يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصميم بروتين الحرير الحرير المواد سبيكة للتطبيقات الطبية الحيوية

17.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50891

⸱

أغسطس 13, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

في هذه المقالة

ملخص

المزج هو نهج فعال لتوليد الحيوية مع مجموعة واسعة من الخصائص والميزات مجتمعة. من خلال التنبؤ التفاعلات الجزيئية بين مختلف بروتينات الحرير الطبيعي، والحرير، والحرير البروتين منصات سبيكة جديدة مع مرونة الانضباطي الميكانيكية والكهربائية الاستجابة والشفافية البصرية، للتجهيز الكيميائية والتحلل البيولوجي، أو الاستقرار الحراري يمكن تصميم.

الملخص

عرض البروتينات الليفية متواليات والهياكل المختلفة التي استخدمت لمختلف التطبيقات في مجالات الطب الحيوي مثل أجهزة الاستشعار، لطب النانوي، وتجديد الأنسجة، وتسليم المخدرات. والمواد على أساس التفاعلات المستوى الجزيئي بين هذه البروتينات تساعد على توليد تصميم متعدد الوظائف الحيوية سبيكة البروتين جديدة ذات خصائص الانضباطي. كما توفر هذه النظم المواد سبائك المزايا بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية التقليدية بسبب التحلل البيولوجي المواد، توافق مع الحياة، وtenability في الجسم. استخدمت هذه المادة يمزج بروتين الحرير البري التوسة دودة (Antheraea pernyi) والحرير والتوت المحلي (Bombyx موري) كمثال لتوفير بروتوكولات مفيدة حول هذا الموضوع، بما في ذلك كيفية التنبؤ البروتين البروتين التفاعلات بالطرق الحسابية، وكيفية إنتاج سبائك البروتين الحلول، وكيفية التحقق من أنظمة سبائك بواسطة التحليل الحراري، وكيفية افتعال السبائك متغيربما في ذلك المواد البصرية مع حواجز شبكية حيود والمواد الكهربائية مع الدوائر الطلاء، والمواد الصيدلانية لإطلاق المخدرات والتسليم. يمكن لهذه الأساليب أن توفر معلومات هامة عن تصميم الجيل القادم متعددة الوظائف الحيوية استنادا سبائك بروتين مختلفة.

المقدمة

خلقت طبيعة الاستراتيجيات لتوليد مصفوفات بيولوجية الانضباطي ومتعددة الوظائف باستخدام عدد محدود من البروتينات الهيكلية. على سبيل المثال، تستخدم دائما المرنين والكولاجين في الجسم الحي معا لتوفير القوة قابلة للتعديل والمهام المطلوبة لأنسجة معينة 1،2. المفتاح لهذه الاستراتيجية هو المزج. يتضمن مزج خلط البروتينات مع نسب محددة وهو نهج التكنولوجي لتوليد مواد بسيطة مع أنظمة الانضباطي وخصائص متنوعة 3-5. مقارنة مع 6،7 استراتيجيات الهندسة الاصطناعية، ويمكن مزج أيضا تحسين التوحيد المادية والقدرة على معالجة المواد نظرا لسهولة التشغيل 8-16. لذا، وتصميم متعددة الوظائف، حيويا السبائك البروتين هو المجال الناشئ للبحوث الطبية. وهذه التكنولوجيا أيضا أن توفر المعرفة المنهجية لتأثير مصفوفات البروتين الطبيعية على وظائف الخلايا والأنسجة في كل من فيتامينريال عماني والحية 10،17. عن طريق تحسين واجهات الجزيئية بين مختلف البروتينات، يمكن السبائك القائم على البروتين تشمل مجموعة من الوظائف الجسدية، مثل الاستقرار الحراري عند درجات حرارة مختلفة، ومرونة لدعم الأنسجة المختلفة، والحساسية الكهربائية في أجهزة متغيرة، والخصائص البصرية للتجديد الأنسجة القرنية 3، 18-27. ونتائج هذه الدراسات توفر منصة المواد البروتينية جديدة في مجال العلوم الطبية الحيوية ذات الصلة المباشرة إصلاح الأنسجة الانضباطي وعلاجات المرض وتؤدي إلى مزيد من زرع الأجهزة القابلة للتحلل حيث الميزات العلاجية والتشخيصية الجديدة التي يمكن تصور 3.

