مقالة منهجية

Picoinjection من قطرات ميكروفلويديك بدون أقطاب معدنية

10.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50913

⸱

أبريل 18, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, Unversity of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

قمنا بتطوير تقنية لpicoinjecting قطرات ميكروفلويديك التي لا تتطلب أقطاب معدنية. على هذا النحو، وأجهزة دمج تقنية لدينا هي أبسط لصنع واستخدام.

الملخص

الأساليب القائمة لpicoinjecting الكواشف إلى قطرات ميكروفلويديك تتطلب أقطاب معدنية دمجها في رقاقة ميكروفلويديك. دمج هذه الأقطاب يضيف خطوات مرهقة وعرضة للخطأ في عملية تصنيع الجهاز. قمنا بتطوير تقنية يغني عن احتياجات الأقطاب المعدنية خلال picoinjection. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم السائل حقن نفسها باعتبارها القطب، لأن معظم الكواشف البيولوجية تحتوي على الشوارد الذائبة وغير موصل. من خلال القضاء على الأقطاب، ونحن لحد الساعة الجهاز تلفيق والتعقيد، وجعل الأجهزة أكثر قوة. بالإضافة إلى ذلك، مع نهجنا، وحجم الحقن يعتمد على الجهد المطبق على حل picoinjection؛ وهذا يسمح لنا بسرعة لضبط حجم حقن عن طريق تحوير الجهد المطبق. علينا أن نظهر أن لدينا تقنية متوافق مع الكواشف دمج المركبات البيولوجية المشتركة، بما في ذلك مخازن، والإنزيمات، والأحماض النووية.

المقدمة

في على microfluidics القائم على الحبرية، وتستخدم قطرات مائي ميكرون النطاق باسم "أنابيب اختبار" لردود الفعل البيولوجية. ميزة لأداء ردود الفعل في قطرات صغيرة هو أن كل قطرة يستخدم سوى عدد قليل من رر الكاشف، ومع على microfluidics، قطرات يمكن تشكيلها ومعالجتها في معدلات كيلوهيرتز 1. مجتمعة، هذه الخصائص تسمح لملايين من التفاعلات مع الخلايا الفردية، جزيئات الحمض النووي، أو مركبات التي يتعين القيام بها في غضون دقيقة مع ميكرولتر من إجمالي المواد.

لاستخدام قطرات للتطبيقات مثل هذه، وهناك حاجة إلى تقنيات لإضافة وحدات التخزين التي تسيطر عليها من الكواشف إلى قطرات؛ هذه العمليات هي مماثلة لpipetting لفي أنابيب الاختبار. طريقة واحدة لتحقيق هذا هو electrocoalescence، حيث يتم دمج قطرة من كاشف مع انخفاض الهدف من خلال تطبيق مجال كهربائي. الحقل الكهربائي يعطل ترتيب الجزيئات بالسطح على واجهات من قطرات، الهندucing عدم الاستقرار الأغشية الرقيقة وتسبب في التحام المستحلبات التي هي على خلاف ذلك مستقر 2. يتم استغلالها دمج يسببها كهربائيا أيضا في تصميم picoinjector، وهو الجهاز الذي يضخ الكواشف إلى قطرات لأنها تتدفق الماضي قناة الضغط 3. لتطبيق الحقل الكهربائي، وأجهزة picoinjector استخدام أقطاب معدنية، ولكن التكامل بين الأقطاب المعدنية في رقائق ميكروفلويديك وغالبا ما يكون عملية معقدة وعرضة للخطأ كما هي خطر الأسلاك السائل جندى بسهولة عن طريق فقاعات الهواء أو الغبار وغيرها من الحطام في القناة ، فضلا عن كسور من الإجهاد أو الانحناء أثناء الإعداد الجهاز.

ونحن هنا نقدم وسيلة لأداء picoinjection دون استخدام أقطاب معدنية، مما يجعل تصنيع أبسط وأكثر قوة. لتحريك picoinjection، ونحن بدلا من استخدام السائل حقن نفسها باعتبارها القطب، لأن معظم الكواشف البيولوجية تحتوي على الشوارد الذائبة وغير موصل. نحن أيضا إضافة "فاراداي موار "لحماية المناطق الحساسة من الجهاز ويكون بمثابة الأرض العالمي (الشكل 1). يعزل خندق كهربائيا قطرات المنبع للموقع picoinjection من خلال توفير الأرض، ومنع غير مقصودة الحبرية الاندماج. والفائدة المضافة من أسلوبنا هو أن حجم حقنها في قطرات يعتمد على حجم الجهد تطبيقها، والسماح لها أن تعدل عن طريق ضبط إشارة تطبيقها.

