ثقافة معزولة الأنسجة الطابق بلور وإنتاج مشروطة متوسطة لتقييم خصائص وظيفية من الطابق إشارات اطلاق سراحهم لوحة

ملخص

لوحة الكلمة هو بنية حاسمة من وضع الحبل الشوكي، وتوفير إشارات إنتشاري إلى الأسلاف والتفريق الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة لإنتاج لوحة الطابق مكيفة المتوسطة، لتطبيقه على أنسجة الحبل الشوكي الطازجة، وتقييم العواقب على البروتينات من الاهتمام من خلال الكيمياء الحيوية.

الملخص

خلال التنمية، والأسلاف والخلايا العصبية بعد الإنقسامية تلقي إشارات من الأراضي المجاورة التي تنظم مصيرهم. في لوحة الكلمة هو مجموعة من الخلايا الدبقية بطانة القناة البطانة العصبية في موقف بطني. في لوحة تعبر عن الكلمة morphogens الرئيسية المساهمة في الزخرفة الأنساب الخلايا في الحبل الشوكي. في مراحل النمو في وقت لاحق، والكلمة لوحة ينظم الملاحة من محاور عصبية في الحبل الشوكي، التي تعمل كحاجز لمنع عبور المحاور المماثل وعبور خط الوسط السيطرة من قبل المحاور صواري ^1. يتم تحقيق هذه المهام من خلال إفراز العظة التوجيه المختلفة. بعض هذه الإشارات بمثابة جاذبة وطارد للمحاور المتزايد في حين أن آخرين تنظيم مستقبلات التوجيه وإشارات المصب لتعديل حساسية المحاور إلى العظة التوجيه المحلي ^2،3. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح بالتحقيق في خصائص الكلمة لوحة إشارات المشتقة في مجموعة متنوعة من ديفيسياقات lopmental، استنادا إلى إنتاج المتوسطة الطابق بلايت مكيفة (FP ^{سم) و 4-6.} نحن بعد ذلك مثالا على استخدام هذا FP ^سم في سياق توجيهات محوار. أولا، يتم عزل الحبل الشوكي من جنين فأر في E12.5 ويتم تشريح لوحة الكلمة من وزراعتها في مصفوفة البلازما الثرومبين (الشكل 1). في وقت لاحق الثانية يومين، يتم تشريح الأنسجة صواري خروج من أجنة E12.5، المسحوقة وتتعرض لFP ^سم. الثالثة، تتم معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية من علامات صواري.

المقدمة

في لوحة الأرض هي مركز الزخرفة المعروفة من الحبل الشوكي النامي، ولعب دورا رئيسيا في تحديد الأسلاف والأنساب خلية تالية للتفتل والسيطرة على محور عصبي الملاحة ^7،8. إجراء التجارب وصفها هنا لإنتاج FP ^سم يسمح للمحققين لتقييم الخصائص الفنية للإشارات المشتقة من الكلمة لوحة في سياقات مختلفة من العمليات التنموية، من الزخرفة الخلية والبقاء على قيد الحياة إلى الخلية والهجرة محور عصبي.

لتوضيح استخدام هذه FP ^سم، يتم تشريح الأنسجة الحبل الشوكي الظهري تحتوي على الخلايا العصبية صواري، dilacerated وحفز مع FP ^سم. ويمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية. وهذا يسمح التحقيق أنظمة آلية التوجيه محوار بواسطة الكلمة لوحة إشارات الافراج عنهم. طريقة العلاج من الأنسجة الطازجة dilacerated يحمل ميزة كبيرة للحفاظ على المكروية من الخلايا داخل اله الأنسجة. وبالتالي يتم تقييم الآثار المترتبة على العلاج FP ^سم أو أي نوع من أنواع العلاج بطريقة أكثر من الفسيولوجية في الخلايا وظروف زراعة الأنسجة.

البروتوكول

DAY 1

1. تشريح الحبل الشوكي الدور لوحة (FP) من E12.5 أجنة الفئران

ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء بأكمله استخدام ظروف معقمة. فمن الأفضل لإجراء تشريح تحت غطاء تشريح لتجنب التلوث. يجب تنظيف السطح من هود مع الايثانول. يجب تعقيم جميع الأدوات تشريح ويوضع في طبق بتري معقمة. السوائل (المتوسطة، تشريح المتوسطة) يجب أن تبقى مغلقة ووضعها في حمام جليدي. وينبغي جمع كل جنين في انخفاض الطازجة الفردية. هذا مهم للحفاظ على الأنسجة. يتم إجراء تشريح مع دومون # 5 ملقط. لنقل الأجنة بين الأطباق، وقبضة الحبل السري أو رئيس دون أي ضرر على الدماغ المؤخر. فمن الأهمية بمكان عدم تلف الحبل الشوكي لاستكمال تشريح بنجاح. إعداد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، محلول الملح الباردة هانك المتوازن (HBSS) -6.5٪ الجلوكوز ودرجة حرارة الغرفة المتوسطة Neurobasal.