العديد من البروتينات الهيكلية الطبيعية لها خصائص الفيزيائية والحيوية النشطة الحرجة التي يمكن استغلالها كمرشحين للمصفوفات بيولوجية. الحرير من دودة الأنواع المختلفة، keratins من الشعر والصوف، المرنين والكولاجين من الأنسجة المختلفة، ومختلف البروتينات النباتية هي بعض من البروتينات الهيكلية الأكثر شيوعا التي تستخدم لتصميم المواد القائمة على البروتين متغيرة (الشكل 1) 18-27. بشكل عام، يمكن لهذه البروتينات شكل مختلف الهياكل الجزيئية الثانوية (على سبيل المثال، وصحائف بيتا الحرير، أو لفائف ملفوف لkeratins) بسبب فريدة من نوعها المتكررة الأساسي سلاسل الأحماض الأمينية 3،28-35. هذه الميزات تشجيع تشكيل الهياكل العيانية الذاتي تجميعها مع وظائف فريدة من نوعها في واجهات البيولوجية مما دفع فائدتها كمورد عزيز مواد البوليمر الحيوي. هنا، تم استخدام نوعين من البروتينات الهيكلية (البروتين من الحرير التوسة دودة البرية والمستأنسة البروتين B من الحرير التوت كمثال) لإظهار البروتوكولات العامة لانتاج مختلف المواد الحيوية سبيكة البروتين. وتشمل البروتوكولات أظهرت جزء 1: توقعات التفاعل البروتين والمحاكاة، جزء 2: إنتاج حلول سبيكة البروتين، وجزء 3: تصنيع سبائك البروتينالنظم والتطبيقات البصرية والكهربائية، والأدوية.

figure-introduction-1
الرقم 1. المواد الخام من البروتينات الهيكلية المختلفة التي يشيع استخدامها في المختبر لدينا لتصميم المواد القائمة على البروتين، بما في ذلك الحرير من دودة الأنواع المختلفة، keratins من الشعر والصوف، المرنين من الأنسجة المختلفة، ومختلف البروتينات النباتية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التنبؤ تفاعلات البروتين

  1. تحليل Bioinfomatics من جزيئات البروتين
    1. زيارة المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية موقع (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)، والبحث في أسماء البروتين التي سيتم استخدامها لدراسة سبيكة. ملاحظة: بالنسبة لهذا المثال، تم استخدام اثنين من البروتينات: البروتين A، وهو التوسة دودة الحرير البري فبروين، والبروتين B، وهو فبروين التوت الحرير المحلي. للبروتين A، تسلسل الأحماض الأمينية يمكن العثور عليها في "فبروين [Antheraea pernyi] بنك الجينات: AAC32606.1" (Antheraea pernyi هو الصينية (البلوط) التوسة دودة فراشة). للبروتين B، تسلسل الأحماض الأمينية يمكن العثور عليها في "فبروين السلسلة الثقيلة السلائف [Bombyx موري] NCBI المرجعي تسلسل: NP_001106733.1" و "فبروين سلسلة ضوء السلائف [Bombyx موري] NCBI المرجعي تسلسل: NP_001037488.1" معا (Bombyx موري هو المستأنسة من دودة القز شجرة التوت).
    2. حدد وسالقد تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين A و B بروتين من قاعدة البيانات.
    3. زيارة الموقع ExPASy (SIB على الموارد المعلوماتية الحيوية البوابة) (www.expasy.org) أو استخدام غيرها من البرمجيات التجارية لحساب bioinfomatics بيانات أساسية من البروتينات بناء على تسلسلها بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، تهمة الإجمالي لكل جزيء، مؤشر للا مائية لل الجزيء، منحنى المعايرة من الجزيئات في قيم درجة الحموضة المختلفة، الخ هذه المعلومات سوف تستخدم كعناصر أساسية لمحاكاة حاسوبية للتفاعلات البروتين، وسوف تساعد على فهم ما إذا كانت هذه البروتينات هما تفاعلات قوية. [ملاحظة: هذه الخطوة ليست للتنبؤ بدقة كل التفاصيل من التفاعل البروتين مثل تلك المستخدمة في الببتيدات صغيرة أو وظيفية العلوم البروتينات. والغرض من هذا القسم هو فقط لتجنب إنتاج خليط البروتين مع فصل macrophase واضحة والتي لا يمكن أن يسمى "سبيكة" المواد. وبالتالي، يمكن أن يكون تقدير تقريبي ولكن اليمكن التحقق من البريد النظام سبيكة البروتين عن طريق المنهج التجريبي هو موضح في الخطوة 3.1 باستخدام التحليل الحراري الدقيق].
  2. المحاكاة الحاسوبية من البروتين نظام سبيكة
    أدناه يوصف إجراء لمحاكاة نظام سبائك البروتين. هو مكتوب برنامج المحاكاة في لغة البرمجة C التي يمكن استخدامها على نظام كمبيوتر واحد أو متعدد المعالجات. تم استخدام شعرية الربيع الكتلة (LSM) نموذج لمحاكاة سبائك البروتينات 36-39. نموذج LSM يعطي وصف بسيط من القوة الصافية على كتلة عندما تعلق على الربيع ويمكن للمرء أن يحل معادلة القوة لفهم الحركة لكل كتلة. خوارزمية برنامج بسيط لنموذج هذا النظام سبيكة البروتين باستخدام نموذج LSM تعطى على النحو التالي:
    1. يمثل بروتين واحد كما الجسيمات الخشنة الحبيبات التي لديها كتلة من م.
    2. استخدام Hookean أو الربيع الجدد Hookean لتمثيل السندات 38،39. طريق ربط عدد محدود من الجسيمات مع الينابيع، يمكن للمرء مأك مجال سبائك الفرعي الذي يمثل لبنة في بناء مستقر للسبائك البروتينات. لتمثيل أنواع مختلفة من السندات في الربط، داخل، استخدم مختلفة الثوابت الربيع / صلابة.
    3. نموذج النظام سبيكة البروتين كمادة مكونة من بخفوت-crosslinked سبائك الفرعية. مرة أخرى هنا استخدمت التصلب مختلفة لتمثيل سندات مختلفة بين الروابط المشتركة من سبائك الفرعية.
    4. نموذج كسر السندات وعملية الإصلاح من قبل بيل نموذج 40،41، يسمح السندات ضعيفة من خلالها إلى إصلاح ولكن روابط قوية لا يمكن إصلاح مرة واحدة تم كسر فيها. عندما شدد النظام بشكل كاف (سواء على السندات داخل suballoy وبين suballoy)، السندات يمكن كسرها وإصلاحه.
    5. من أجل دراسة آثار تشوه على سبائك البروتينات عندما أكد أنهم، وتطبيق قوى خارجية إلى النظام. توزيع هذه القوات بالتساوي على كل جسيم عندما حل معادلة القوة (قوانين نيوتن).
    6. لنمذجة التفاعلاتبين الحل (مثل جزيئات الماء) والبروتينات، وتطبيق قوة السحب إضافية أو قوة الاحتكاك إلى كل جسيم.
    7. حل معادلة القوة لكل الجسيمات مع تصرفات كل القوة (قوة فصل الربيع من السندات، وقوة خارجية، وقوة الاحتكاك).
    8. حساب واستخراج مواقف جزيئات البروتين بوصفها وظيفة من الزمن.
    9. حساب الكميات الفيزيائية التي تميز سبائك البروتينات من مواقف الجسيمات.
    10. تغيير صلابة السندات في البرنامج لفهم التفاعلات بين البروتينات المختلفة. (يتم احتساب متوسط ​​الصلابة السندات من معامل ويونغ من المواد البروتينية. معامل ويونغ من مختلف المواد البروتين الليفي يمكن الحصول إما عن طريق اختبار الشد العالمي 18، أو مباشرة من الأدبيات السابقة 2-4،18).