نبتدع أجهزتنا في بولي (dimethylsiloxane) (PDMS) باستخدام تقنيات الطباعة بصفائح معدة ضوئيا لينة 4،5. نهجنا هو متوافق مع الأجهزة ملفقة في مواد أخرى، مثل الراتنجات والبلاستيك وإيبوكسى. قنوات لديها آفاق وبعرض من 30 ميكرون، والتي هي الأمثل للعمل مع قطرات 50 ميكرومتر في القطر (65 رر). ونحن نقدم الكواشف عبر أنابيب بولييثيليني (0.3/1.09 مم القطر الداخلي / الخارجي) إدراجها في الموانئ التي تم إنشاؤها أثناء تصنيع الجهاز مع 0.50 ملم اللكمات خزعة، على غرار أساليب described سابقا 5. ماكياج الدقيق للحقن السوائل يعتمد على تطبيق معين. السائل بحاجة تحتوي على الشوارد الذائبة بتركيزات عالية بما يكفي لانتاج ما يكفي من الموصلية الكهربائية للإشارة إلى أن تنتقل إلى picoinjector فقط. في اختبار مقاعد البدلاء، وجدنا أن تركيزات أيونية أكبر من 10 ملم 6 ينبغي أن يكون كافيا، على الرغم من هذه القيمة والتوصيلات السائل تعتمد على أبعاد جهاز معين وحجم الجهد المطبق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم الأبعاد جهاز وطبولوجيات بناء على احتياجات التجريبية باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) البرمجيات

ملاحظة: حدد أقطار قناة مستحلب أصغر من تلك التي من قطرات كروية. هذا يفرض على قطرات إلى أسطواني أو "السجق" الشكل ويسمح للpicoinjection أكثر فعالية. لأغراضنا، قمنا بتصميم 30 × 30 ميكرون قنوات للقطرات التي كانت 50 ميكرون في القطر.

  1. نموذج موقع picoinjection (ق) بعد تلك التي وصفها أباتي وآخرون. 3 باستثناء أن تتم إزالة قنوات لالأقطاب المعدنية، كما أنها ليست ضرورية.
  2. إضافة قنوات لتكون بمثابة فاراداي الخندق المائي (الشكل 1) التي تعمل بين موقع picoinjection (ق) ومستحلب المنبع بحيث يحجب قطرات من الحقل الكهربائي.
    ملاحظة: هذا يمنع دمج غير مقصودة.

2. الأجهزة عن طريق افتعال لينة Photolithتقنيات ographic

  1. إنشاء قناع الشفافية ضوئيه استنادا إلى ملف CAD باستخدام الخدمات التجارية القائمة.
  2. مع الضوئية، وعلاج مقاوم الضوء على رقائق السيليكون لإنتاج الماجستير الجهاز، كما هو موضح سابقا 4.
  3. صب PDMS مختلطة مع وكيل المعالجة (نسبة 11:1) على الجهاز الرئيسي الوارد في طبق بتري 5 سم البوليسترين.
  4. وضع رئيسية مع PDMS في مجفف الفراغ لنحو 15 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء.
  5. علاج الجهاز PDMS عن طريق وضعها في الفرن 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بدلا من ذلك، فإن PDMS علاج في RT بعد 24 ساعة.
  6. إزالة الجهاز عن طريق خفض حول محيط بشفرة الجراحية وتقشير بعناية الجهاز من سيد.
  7. لكمة مدخل ومخرج الثقوب في PDMS باستخدام 0.5 ملم خزعة لكمة.
  8. السندات الجهاز إلى شريحة المجهر والزجاج باستخدام بوندر البلازما 4.

3. إعداد وضغط الهواءمضخة السيطرة للضغط على خزان يحتوى على السوائل

  1. تعديل الناتج المضخة بحيث أن مخارج الهواء المضغوط من خلال طول 2.7 مم القطر الداخلي أنابيب البولي ايثيلين.
  2. بناء عليه بحيث ينهي الأنبوب في حقنة غيض بالتركيبة القفل عن طريق تركيب لمعة خلال الحلمة على الجزء الخلفي من قفل بالتركيبة.
  3. ختم عن طريق ملء الفراغ بين المواضيع بالتركيبة للانغلاق وأنابيب الايبوكسي مع.
  4. نعلق إبرة G 27.5.

