعلى استعداد لاستخدامها.
    4. لمعطف مع P-E أو قانون حالة الطوارئ، وإعداد حل 5 ميكروغرام / مل من البروتين المؤتلف الإنسان المطلوب في برنامج تلفزيوني، ومعطف القنوات كما هو موضح أعلاه، مع 1 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية للسماح للطلاء السطح.
  2. إنشاء CHO-P أو LMVEC أحادي الطبقة داخل القناة ميكروفلويديك
    1. بلطف يعرض للتريبسين الخلايا من الأطباق الثقافة لمدة 3 دقائق، ويشفي باستخدام حجم 2 أضعاف من وسائل الإعلام الكامل وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 400 x ج). Resuspend الخلايا مع 10 مل من وسائل الإعلام الكامل وأجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 400 x ج) ضد هبوطن.
    2. عد الخلايا لتحديد تركيز خلية في التعليق. لضمان تشكيل أحادي الطبقة متموجة LMVEC داخل القناة، وجلب تركيز الخلية إلى 15-20 مليون خلية / مل. لمتموجة CHO-P أحادي الطبقة الخلية، استخدم 50-60000000 خلية / مل. استخدام 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية لكل قناة - تحديد عدد الخلايا الأولية المستخدمة في التجربة وفقا لذلك.
    3. إضافة 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية في تركيز المناسبة لمدخل جيدا. وضع لوحة على المسرح المجهر وإدخال خلايا في القناة (2 داين / سم 2) حتى لوحظ الخلايا على الشاشة ملء قنوات بأكملها، ومن ثم وقف تدفق.
    4. ملء كل من مخرج ومدخل مع 200 ميكرولتر من LMVEC إما كاملة أو CHO سائل الإعلام. السماح للخلايا تسوية والالتزام لمدة 3 ساعة في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).
    5. بعد الحضانة 3 ساعة، وغسل القناة الكامل مع وسائل الإعلام (2 داين / سم 2، 10-15 دقيقة) لإزالة غير مرتبطالخلايا. الخلايا يجب أن تظهر الآن متكدسة تماما والقناة هي الآن جاهزة للاستخدام. اعتمادا على كثافة البذر الخلية الأولي، قد يكون مطلوبا 2-3 ساعة إضافية لتسوية الوقت لضمان تغطية كاملة من السطح مع الخلايا.

4. LMVEC تفعيل برو الأجسام المضادة للالتهابات وحجب P-/E-selectin

  1. يعد حل TNF-α (10 نانوغرام / مل) في وسائل الإعلام LMVEC القاعدية.
  2. للحث على تنشيط التهابات LMVEC في القنوات، إضافة 100 ميكرولتر من الحل TNF-α إلى مدخل جيدا وتقديم الحل في القناة من خلال تطبيق تدفق القص من 2 داين / سم 2 لمدة 5 دقائق. لمراقبة القنوات (ECS nonactivated)، إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام LMVEC القاعدية إلى مدخل جيدا وندخل في قناة (2 داين / سم 2 لمدة 5 دقائق). قناة جاهز الآن للمقايسة المتداول.
  3. لمنع P-SEL وE-SEL على LMVECs والخلايا CHO-P، وإدخال تحييد P-SEL (استنساخ AK4، 5 ميكروغرام / مل في باوسائل الإعلام سال) أو E-SEL (P2H3 استنساخ، 5 ميكروغرام / مل في وسائل الإعلام القاعدية) الأجسام المضادة في القناة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. المقبل، وغسل القنوات مع وسائل الاعلام القاعدية (2 داين / سم 2 لمدة 5 دقائق). القنوات هي الآن جاهزة للمقايسة المتداول.