1.1 تشريح الحبل الشوكي

يتم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المركز الوطني للبحوث العلميه التالية التوجيهات الأوروبية. طريقة القتل الرحيم هو خلع عنق الرحم، وتتكون من الضغط على رقبته وخلع العمود الفقري من الدماغ. ينصح بهذا الأسلوب لنماذج حيوانية الماوس، ويمكن أن يؤديها في وسيلة سريعة وفعالة.

1. الموت ببطء ماوس حاملا في E12.5 من الحمل (E0.5 = حصيرة اليوم الأول التالي). ضع الماوس الجانب بطني حتى.
2. نقع البطن مع الايثانول 70٪. قرصة جلد البطن مع ملقط أدسون وقطع طريق الجلد وطبقات البريتوني مع مقص جراحي. إجراء شق واستخدامها لقطع على جانبي الماوس لفضح تجويف البطن.
3. سلسلة من الأجنة موجود على كل جانب من الفأرة. فهم قرن واحد من يوتRUS في الأنسجة بين اثنين من الأجنة وتشريح بها بدءا من الجزء الخارجي. نقل الرحم سليمة إلى 100 ملم طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
4. استخراج الأجنة من أنسجة خارج الجنينية. فهم نسيج المشيمة (باللون الأحمر الداكن) مع اثنين من أزواج من ملقط وسحب بهدوء لتمزيق الأنسجة وإزالة الأجنة من الكيس الرحم.

ملاحظة: للحصول على أفضل الحفظ، وجمع الأجنة من الرحم الكيس بهم واحدا تلو الآخر.

5. تتم الخطوات التالية تحت العدسة المكبرة مجهر التشريح وغطاء محرك السيارة. وضع الجنين واحد في قطرة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
6. باستخدام ملقط، قطع رأس الجنين.

ملاحظة: قص بين الفك السفلي والدماغ المؤخر، والجزء الخلفي من الدماغ المؤخر المهم للخطوات المقبلة.

7. وضع وجهه بطني الجنين إلى أسفل مع الجزء الأمامي تواجه المجرب.
8. قرصة الجلدالجنين مع زوج واحد من ملقط ومع الزوج الآخر سحب بعيدا الجلد.

ملاحظة: هذه الخطوة لابد من تكرار حتى تتم إزالة الجلد تماما من الجزء الأمامي من الجنين.

9. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليسار. مع واحد ملقط "ماهيتها" الجنين في الجزء الأمامي. مع ملقط الأخرى انتزاع الجلد وسحب نحو الجانب منقاري من الجنين. الحبل الشوكي يمكن الوصول إليه ذلك الحين.
10. استخدام جانب واحد من ملقط لقطع السحايا التي لا تزال التفاف الحبل الشوكي. الحبل الشوكي مفتوح الآن.
11. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليمين.
12. فصل الأنسجة من الحبل الشوكي بدءا من الجانب عنق الرحم للجنين. حرك ملقط تحت الحبل الشوكي (ينبغي أن تعقد ملقط مغلقة لتجنب الضرر الحبل الشوكي). ملقط يجب أن تكون مرئية تحت الحبل الشوكي. الحركات تدويرية صغيرة تحت الحبل الشوكي هي كافية لفصلالأنسجة المحيطة والعقد الجذرية الظهرية (DRG).

ملاحظة: ترك الأنسجة المحيطة المرفقة تضيف وزنا إلى الحبل الشوكي، وبالتالي زيادة احتمال كسرها خلال الخطوة التالية.

13. وضع الحبل الشوكي معزولة في قطرة جديدة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
14. وضع الحبل الشوكي في وضع مسطح، والسحايا على الجانب العلوي والأمامي بعيدا عن المجرب.
15. "دبوس أسفل" النخاع الشوكي باستخدام الدماغ المؤخر المتبقية مع ملقط واحد، والثانية مع ملقط انتزاع السحايا. تقشر السحايا بدءا من الجانب منقاري من الحبل الشوكي.