2. إنتاج البروتين حلول سبيكة

ويتم اختيار التوسة دودة الحرير البري (البروتين A) والحرير التوت المحلي (البروتين B) هنا كمثال على نظام سبائك البروتين. يعرض هذا البروتوكول أولا كيفية الحصول على حل البرية التوسة دودة الحرير (البروتين A).

  1. قطع الخام البرية شرانق الحرير التوسة دودة أو ألياف في وزن 3 غرام.
  2. قياس 3 غرام من بيكربونات الصوديوم أو كربونات الصوديوم (ملاحظة: إذا كنت تستخدم كربونات الصوديوم، والوزن الجزيئي للبروتين سلاسل سيقلل أثناء عملية الغليان 42).
  3. ملء كوب دورق 2 لتر مع الماء المقطر (H 2 O). ثم، ضع الدورق الزجاجي على مرحلة ساخنة، وتغطي بورق الألمنيوم، والحرارة لدرجة الغليان.
  4. إزالة غطاء رقائق الألومنيوم وبيكربونات الصوديوم إضافة يقاس ببطء في الماء المغلي، والسماح لها تذوب تماما. (ملاحظة: دور بيكربونات الصوديوم هو "الصابون" لتنظيف قبالة البروتينات القابلة للذوبان سيريسين وغيرها من الشوائب تعلق على السطح من ألياف الحرير البرية في حالة استخدام الغير.إيه ألياف البروتين الطبيعة، الرجاء اختيار العوامل الكيميائية المقابلة وفقا لأدب).
  5. إضافة ألياف البروتين الخام (ألياف الحرير البرية) في الماء المغلي ويترك ليغلي لمدة 2-3 ساعة (ملاحظة: الساعة الغليان له تأثير حاسم على الوزن الجزيئي للبروتين سلاسل 26،43 ينبغي للمرء اختيار الوقت المناسب وفقا إلى الأدب أو عن طريق إجراء التجارب تحكم 26،43. كما يمكن تعديل درجة حرارة الغليان للتأثير على الوزن الجزيئي للبروتين سلاسل 26،43،44).
  6. بعد الغليان، وإزالة بعناية ألياف بروتين مع ملعقة من الحل والضغط عليهم لإزالة الماء الزائد. (تنبيه: الألياف هي ساخنة جدا!)
  7. المقبل، تزج الألياف في دورق 2 لتر مع الماء المقطر البارد، وتغسل ألياف مرتين لمدة 30 دقيقة كل لإزالة بقايا نجس تماما من سطح الألياف. تجفيف الألياف في غطاء الدخان لمدة 12 ساعة على الأقل.
  8. تذوب 45.784 غرام من الكالسيوم أحمقمعدل (كا (NO 3) 2) في كوب من الزجاج لتشكيل السائل عند 65 درجة مئوية لإذابة الألياف بروتين الحرير البرية. (ملاحظة: إذا كنت تستخدم غيرها من الألياف بروتين طبيعي، حدد المقابلة المذيبات لإذابة البروتينات هنا يمكنك أيضا استخدام 9.3 M LiSCN LiBr أو الحل، أو حل فوسفات 85٪ للحل ألياف الحرير مختلفة.)
  9. الجمع بين الألياف والمذيب في نسبة 1 غرام من الألياف إلى 10 مل المذيبات. السماح للألياف بحل في 95 درجة مئوية لمدة 5 إلى 12 ساعة. (ملاحظة: الوقت حل يعتمد على الوزن الجزيئي للبروتينات 26،43-45)
  10. عن طريق الحقن، حقن محلول الحرير البري إلى 12 مل أشرطة غسيل الكلى (بحد أقصى 1،000 ميغاواط كحجم قطع) أو الأنابيب غسيل الكلى مختومة (بحد أقصى 1،000 ميغاواط كحجم قطع) وdialyze ضد 2 لتر من الماء المقطر. (ملاحظة: الحقن أكثر فعالية إذا الحفاظ على الحل عند 35 درجة مئوية، وإلا لزوجة محلول البروتين سوف تزيد بشكل كبير في درجة حرارة الغرفة). تغيير الماء المقطر في كثير من الأحيان لإزالة الكالسيوم (NO 3) 2 المذيبات في الحل (بعد 30 دقيقة، 2 ساعة، 6 ساعة، ثم كل 12 ساعة لمدة 3 أيام. في المجموع، سيكون هناك حوالي 8 التغيرات الماء).