5. HL-60 المتداول الفحص على الركيزة / خلية المغلفة أحادي الطبقة القنوات ميكروفلويديك

  1. تدرس بعناية قنوات تحت المجهر للتأكد من أن القنوات والمغلفة بشكل صحيح (في حالة الطلاء مع الخلايا، ينبغي مراعاة أحادي الطبقة الخلية متكدسة بالكامل).
  2. لإعداد HL-60 خلية تعليق للتجارب المتداول، وأجهزة الطرد المركزي HL-60 خلية تعليق (5 دقائق في 400 x ج) ويغسل مرة واحدة مع وسائل الاعلام القاعدية. عد الخلايا و resuspend في IMDM (وسائل الإعلام القاعدية، التي تحتوي على الكالسيوم 2 + والمغنيسيوم 2 +) لإنشاء خلية التعليق HL-60 مع 5 مليون خلية / مل. استخدام 25-50 ميكرولتر من تعليق خلية لكل قناة لإجراء فحص المتداول.
  3. إضافة 25-50 ميكرولتر من الخلايا suspension إلى منفذ بشكل جيد، ومكان لوحة داخل لوحة التحكم في درجة حرارته حامل (37 ° C) ومكان على المسرح المجهر. المقبل، وإدخال خلايا في القناة من خلال تطبيق قوة القص من 2 داين / سم 2 (ينبغي التقيد الخلايا في غضون 10-15 ثانية تتدفق من مخرج إلى مدخل).
  4. لدراسة استجابة المتداول بوصفها وظيفة من إجهاد القص، والحد من القص إلى 0.25 داين / سم 2 والحصول على أشرطة الفيديو 20-30 ثانية (باستخدام وظيفة "اقتناء تيار") في كل القص المطلوب (زيادة القص تدريجيا من 0.25 حتى 5 داين / سم 2. ومن الممكن أيضا استخدام المقصات أعلى).
  5. الحصول على أشرطة الفيديو باستخدام كاميرا CCD (اقتناء تيار، 11 لقطة / ثانية) وتحليل المسارات والمتداول المتداول السرعات عن طريق برنامج متوافق.

6. التدفق الخلوي لكشف التعبير عن جزيئات السطح

  1. trypsinization التالية، وإعداد تعليق خلية (باستخدام 1-2 × 10 5 خلية / عينة) من نوع من الخلايا المطلوبة (HL-60، CHO-P أو LMVECs) في برنامج تلفزيوني (- / -)، على أن تستكمل مع FBS 2٪. غسل الخلايا مرتين ويصل حجم العينة إلى 50 ميكرولتر (باستخدام نفس المخزن المؤقت).
  2. احتضان كل عينة لدى fluorophore مترافق أب المطلوب (انظر الجدول المرفق للحصول على معلومات مفصلة) في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة (مع تغطية احباط الألومنيوم).
  3. غسل الخلايا مرتين (نفس عازلة) وجلب الحجم النهائي من تعليق خلية الملون إلى 200 ميكرولتر. تحليل العينات باستخدام تدفق عداد الكريات للكشف عن التعبير عن جزيئات السطح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HL-60 لفة على خلايا-P وselectin E السطوح، ولكن ليس على فبرونيكتين

تعتبر HL-60 خلايا "بكرات" معيار الذهب لأنها تعبر عن مجموعة متنوعة من بروابط صاروخ موجه، بما في ذلك بروابط المتداول P-SEL بروتين سكري يجند-1 (PSGL-1) وSialyl لويس العاشر (SLEX) 5،14 (الشكل 1A ). بروتين السطح PSGL-1 بمثابة سقالة للSLEX رباعي السكريد، والتوسط التفاعل محددة مع P-E وقانون حالة الطوارئ، والتي تصل التنظيم على البط...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة الناجحة من العلاج القائم على الخلية الخارجية هو عدم القدرة على تقديم الخلايا بكفاءة إلى مواقع الإصابة والتهاب ذات كفاءة عالية engraftment 3. يمثل المتداول خلية خطوة حاسمة في عملية صاروخ موجه الخلية، وتسهيل تباطؤ الخلايا على جدران الأوعية الدموية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى التصاق شركاتهم والتهجير من خلال البطانة في الأنسجة 5. فهم أفضل لعملية المتداول لأنواع الخلايا المرشح قد تؤدي إلى تطوير تقنيات لتعزيز صاروخ موجه الخلا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت الخلايا CHO-P هدية عينية من الدكتور باربرا Furie (مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي، كلية الطب بجامعة هارفارد). وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة HL095722 منحة لJMK وأيد هذا العمل أيضا في جزء من جائزة التحدي مؤسسة سرطان البروستاتا لMovember-JMK

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة للرئة البشريةLonzaCC-2527
P-selectin التي تعبر عن خلايا مبيض الهامستر الصينية (CHO-P)هدية لطيفة من الدكتورة باربرا فيوري11،12< / sup>
HL-60 خلاياATCCCCL-240
<قوي>كواشف ثقافة الخلية< قوي>
القاعدي المتوسطلونزاCC-3156
EBM-2 MediaLonzaCC-3156
المكملات الغذائية القاعديةLonzaCC-4147
EGM-2 MV SingleQuotsLonzaCC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1xGibco12440
F-12 (1x) خليط المغذيات (لحم الخنزير)Gibco11765-054
بنسلين ستربتومايسين (P / S)جيبكو15140
L-Glutamine (L / G) 200 مليجيبكو25030
مصل الأبقار الجنينية (FBS)أطباق Atlanta BiologicalsSa550
PetriDishes BD FalconBD-353003
طبق زراعة الخلايا 100 مم ، البوليسترين
المعالج بزراعة الأنسجةأنابيب الطرد المركزي (أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين سعة 15 مل)قوارير MedSupply PartnersTC1500
T75محلول الجيلاتين BD Falcon353136
(2٪)SigmaG1393
dPBS (بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم) محلولSigmaD8537
Trypsin-EDTA (10x)SigmaT4174
<قوية >أجسام مضادة< قوية>
مضادة للسيليكتين / CD62ER & D SystemsBBA21
FITC الماوس المترافق IgG1< / sub>R & D SystemsBBA21
Anti-hP-SelectinR & D SystemsBBA34
FITC الماوس المترافق IgG1R & D أنظمةBBA34
FITC ماوس IgG & خجول ؛ 1 & كابا; التحكم في النمط المتشابهBD Bioscience555748
Anti-SLeX / CD15s Ab ، استنساخ: 5F18سانتا كروزSC70545
FITC مترافقسانتا كروزSC70545
الماوس العادي IgM-FITC التحكم في النمط النظيريسانتا كروزSC2859
PE ماوس مضاد للإنسان CD162 ، استنساخ: KPL-1BD Pharmingen556055
PE Mouse IgG 1< / sub > k التحكم في النمط المتشابهBD Pharmingen550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4) سانتاكروزSC19996
Anti-E-Selectin Ab ، استنساخ P2H3MilliporeMAB2150
ماوس IgG 1 < / sub > التحكم في النمط المتشاحيسانتا كروزSC3877
<قوي>كواشف أخرى < / قوي>
مؤتلف البشري TNF-alphaPeproTech300-01A
مجموعة تكاثر الخلايا التبعية CFSE - لقياس التدفق الخلويInvitrogenC34554
البشري P-selectin-FC البروتين المؤتلفR & D Systems137-PS-050
الإنسان E-selectin-FC البروتين المؤتلفR & D Systems724-ES-100
Fibronectin Human ، PlasmaInvitrogen33016-015
Equipment< / strong>
Bioflux 1000Fluxion BiosciencesBioflux Montage كان البرنامج المستخدم لإجراء التجارب وتحليل البيانات
BioFlux 48-well platesFluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow كان مقياس الخلويBD BioscienceCFlow Plus هو البرنامج المستخدم لإجراء التجارب وتحليل البيانات
Nikon Eclipse Ti-SNikon
CoolSnap HQ2 CCD CameraPhotometrics
البطاني البطانية المتوسطة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
  2. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
  3. Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
  4. Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
  5. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
  6. Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
  7. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
  8. Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9(2001).
  9. Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
  10. Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644(2009).
  11. Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
  12. Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
  13. Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
  14. Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
  15. Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
  16. Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
  17. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
  18. Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
  19. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
  20. Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
  21. Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
  22. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009(2009).
  23. Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
  24. Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
  25. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
  26. Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
  27. Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
  28. Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  29. Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
  30. Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
  31. Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
  32. Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
  33. Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
  34. Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
  35. Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
  36. Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell RollingMicrofluidic SystemHL 60 CellsP SelectinE SelectinTNF AlphaEndothelial CellsShear FlowRolling VelocityParallel Plate Flow Chamber

Related Articles