ملاحظة: يجب أن تكون الحركة بطيئة وثابتة لتجنب أي كسر من الحبل الشوكي. يمكن الحركات الاهتزازية تسهيل مفرزة من السحايا.

1.2 FP تشريح

1. قرصة الدماغ المؤخر مع ملقط واحد.
2. وFP هو الهيئة المركزيةجزء nsparent من الأنسجة. باستخدام مشرط قطع لوحة الكلمة.

ملاحظة: لخفض كلا الجانبين بنفس الجودة، بدء من الجانب منقاري وبالتناوب قطع الجانب الأيمن والجانب الأيسر من لوحة الكلمة.

3. الحفاظ على FP تشريح في المتوسطة Neurobasal في درجة حرارة الغرفة.

2. FP الثقافة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود. استخدام متوسطة جديدة وملاحق إذابة طازجة والكواشف. إعداد coverslips معقمة الزجاج، neurobasal دافئ + B27، والبلازما، وHBSS-الثرومبين.

2.1 الثقافة FP

1. وضع عدة coverslips العقيمة في طبق بتري 100 ملم وماصة 20 ميكرولتر البلازما في وسط كل ساترة.
2. نقل 2-4 FP في كل قطرة البلازما وإضافة 20 ميكرولتر HBSS-الثرومبين بجانب انخفاض البلازما وتخلط بعناية. إبقاء لل coverslipsمدة لا تقل عن عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح التخثر للبلازما.

ملاحظة: نقل اثنين من ضباط في حالة تشريح كاملة وأكثر من ذلك في حالة تشريح جزئية. مزيج ببطء مع طرف ماصة وتجنب الاتصال مع إإكسبلنتس FP.

الجلطة البلازما تتراجع بضعة ميكرومتر كعلامة من التخثر. يجب ألا توقف تخثر قبل الأوان، لتجنب مفرزة من تجلط البلازما.

3. نقل كل ساترة في 24 لوحة جيدا وإضافة 500 ميكرولتر من Neurobasal + B27. احتضان 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.

DAY 3

3. FP مكيفة متوسطة (FP ^سم) حصاد

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ حصاد تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود. إذا طاف الملوثة أو إذا وحات الطابق تطفو (بمعنى أنها قد لقوا حتفهم خلال شبه الثقافةالتطوير التنظيمي) ثم لا حصاد FP ^{سم من} هذه البئر.

3.1 ^سم FP الحصاد

1. حصاد بعناية متوسطة من كل بئر.

ملاحظة: لا ماصة للبلمرة مزيج البلازما الثرومبين أو أي شظايا FP.

2. تخزين 100 ميكرولتر مأخوذة في -80 درجة مئوية.

DAY 4

4. تشريح الحبل الشوكي الخلايا العصبية صواري من E12.5 أجنة الفئران

ملاحظة: لا يحتاج هذا المستحضر الذي سيتم تنفيذه تحت ظروف معقمة. اتبع الإجراء الموضح أعلاه لجمع الأجنة. إعداد برنامج تلفزيوني الباردة، الباردة HBSS 6.5٪ الجلوكوز وneurobasal الباردة.

4.1 تشريح الحبل الشوكي

1. باستخدام ملقط، قطع رأس الجنين.

ملاحظة: قص بين الفك السفلي والدماغ المؤخر، والجزء الخلفي من الدماغ المؤخر المهم للالخطوات المقبلة.

2. وضع الوجه لأسفل بطني الجنين في قطرة جديدة مع الجزء الأمامي تواجه المجرب.
3. قرصة جلد الجنين مع واحد ملقط ومع الآخر سحب بعيدا الجلد.

ملاحظة: هذه الخطوة لابد من تكرار حتى تتم إزالة الجلد تماما من الجزء الأمامي من الجنين.

4. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليسار. مع واحد ملقط "ماهيتها" الجنين في الجزء الأمامي. مع ملقط الأخرى، فهم الجلد وسحب نحو الجانب منقاري من الجنين، لفضح الحبل الشوكي.
5. استخدام جانب واحد من ملقط لقطع السحايا التي لا تزال التفاف الحبل الشوكي. يتعرض الحبل الشوكي الآن ومفتوحة.
6. وضع الجانب الأمامي الجنين إلى اليمين.
7. فصل الأنسجة من الحبل الشوكي بدءا من الجانب عنق الرحم للجنين. حرك ملقط تحت الحبل الشوكي (الحفاظ على ملقط مغلقة). إلىيجب الفطر الابيض مرئية تحت الحبل الشوكي. الحركات تدويرية صغيرة تحت الحبل الشوكي تكفي لفصل الأنسجة المجاورة والعقد الجذرية الظهرية (DRG).
8. نقل النخاع الشوكي معزولة في قطرة جديدة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
9. وضع الحبل الشوكي في وضع مسطح، والسحايا على الجانب العلوي والأمامي بعيدا عن المجرب.
10. "دبوس أسفل" النخاع الشوكي باستخدام الدماغ المؤخر المتبقية مع ملقط واحد، مع ملقط الثاني انتزاع السحايا. تقشر السحايا بدءا من الجانب منقاري من الحبل الشوكي.

4.2 صواري عصبون تشريح

1. قرصة الدماغ المؤخر مع ملقط واحد.
2. توجد الخلايا العصبية صواري في الجزء الأكثر الجانبي للحبل الشوكي (الجانب الظهري). قطع هذا الجزء الجانبي مع مشرط الغرامة.

ملاحظة: الجزء الظهري في النخاع الشوكي يمكن تمييزها عن الجزء البطني من قبل الفرق من الخلايا دensity، والجزء البطني كونها أكثر غموضا.

ملاحظة: لخفض كلا الجانبين بنفس الجودة، بدء من الجانب منقاري وبالتناوب قطع صغيرة من طول الجانب الأيمن والجانب الأيسر.

3. الحفاظ على الأنسجة تشريح في المتوسطة Neurobasal على الجليد للاستخدام الفوري.

5. علاج الأنسجة صواري مع FP ^سم

ملاحظة: لا يتطلب هذا الإجراء ظروف معقمة. وينبغي جمع الأنسجة في الفرد 1.5 مل أنابيب. يجب استخدام المجمدة FP ^سم مرة واحدة فقط. تجنب عن تجميد متعددة. إعداد الحارة FP ^سم (37 درجة مئوية).

5.1 العلاج من الخلايا العصبية صواري

1. Dilacerate الأنسجة صواري مع مقص صغير.

ملاحظة: قص الأنسجة صغيرة قدر الإمكان، إلى تحفيز إمكانية الوصول إلى الخلايا.

2. التوزيع العادل الأنسجة بين التجريبية المختلفة العلاج الظروف تحكم وFP ^سم العلاج.
3. أجهزة الطرد المركزي شظايا الأنسجة في 800 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
4. التحقق من إعادة تقسيم بين الأنابيب.

ملاحظة: إذا كان لإعادة توزيع اللازمة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى حتى شظايا موزعة بالتساوي.

5. إزالة طاف.
6. إضافة ^سم والسيطرة العلاجات FP الحارة إلى الأنسجة.

ملاحظة: يجب أن يتم تعديل حجم لكمية من بيليه وينبغي أن يكون على الأقل ضعف حجم بيليه.

7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ملاحظة: بلطف يهز كل 10-15 دقيقة

8. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة العلاج.
9. إضافة العازلة تحلل

ملاحظة: يجب أن يتم تعديل مستوى الصوت إلى لجبل بيليه وينبغي أن يكون على الأقل ضعف حجم بيليه.

10. ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend بيليه.

ملاحظة: يمكن أن تستخدم أيضا لدوامة.

11. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
12. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
13. إبقاء طاف وقياس كمية البروتين مع مقايسة برادفورد ^9.
14. إضافة 6X Laemmli العازلة.
15. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد محتوى البروتين.

ملاحظة: عينات يمكن استخدامها على الفور أو يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية.

16. تقييم آثار العلاج بواسطة لطخة غربية ^10.

ملاحظة: 50 ميكروغرام من مجموع البروتينات على الأقل يجب أن يتم تحميل لكل حارة.

النتائج

تم علاج الأنسجة صواري من قبل FP ^سم وتمت معالجة العينات لتحليل مستويات مستقبلات في لطخة غربية. وقد تبين تطبيق FP ^سم إلى زيادة مستويات مستقبلات التوجيه، PlexinA1، التي تتوسط حساسية المحاور صواري لخط الوسط طارد Semaphorin3B بعد عبور (الشكل 2). وكشف هذا أن الإشارات الصادرة عن FP تنظيم مستويات PlexinA1 ^4،6.

المناقشة

إنتاج الأرض وحة مكيفة المتوسطة يوفر وسيلة فعالة وسهلة لتقييم الخصائص البيولوجية لوحة الطابق إشارات الافراج عنهم.

مصفوفة البلازما الثرومبين يوفر حالة ممتازة للبقاء الأنسجة. ومع ذلك، هذه البيئة المخصب قد يكون وجود قيود لبعض أنواع التجارب. وبالتالي، يمكن أيضا الأنسجة الكلمة لوحة زراعتها في مصفوفة الاغاروز. ويمكن تقييم نوعية الكلمة لوحة مكيفة المتوسط ​​عن طريق الكشف عن أرضية لوحة الإشارات المعروفة المفرج عنهم، مثل GD...

المواد

_{2< / sub> ، التحكم في الرطوبة) < / td > < td >< / td > < tr >}وصفات < / strong >< / td > < / tr > < td colspan = "2" >FP ثقافة الوسائط< / إم >< / td > < / tr > < td >B27 < / td > < td > 1 / 50e التخفيف من المخزون < / td > < / tr > < td colspan = "2" >HBSS-thrombin < / em> < / TD > < / tr > < td >HBSS < / td > < td > 1 مل < / td > < tr > < td > thrombin 10 mg / ml < / td > < td > 30 & mu ؛ l< / td > < / tr > < td colspan = "2" > المخزن المؤقت للتحلل الرقم الهيدروجيني 7،4 < / em>< / td > < / tr > < td > EDTA (درجة الحموضة 8) < / td > < td > 5 mM < / td> < / tr > < td > MgCl _{2 < / sub > < / td > < td > 1 mM < / td > < / tr >} < td > الجلسرين < / td > < td > 10٪ < / td > < tr > < td > IGEPAL (NP40) < / td > < td > 0.10٪ < / td > < / tr >< tr> < td > Sodium Orthovanadate < / td > < td > 0.2 M < / td > < / tr > < td > تريس 0.5 م ، درجة الحموضة 6,8 < / td > < td > 375 mM < / td > < tr > < td > SDS< / td > < td > 6٪ < / td > < tr > < td > Glycerol < / td > < td>60٪ < / tbody > < / table>

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>الكواشف المطلوبة< / قوي>
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS ، Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>- خالي	من Invitrogen	14170-088
الجلوكوز	سيجما	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
البلازما	سيجما	P-3266	1 مجم / مل (إعادة التكوين في H2< / sub>O والترشيح)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 مجم / مل (إعادة التكوين في H2< / sub>O والترشيح)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 جم / مول)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M ، درجة الحموضة 8
MgCl 2< / sub>	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الكاملة	Roche	04 693 116 001
أورثوفانادات الصوديوم (Na3< / sub>VO4< / sub>)	Sigma	S-6508
المقطر H 2< / sub>O
<قوي>الجدول 1. < / strong>
tools and materials< / strong>
مقص جراحي	أدوات العلوم الدقيقة	14002-12
ملقط Adson	أدوات العلوم الدقيقة	11027-12
Dumont # 5 ملقط النصائح الدقيقة	أدوات العلوم الدقيقة	11254-20
أدوات العلوم الدقيقة	Microknives	10136-14
الجدول 2. الأدوات والمواد. < / strong>
< table border = "1" >
تشريح وثقافة FP < / em >< / td > < tr >
الإيثانول 70٪ < / td > < td >< / td > < >
جهاز طرد مركزي < / td > < td >< / td > < / tr >
Neurobasal < / td > < td >< td > < tr >
HEPES (260 جم / مول) < / td > < td > 25 ملم < / td > < / tr >
كوكتيل مثبط البروتياز < / td > < td > 1x < / td > < / tr >
H 2 < / sub > O< / td > < td >< td > < tr >
Laemmli Buffer < / em >< / td > < / tr >
DTT	0.6 M
Bromophenol blue
H2O

< td > غطاء محرك السيارة < / TD > < TD >< / TD> < / tr > < td > مجهر تشريح < / td > < td >< / td > < tr > < td > أطباق بتري < / td > < td >< / td > < / tr > < td > أغطية زجاجية < / TD > < TD > 18 مم × 18 مم < / TD > < / tr > < TD> موقد غاز بنسن < / td > < td >< / td > < / tr > < td > 24 بئر لوحة < / td > < td >< / td > < tr > < td > حاضنة ثقافة الأنسجة (37 درجة ؛ C ، 5٪ CO < td colspan = "2" >