  11. بعد 3 أيام، وجمع الحلول البروتين من أشرطة أو أنابيب غسيل الكلى والمكان الى 13،000 دورة في الدقيقة تصنيفا الأنابيب.
  12. أجهزة الطرد المركزي الحلول لمدة 1 ساعة على 3،500 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية 3X لإزالة رواسب. بعد كل تشغيل أجهزة الطرد المركزي، بسرعة سحب طاف في أنابيب جديدة. تخزين الحلول النهائية في 4 ° C الثلاجة.
  13. صب 5 مل من محلول البروتين في الصعود إلى polydimethylsiloxane (PDMS) الركيزة أو غيرها الركيزة مسعور مسطحة واتركه حتى يجف تماما (وهذا عادة ما يستغرق أكثر من 12 ساعة). تزن ما تبقى من الفيلم البروتين الصلبة وحساب تركيز المحلول النهائي من نسبة الوزن (ث / ت٪) = قياس الوزن (في ملغم) ÷ 5 (في مل) ÷ 10.
  14. جمع آخر من ألياف بروتين طبيعي المحدد (في هذه الاكاديميةه، تم استخدام المستأنسة الحرير التوت والبروتين B)، وكرر العملية أعلاه مع "صابون" المناسب وحل المذيبات، حتى يتم الحصول على حل للمياه البروتين النهائي مع تركيز قياسه. [ملاحظة: إذا كانت المواد البروتين في شكل مسحوق، واستخدام أنابيب أو الأغشية المسامية الملائمة لعقد عينات أثناء عملية "الصوبنة". إذا كان قد تم بالفعل تنقية البروتين، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.8 إلى حل المسحوق. إذا كان قد تم بالفعل تنقية البروتين وغير قابلة للذوبان المياه، وجعل محلول مائي مع تركيز المطلوب أولا ثم انتقل إلى الخطوة 2.15 أدناه لتقديم حلول مزيج البروتين.]
  15. تمييع ببطء على البروتين حل (الحل هنا الحرير البرية) في الماء المقطر عند 4 ° C لتشكيل البروتين 1.0٪ بالوزن محلول مائي. تفعل نفس العملية للبروتين B (الحرير هنا المستأنسة).
  16. مزيج ببطء البروتين 1٪ بالوزن الحل مع حل البروتين B في 4 ° C باستخدام ماصة لتجنب صrotein تجميع أثناء الخلط. (ملاحظة 1: لا تستخدم أداة دوامة خلط البروتينات لأن بعض البروتينات (مثل الحرير) ستشكل الهلاميات المائية خلال اهتزاز 46،47 ملاحظة 2: إذا كان ذلك ممكنا، استخدام أجهزة إضافية للسيطرة على نسبة الخلط والاختلاط صنع حجم تأكد من مزجها بطيئة قدر الإمكان لتجنب التجميع. لا ماصة بسرعة حل خلال الاختلاط).
  17. ينبغي أن يكون للحلول النهائية مزج نسبة كتلة محددة أو نسبة المولي من البروتين: البروتين B. عادة، ومزجها مع نسبة الجماعية ل90:10، 75:25، 50:50، 25:75، 10:90 للحصول على مجموعة واسعة من الحلول سبيكة. استخدام البروتين A و B بروتين حلول نقية والضوابط. للحصول على حل مزج مع نسبة المولي من البروتين: البروتين B = R: (100-R). حساب نسبة حجم الاختلاط (استنادا إلى نفس الحل 1٪ بالوزن) بواسطة: حجم A: حجم B = R · (MW من أ): (100-R) · (MW من B).
  18. يلقي الفور الحلول النهائية إلى PDMS ركائز لتشكيل الأفلام أو منتديات أخرىالمواد gned. (ملاحظة: عدم تخزين نسبة عالية من البروتين حلول سبيكة لفترة طويلة عن المجاميع قد شكل في وقت لاحق نظرا لتفاعلات البروتين البروتين في الماء). إذا لزم الأمر، وتمييع الحلول مزيج مع الماء المقطر الخالي من الأيونات والاحتفاظ بها في الثلاجة 4 ° C لتجنب تراكم بروتين إضافي في الحلول.

3. تصنيع البروتين المتغير المواد سبيكة

  1. تأكيد سبيكة التنبؤ بواسطة التحليل الحراري 3،9،31-35
    1. إعداد ركائز PDMS وتنظيفها عن طريق نقع في الماء المقطر.
    2. يلقي الحلول بروتين مزيج بنسب خلط مختلفة على ركائز PDMS.
    3. تجف الحلول لا يقل عن 12 ساعة في غطاء الكيميائية مع تدفق الهواء حتى تتشكل الأفلام (ملاحظة: استخدام نفس الحجم لحلول مختلفة حتى يتسنى للسمك من الأفلام يمكن أن تكون ثابتة).
    4. إزالة الأفلام سبيكة البروتين من ركائز PDMS ووضعها على أطباق نظيفة.
    5. تزن العديد من الفرق المسح الكالوري (DSC) المقالي الألومنيوم وأغطية للدراسة DSC. تطابق المقلاة وغطاء أزواج أن يكون لها الوزن الكلي يساوي (وزن زائد الوزن عموم من غطاء يساوي وزن ثابت). على سبيل المثال، استخدمت هنا بلغ مجموع وزنها وعموم غطاء 22.50 ملغ، وأعدت ثماني مجموعات من غطاء وعاء معا مع هذا الوزن الكلي.
    6. تغلف 6 ملغ لكل نوع من البروتين المجفف يمزج في المقالي DSC الألومنيوم وختم لهم مع أغطيتها مطابقة في عملية 3.1.5. ختم عموم فارغة وزوج وغطاء لاستخدامها مع عينة كمرجع بحيث لا السعة الحرارية للعينات نفسها سيتم تسجيلها خلال التحليل الحراري (ملاحظة: إن DSC مقارنة السعة الحرارية المرجعية مقلاة + غطاء مقابل أن من العينة + مقلاة + غطاء. نظرا لأوزان متساوية، سيتم احتساب القدرة الحرارة الخلفية من المقالي والأغطية لترك فقط السعة الحرارية للعينة في عموم).
    7. وضع إشارات مختومة والمقالي العينة إلى أداة DSC، معتطهير الجاف تدفق غاز النيتروجين من 50 مل / دقيقة، ومزودة بنظام التبريد المبردة. قبل قياسات العينات، ينبغي أولا معايرة الصك DSC مع الياقوت والإنديوم لتدفق الحرارة ودرجة الحرارة، على التوالي.
    8. قبل تشغيل DSC بمعدل التدفئة من 2 ك / دقيقة إلى 150 درجة مئوية ثم اضغط عند هذه الدرجة لمدة 15 دقيقة لإزالة أي جزيئات الماء المتبقية في عينات (عادة حوالي 3-10٪ من الوزن الكلي). تبرد بسرعة إلى أسفل (10 ك / دقيقة) إلى 25 درجة مئوية.
    9. تشغيل DSC مرة أخرى بمعدل التدفئة من 2 ك / دقيقة إلى 300 ° C، أو حتى في ذروة تدهور خلطات البروتين تظهر 34. تسجيل القدرات حرارة العينة البروتين في درجة حرارة مختلفة خلال هذه العملية. تهدئة DSC وتغيير العينة القديمة لعينة جديدة مع نسبة خلط مختلفة.
    10. حساب ورسم السعة الحرارية مقابل منحنيات درجة الحرارة لكل عينة بروتين مزيج باستخدام برنامج DSC 31-35.
    11. الحكم على مiscibility من خلطات البروتين التي كتبها الطريقة التالية (انظر الشكل 4 الحرارية والشكل 5) وإذا كان اثنين من البروتينات غير قابلة للامتزاج تماما، فإنها يمكن أن يسمى "سبائك البروتين". وإلا فإن مصطلح "بروتين مركب" سيكون اسم مناسب وفقا لنظريات وصفية البوليمر 48،49):
      1. يجب على البروتينات الفردية A و B لديها فرد واحد درجة حرارة التحول الزجاجي، T ز (A) وT ز (B) (انظر منحنيات الخضراء والزرقاء في الشكل 5) 3،48.
      2. هذه واحدة درجة حرارة التحول الزجاجي هي عادة وسيطة بين اثنين من تلك المكونات الفردية من البروتين، T ز (A) وT ز (B) (انظر الشكل 5) 3،48.
      3. فصل مرحلة إمتزاج يمزج يتم الحصول إذا كان كل من T ز (A) وT ز (B) ظهر في مواقعها الاصلية (الشكل 5)، ومع كل خطوة ز Tارتفاع في نسبة إلى التكوين، والبروتينات هما إمتزاج 3،48 بالكامل.
      4. وشبه غير قابلة للامتزاج مركب مزيج من نوع واحد يكون التحول الزجاجي واسع جدا أو قد لا تزال لديها اثنين من التحولات الزجاج، ولكن كل قد هاجروا أقرب إلى كل قريب آخر لمكونات البروتين النقي، T ز (A) وT ز (B) ( انظر الشكل 5). في هذه الحالة، قد يكون هناك هياكل المرحلة الدقيقة غير متجانسة شكلت بين مكونات البروتين اثنين، وقد تختلف تركيبة من موقع إلى آخر.
    12. إذا (3.1.11.1) هو حالة تظهر في DSC، وأنه يمكن تأكيد أن البروتين AB هو نظام السبائك، ثم الانتقال إلى افتعال السبائك البروتين.
  2. تصنيع المواد البصرية من البروتين سبائك
    1. إنتاج (في المختبر تصنيع) أو شراء سطح الطبوغرافية المصممة لالصب. في هذا المثال محددة، تم استخدام الزجاج مع أربعة أنماط الحيود (الشكل 4بصري).
    2. وضع الزجاج مع أنماط الحيود في طبق، وتأكد من واجه سطح نمط التصاعدي.