4. إعداد Monodisperse مستحلب مائي (ماء في زيت) القطرات المعلقة في خامل المفلورة الناقل للنفط مع 2٪ (وزن / وزن) المذاب حيويا السطحي 7

الكواشف المحددة الواردة في هذه قطرات تعتمد على التطبيق

  1. استعدادا لإعادة حقن، تحميل مستحلب إلى حقنة 1 مل مع إبرة G 27.5.
  2. تأمين حقنة في ضخ حقنة وتوجيه مضخة عموديا (إبرة التصاعدي).
    مذكرة: هذا التوجه يؤدي إلى حزمة قطرات في طبقة فوق الناقل للنفط. عند بدء تشغيل المضخة، وسيتم دفع قطرات من حقنة في ارتفاع حجم جزء من طبقة النفط تحتها.

5. إعداد الكواشف لمقدمة لرقاقة ميكروفلويديك

  1. لكمة ثلاثة ثقوب 0.5 ملم إلى الحد الأقصى من أجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 مل (أي سوف حاوية مع غطاء المسمار يكفي) باستخدام لكمة خزعة، إبرة، أو الحفر.
  2. إدراج 0.5 ملم قطر السلك الكهربائي وسم طول ~ 20 من PE-2 الأنابيب من خلال اثنين من الثقوب بحيث تصل إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. في حفرة المتبقية، والخيط و~ 2.5 سم من سم طول ~ 20 من PE أنابيب من النوع الذي ستقع فوق مستوى السوائل.
  4. ختم أي ثغرات في الجزء العلوي من الغطاء مع الايبوكسي UV الشفاء.
  5. ملء الأنبوب مع السائل picoinjection والمسمار على الغطاء.
  6. وصل الناتج من مضخة ضبط ضغط الهواء إلى طول أقصر من الأنابيب عن طريق إدراججي الإبرة في التجويف. الإبرة يجب أن تناسب بشكل مريح.
  7. ملء حقنة 1 مل مع 1 M كلوريد الصوديوم ليكون بمثابة الخندق المائي فاراداي.
  8. توصيل G إبرة 27.5 وتأمين حقنة في ضخ حقنة.
  9. ملء حقنة 1 مل أخرى مع الناقل للنفط / الفاصل، توصيل G إبرة 27.5، وضمان الحصول عليها في ضخ حقنة.

6. إعداد جهاز ميكروفلويديك لPicoinjection

  1. توصيل أنابيب الإخراج (أطول مدة) من حقن السوائل الحاوية إلى ميناء مدخل السائل picoinjection على رقاقة ميكروفلويديك.
  2. الاتصال حقنة تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم إلى مدخل الميناء لفاراداي الخندق المائي على رقاقة ميكروفلويديك بطول PE أنابيب.
  3. الاتصال حقنة تحتوي على الناقل للنفط إلى ميناء مدخل للرقاقة ميكروفلويديك بطول PE أنابيب.
  4. إدراج PE أنابيب إلى ميناء منفذ مستحلب على رقاقة ميكروفلويديك. الأنابيب يجب أن تنتهي في وعاء جمع مستحلب، ولاماللي أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
  5. إدراج PE أنابيب إلى ميناء منفذ لفاراداي الخندق المائي على رقاقة ميكروفلويديك. الأنابيب يجب أن تنتهي في غير إجراء والحاويات معزولة كهربائيا لمنع حدوث ماس كهربائي.
  6. ربط مخرجات عالية الجهد (HV) مكبر للصوت عبر مقطع التمساح إلى القطب المعدنية المغمورة في السائل picoinjection.
  7. توصيل القطب الأرضي من مكبر للصوت HV عبر مقطع التمساح لهذا المعدن من إبرة حقنة تحتوي على 1 M كلوريد الصوديوم.

7. الكواشف صب في ميكروفلويديك رقاقة

  1. يعرض 1 M كلوريد الصوديوم (فاراداي الخندق المائي) إلى الجهاز بمعدل 100 ميكرولتر / ساعة.
  2. إدخال مستحلب الحبرية والناقل للنفط بأسعار مناسبة للأبعاد الجهاز. لدينا جهاز عرض، ونحن نقدم وقطرات النفط عند 200 و 400 ميكرولتر / ساعة، على التوالي. ينبغي على معدلات تدفق قطرات تسمح لتمرير picoinjector على فترات منتظمة يفصلقبل وجود فجوة من الناقل للنفط.
  3. ضبط الضغوط التي مورست على السائل picoinjection مثل أن ضغط السائل في فوهة picoinjection هو في حالة توازن الميكانيكية مع قناة الحبرية.
    ملاحظة: في هذا الضغط (ضغط لابلاس)، ينبغي حقن السائل انتفاخ في القناة دون قطرة في مهدها قبالة وتشكيل قطرات الخاصة بها (الشكل 2). في هذه معدلات تدفق المذكورة أعلاه، ونحن نطبق ضغط ~ 13 رطل إلى السائل حقن لتحقيق التوازن في موقع الحقن.