    3. نشر حل PDMS بالتساوي على سطح الزجاج، وتغطية كامل سطح أنماط (يتم الحل PDMS بواسطة بوتينغ وحل حافزا في 9: 1 نسبة الاختلاط وفقا لتعليمات المستخدم 23،44).
    4. وضع طبق الصب إلى فرن C 65 درجة على الأقل 2 ساعة بينما على سطح مستو. الحل يجب أن تجف PDMS إلى الركيزة الصلبة أثناء هذه العملية.
    5. إزالة PDMS الركيزة من الزجاج. يجب الآن نقل أنماط الحيود إلى السطح PDMS.
    6. كمة خارج القوالب PDMS مع أنماط الحيود باستخدام لكمة ثقب مناسبة.
    7. إسقاط حلول سبيكة البروتين على PDMS الأسطح مع أنماط الحيود، وتجفيفها لمدة 12 ساعة على الأقل للحصول على الأفلام مع أنماط الحيود.
    8. للحصول على السبائك غير قابلة للذوبان البروتين، ووضع مجموعة كاملة من الدكتورذ الأفلام، بما في ذلك قوالب PDMS إلى 60 درجة مئوية فراغ فرن (25 كيلو باسكال) مع طبق الماء على الجزء السفلي من الغرفة. ضخ الهواء في الفرن، والسماح للأبخرة المياه عينات يصلب لا يقل عن 2 ساعة. (وتسمى هذه العملية التي تسيطر عليها درجة حرارة بخار الماء الصلب 45. مقارنة مع أسلوب الميثانول المستخدمة على نطاق واسع، يمكن أن تولد مماثل محتوى ورقة بيتا في المواد الحرير 45). الافراج عن فراغ وتقشر الفيلم غير قابلة للذوبان المياه من الركيزة PDMS باستخدام ملقط. في هذا المثال، يتم استخدام سبائك البرية الحرير الحرير المستأنسة.
    9. اختبار نوعية أنماط الحيود على الأفلام عن طريق مقارنتها مع أنماط الأصلي على الزجاج (مثل جمع الصور SEM للحصول على التفاصيل الصغيرة الحجم، جمع أنماط حيود الليزر لجودة نمط العامة).
  3. تصنيع الدوائر الكهربائية على البروتين المواد سبائك
    1. لصنع نمط الدائرة الكهربائية على الزجاج الركيزة، جزءا لا يتجزأ من الأولغ شريحة زجاجية باستخدام بعض المذيبات مثل إزالة الشحوم Alconox في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق، ثم 5 دقائق في الأسيتون، تليها 5 دقائق في الميثانول. يستخدم الميثانول آخر لأنه يتبخر ببطء أكثر من الأسيتون بحيث يمكن مهب قبالة الركيزة بدلا من التجفيف وترك مخلفات.
    2. ضربة شريحة زجاجية جافة باستخدام غاز النيتروجين الجاف الذي تم إنشاؤه بواسطة يغلي حالا من 180 L النيتروجين السائل ديوار.
    3. إدخال المواد الركيزة في غرفة الترسيب. (وهذه هي المبادئ التوجيهية لنظام الاخرق ولكن يمكن أن تستخدم تقنيات ترسب أخرى.) إذا تم تصميم غرفة مع loadlock، لا أثر الفراغ في غرفة خلع بشكل كبير. إخلاء loadlock لضغط من 30 mTorr.
    4. فتح صمام بوابة بين loadlock وغرفة ترسب الرئيسية وإدخال الركيزة في الغرفة.
    5. بدوره على الغاز عار ومنظم الضغط والسيطرة على الضغط على depositio المطلوبن الضغط. الضغوط أعلى تعطي أقل ذرات المعدن الطاقة باءت بالفشل والأفلام أكثر اتساقا مع الضغوط انخفاض العائد التمسك أفضل الأفلام أسرع المودعة. مجموعة من الضغوط عموما بين 3 و 60 mTorr mTorr، مع 20 mTorr تعمل بشكل جيد.
    6. ثم من المتوقع على مصراع الركيزة التي تحمي من الطلاء باستخدام القوة RF 100 W. مطلوب ضبط الدائرة لتوجيه السلطة RF إلى الهدف المعادن المعادن. ويمكن استخدام التيار المستمر بدلا من RF للأهداف المعدنية. من أجل إزالة طبقات أكسيد والملوثات من الهدف، قبل تفل لعدة دقائق.
    7. فتح مصراع وتفل المعدن على الركيزة. معدل الترسيب لتكوين صفت حوالي 10 نانومتر لكل دقيقة. وسوف تعتمد هذه النسبة على المسافة والضغط وقوة المغناطيس العاملة في الكاثود المغناطيسية، سمك المستهدفة والمعادن باءت بالفشل. ضبط الوقت ترسب لتحقيق سمك المطلوب.
    8. إزالة شريحة زجاجية مغلفة منالغرفة.
    9. باستخدام الدوار، وتدور طلاء مقاوم الضوء على سطح الفيلم. يمكن استخدام العديد من المقاومات. لهذه الحالة، تم استخدام مقاومة للضوء إيجابي.
    10. بعد مقاومة ونسج على الفيلم، خبز لينة عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتجفيف مقاومة.
    11. وضع قناع الاتصال مع صورة للجهاز بحزم ضد المقاومة. ويستخدم مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن مقاومة للضوء. التعرض هو 10 ثانية ولكن يختلف باختلاف قوة مصدر الضوء وتقاوم المستخدمة.
    12. وضع الفيلم في تطوير مقاومة للضوء حتى تظهر الصورة المسقطة. يغسل المطور بعيدا مقاومة التي تعرضت للضوء الأشعة فوق البنفسجية التي تتسبب في كسر السندات البوليمر. مباشرة بعد تظهر الصورة، وتراجع الفيلم في المياه DI لوقف المطور من العمل على مقاومة للضوء غير معلن.
    13. تفجير الأفلام الجافة مع غاز النيتروجين الجاف.
    14. وضع الأفلام في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى "خبز الصعب" الصورةمقاومة.
    15. بعد باردة الأفلام، ووضعها في محلول الحفر على المعدن حتى لا يحميها يرفع من مقاومة للضوء. تراجع في الماء لوقف الحفر.
    16. شطف مع الأسيتون لإزالة مقاومة للضوء تصلب.
    17. شطف مع الميثانول وضربة الجافة مع النيتروجين الجاف.
    18. مرة واحدة النظارات المغلفة جاهزة، وانخفاض سبائك مختلفة الحلول البروتين على أسطح الزجاج، وتجفيفها لمدة 12 ساعة على الأقل للحصول على أفلام سبيكة البروتين على النظارات. (ويقترح أن تركز أولا الحلول سبيكة إلى 5٪ بالوزن للحصول على سميكة الأفلام سبيكة البروتين.)
    19. بسبب التفاعلات مسعور، ماء، وسيتم تحويل الأفلام معدنية رقيقة من الواجهات الزجاجية للسبائك البروتين تعلق فيلم السطوح 51. تقشر الأفلام سبيكة البروتين مع أنماط معدنية رقيقة من ركائز الزجاج باستخدام ملقط.
    20. للحصول على السبائك غير قابلة للذوبان البروتين، ووضع الأفلام الجافة إلى 60 ° C فراغ فرن (25 كيلو باسكال) مع فصيل عبد الواحدطبق العاطر على الجزء السفلي من الغرفة. ضخ الهواء في الفرن، والسماح للأبخرة المياه عينات يصلب لا يقل عن 2 ساعة. الافراج عن فراغ وتقشر الفيلم غير قابلة للذوبان المياه من الركيزة باستخدام ملقط.
    21. اختبار الصفات الكهربائية لأنماط معدنية على الأفلام سبيكة البروتين مثل المقاومة الكهربائية ومقارنتها مع أنماط الأصلي على الزجاج.
  4. تصنيع المواد الدوائية من البروتين سبائك
    1. الى افتعال الأفلام سبيكة البروتين مع مركبات الأدوية، وإعداد أول الركيزة PDMS كما هو موضح في الخطوة 3.2. تنظيف PDMS الركيزة التي شكلتها الماء المقطر.
    2. حل أو تفريق المركبات الدوائية في محلول مائي. استخدام الموجات فوق الصوتية أو دوامة لخلط متجانس المركبات الدوائية مع الماء. إذا كانت العناصر ليست للذوبان في الماء، تفريق مساحيق مع توزيع متجانس في الماء المقطر الخالي من الأيونات.
    3. حساب نسبة الجماعي المطلوبمن المركبات إلى سبائك البروتين بواسطة: حجم محلول مركب مئوية X الوزن من محلول مركب: حجم سبيكة البروتين حل س نسبة وزن محلول مركب (هنا تم استخدام 1٪ بالوزن حل سبائك). تحديد نسبة للحصول على الفيلم مع كثافة مجمع المطلوب في الفيلم سبيكة البروتين.
    4. مزيج ببطء محلول مركب مع الحل سبيكة البروتين باتباع نفس التعليمات في القسم 2 عملية 2.16. (ملاحظة: لتجنب دبق، لا ultrasonicate أو دوامة الحل خلال خلط).
    5. صب حجم المحسوبة لخليط على الركيزة PDMS وجففها لا يقل عن 12 ساعة في غطاء الكيميائية إلى الحصول على سبيكة البروتين الفيلم يحتوي على نسبة المصممة من المركبات الدوائية.
    6. crosslinked جسديا الفيلم باتباع نفس التعليمات في القسم 3.2 عملية 3.2.8. يمكن رؤية مثال على الأفلام سبيكة مع نموذج المخدرات غير قابلة للذوبان من كثافة منخفضة (LD) أو عالية (HD) كثافة في الشكل 4 الكيميائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تفاعلات نموذجية البروتين البروتين (على سبيل المثال، بين البروتين والبروتين B) يمكن أن تحتوي المسؤول عن تهمة (كهرباء) الجذب السياحي، وتشكيل الرابطة الهيدروجينية والتفاعلات مسعور، ماء، وكذلك ثنائي القطب، المذيبات، ومكافحة أيون، وآثار التدهور الحتمي بين محددة المجالات من البروتينات اثنين (الشكل 2) 3. لذلك، في الأساس، يمكننا التنبؤ آثار هذه التفاعلات بواسطة المحاكاة الحاسوبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أحد الإجراءات الأكثر أهمية في إنتاج "سبائك" نظام البروتين هو للتحقق من امتزاج البروتينات المخلوطة. خلاف ذلك، فإنه ليست سوى خليط من البروتين أو البروتين نظام مركب إمتزاج دون خصائص مستقرة والانضباطي. طريقة التحليل الحراري التجريبي يمكن استخدامها لهذا الغرض وللتأكيد على خصائص سبائك. البروتين البروتين التفاعلات يمكن الاطلاع فقا لنموذج فلورى-هاغينز في 48 شعرية والتفاعلات بين "المذيبات" (البروتين المكون الغالب) و "المذاب" (المكون طفيفة البروتين)....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أعلنت أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

الكتاب أشكر جامعة روان لدعم هذا البحث. XH أيضا بفضل الدكتور ديفيد كابلان L. في جامعة تافتس والأنسجة NIH P41 مركز الموارد الهندسية (TERC) للتدريبات الفنية السابقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Q100 كالوريمتر المسح التفاضلي (DSC)TA Instruments ، نيو كاسل ، DE ، الولايات المتحدة الأمريكية
N / Aيمكنك استخدام أي نوع من DSC مع برنامج لحساب السعة الحرارية.
SS30T نظام الاخرق فراغ  T-M Vacuum Products، Inc. ، Cinnaminson ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةN / Aمع الأجزاء المصممة حسب الطلب ؛ يمكنك استخدام أي نوع من أنظمة الاخرق لتغطية.
فرن فراغ VWR 1415MVWR International ، بريدجبورت ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةN / Aيمكنك استخدام أي نوع من أفران التفريغ لربط العينات فعليا.

المراجع

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003(2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130(2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101(2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901(2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مزيج بروتينات الحريرطلاء الدوائر الإلكترونيةتجديد المحلول البروتينيتصنيع الأغشية الرقيقةالتحليل الحراريالمواد البصريةالمواد الكهربائيةالمواد الصيدلانيةالتفاعلات البروتينية-البروتينية
تصميم بروتين الحرير الحرير المواد سبيكة للتطبيقات الطبية الحيوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.