8. تبدأ Picoinjection

  1. كما قطرات تمرير فوهة الحقن، وتطبيق 0-10 V، 10 كيلو هرتز، تضخيم إشارة AC 1،000 العاشر من HV-مكبر للصوت (الشكل 3).
  2. تعدل حجم الحقن عن طريق تغيير السعة من الجهد تطبيقها.
    ملاحظة: يجب أن الفولتية العالي تسمح لمزيد من السوائل لتكون على قدم قطرات. في تجاربنا، نلاحظ حقن مستقرة وثابتة في الفولتية تكونبني 100 و 3،000 V باستخدام حلول حقن كلوريد الصوديوم تتراوح 10-500 مم (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الصور المجهرية التي اتخذت في موقع المعرض picoinjection أن كهربة السائل picoinjection ما يكفي لتحريك حقن (الشكل 2). يمكن التحكم في حجم حقن عن طريق تحوير السعة من الجهد تطبيقها، مع ارتفاع الفولتية السماح لكميات الحقن العالي. نحن مؤامرة حجم الحقن مقابل ضخامة الجهد المطبق لمدة ثلاثة molarities ممثل السائل الحقن في (الشكل 3). للتدليل على سرعة أسلوبنا، ونحن حقن انتقائي قطرات تمرير موقع الحقن اعتمادا على وجود أو غياب من صبغة الفلورسنت (فيلم 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

العلاقة بين حجم الحقن والجهد تطبيقها يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك أبعاد الجهاز، وطول الأنبوب تحمل السوائل picoinjection إلى الجهاز، المولية من السوائل picoinjection، وسرعة قطرات لأنها تمر أنهم حاقن. لهذا السبب نحن نوصي بأن تتسم العلاقة حجم / الجهد قبل كل شوط من picoinjection عن طريق قياس كميات الحقن في حواف نطاقات العمل من الجهد والمولية. بالإضافة إلى ذلك، في ارتفاع الفولتية وحقن السوائل molarities نلاحظ ظاهرة في السائل الذي picoinjection لم يعد عقد في التوازن في فوهة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

نحن لا نفهم تماما الآلية الفيزيائية الدقيقة وراء العلاقة بين الجهد المطبق وحجم الحقن لوحظ في تجاربنا. مصالح المختبر ومجالات الخبرة ذات الصلة ليست مناسبة تماما لمتابعة هذه المسألة العالقة. نحن نشجع تلك مع أكثر فطنة الفيزياء والهندسة لاستكشاف هذه الظاهرة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والهندسة الحيوية العلاجية في سان فرانسيسكو، ومعهد كاليفورنيا للالكمي العلوم البيولوجية (QB3)، وجائزة سد الفجوة من مؤسسة روجرز الأسرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل محاقن Luer-Lok & tradeBD Medical309628
LocTite لاصق معالج بالأشعة فوق البنفسجيةHenkel35241
أنابيب PE-2السلع العلميةBB31695-PE / 2
Novec HFE-75003M98-0212-2928-5
NaClSigma AldrichS9888
1.5 مل أنابيبالطرد المركزيEppendorf22363531
BD Falcon أنبوب 15 ملBD Biosciences352097
مضخة التحكم في ضغط الهواءControl Air Inc.نوصي بواحد تحت سيطرة DAQ وبرنامج التحكم
مضخات الحقن NewEraيجب أن تكون قادرة على حمل 1 مل من المحاقن وتتدفق بمعدلات منخفضة تصل إلى 100 & # 956; لتر / ساعة
مضخمقادرا على تضخيم الإشارات بمقدار 1,000 مرة بين 0.01 و 10 فولت
رابط / منظف البلازماهاريك بلازما
3 بوصات رقائق السيليكونسيجما ألدريتش647535
PDMSيجب تضمين داو كورنينجسيلجارد 184 مع عامل معالجة
SU-8 مقاوم للضوءMicroChemتعتمد اللزوجة على أبعاد الجهاز
يجب أن يكون HV

المراجع

  1. Kritikou, E. It's cheaper in the Picolab. Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).
  2. Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).
  3. Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).
  4. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. J. Vis. Exp. (7), (2007).
  5. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  6. O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. Electrode-free picoinjection of microfluidic drops. Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).
  7. Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
  8. Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow. Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).
  9. Herminghaus, S. Dynamical instability of thin liquid films between conducting media. Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).
  10. Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella. Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).
  11. Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device. J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).
  12. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS ONE. 8 (4), (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة