مقالة منهجية

الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically

9.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50915

⸱

ديسمبر 27, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University, 2Department of Neurobiology, University of Chicago

في هذه المقالة

ملخص

نصف طريقة لتوصيف التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية لدوائر الدماغ الأمامي باستخدام نهج بصري وراثي لتحفيز مجموعات الخلايا العصبية في المختبر.

الملخص

يتكون الدماغ الأمامي الحسي من أنواع الخلايا المتصلة بشكل معقد ، والتي لم يتم توضيح خصائصها الوظيفية بالكامل بعد. تم مساعدة فهم تفاعلات دوائر الدماغ الأمامي هذه مؤخرا من خلال تطوير طرق بصرية وراثية لتعديل النشاط العصبي بوساطة الضوء. هنا ، نصف بروتوكولا لفحص التنظيم الوظيفي لدوائر الدماغ الأمامي في المختبر باستخدام التحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر للقناة رودوبسين ، والذي يتم التعبير عنه بصريا عن طريق التعداء بوساطة فيروسية. يستغل هذا النهج أيضا فائدة إعادة تركيب cre-lox في الفئران المعدلة وراثيا لاستهداف التعبير في أنواع معينة من الخلايا العصبية. بعد التعدي ، يتم تسجيل الخلايا العصبية من الناحية الفسيولوجية في مستحضرات الشرائح باستخدام مشبك رقعة الخلية الكاملة لقياس استجاباتها المستحثة للتحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر للألياف التي تعبر عن القناة رودوبسين. يتيح هذا النهج تقييم التضاريس الوظيفية والخصائص المشبكية. يمكن الحصول على الارتباطات المورفولوجية عن طريق تصوير التعبير التشريحي العصبي للقناة رودوبسين التي تعبر عن الألياف باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للشريحة الحية أو الأنسجة اللاحقة الثابتة. تتيح هذه الأساليب إجراء تحقيقات وظيفية لدوائر الدماغ الأمامي التي تتوسع في مناهج أكثر تقليدية.

المقدمة

تشكل الدوائر المتقنة للدماغ الأمامي للثدييات تحديا تجريبيا لتشريح الأدوار الوظيفية لمكوناته المتشابكة. تم مساعدة فك تشابك هذه العلاقات مؤخرا من خلال تطوير طرق بصرية وراثية لإثارة وتثبيط مجموعات الخلايا العصبية على وجه التحديد وتوقعاتها1-3. تستفيد هذه الأساليب من التعبير المتحكم فيه وراثيا لقنوات الغشاء المستجيبة للضوء4-6. وتجدر الإشارة بشكل خاص إلى أن channelrhodopsin ، وهي قناة أيونية ذات بوابات ضوئية ، تزيل استقطاب الأغشية العصبية بعد التحفيز البصري ، مما يؤدي إلى إثارة الخلايا العصبية المعبرة وإسقاطاتها4،7. على العكس من ذلك ، فإن هالورهودوبين ، وهي مضخة كلوريد ذات بوابات ضوئية ، تعمل على فرط استقطاب الغشاء ، وبالتالي تثبيط الإسقاط المستهدف6،8،9. تم تصميم العديد من المتغيرات من هذه opsins ، وإنتاج نواقل متعددة للتعداء والتعبير في المجموعات العصبية ذات الأهمية ، وخطوط الفأر المعدلة وراثيا التي تم تصميمها والتي تعبر بشكل أساسي عن هذه opsins أو التي تمكن من التحكم بوساطة cre-lox في تعبيرها1،2،10،11.

أحدثت فائدة هذه الأساليب والمواد البصرية الوراثية ثورة في علم الأعصاب التجريبي الحديث ، مما مكن من تشريح دور الدوائر العصبية المحددة في فسيولوجيا وسلوك الكائن الحي12-15. على وجه الخصوص ، يمكن تطبيق هذه الطرق بقوة على التشريح الوظيفي لدوائر الدماغ باستخدام مستحضرات الشريحة في المختبر 16-20. في هذا السياق ، تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في القدرة على توصيف فسيولوجيا الإسقاطات بعيدة المدى التي يصعب ، إن لم يكن من المستحيل ، الحفاظ عليها في شريحة سميكة ، مثل الوصلات التوصيلية بين نصفي الكرة القشرية الدماغية16. علاوة على ذلك ، تتيح هذه التقنية التلاعب غير الممكن بطرق أخرى ، مثل التثبيط الانتقائي للإنقاطات بدقة زمنية دقيقة باستخدام halorhodopsin6،8،9. علاوة على ذلك ، يسمح التعبير المحدد من نوع الخلية لهذه الأوبسين بتحفيز المكونات المعزولة في الدائرة العصبية أو تثبيطها بشكل انتقائي1،2،11،15،21. على هذا النحو ، تتيح هذه الأدوات البصرية الوراثية الجديدة تحليلا غير مسبوق لمساهمات الخلايا العصبية في علم وظائف الأعضاء والسلوك.

هنا ، نصف بروتوكولا للتعبير عن channelrhodopsin في دماغ الفأر باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة (AAV)1،2. يمكن إجراء تعداء محدد لمجموعات الخلايا العصبية المستهدفة باستخدام هذا البروتوكول ، مع الاختيار المناسب لتركيبات المحفز أو الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن Cre-recombinase في الخلايا العصبية المستهدفة ذات الأهمية وبنية فيروسية "floxed"1،11،15،21 (الشكل 1). كأمثلة هنا ، نفحص الإسقاطات القشرية بين القشرة البصرية الأولية (V1) والقشرة البصرية الثانوية (V2) ونحقق أيضا في الإسقاط القشري للطبقة 6 من القشرة الحسية الأولية (S1) إلى النواة الإنسية البطنية الخلفية (VPm). نجمع بين هذا التعبير المحدد والتحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر في المختبر لتقييم فسيولوجيا التشابك والتضاريس الوظيفية. يتيح الإعداد المقدم هنا تحديد المواقع المكانية الدقيقة والتحكم في مواقع التحفيز الضوئي. أخيرا ، نصف تصور أنماط التعبير باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. الجراحة والحقن

  1. تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق (يوصى بإبرة 22-25 جم) من الكيتامين (100-120 مجم / كجم) والزيلازين (7.5-16 مجم / كجم).
    1. قم بتقييم التخدير باستخدام قرصات إصبع القدم القوية حتى لا يتم استجابات. بالنسبة لجميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة ، قم بالتعديل لاتباع إرشادات IACUC المحلية حسب الضرورة.
  2. ضع الفئران المخدرة في جهاز تجسيمي عن طريق تأمين الرأس والأذنين في حواسيها.
    1. قم بتليين العينين قبل وضع في الجهاز التجسيمي بمرهم معقم للعيون.
  3. احلق فروة الرأس بشفرة حلاقة وعقم المنطقة بمسحات البيتادين.
  4. باستخدام مشرط ، قم بقص شق خط الوسط وعكس الجلد والعضلات الأساسية فوق المنطقة المراد حقنها.
  5. قم بتدوير شفرة مشرط على شكل تريفين لإجراء بضع القحف فوق المنطقة المراد تعرضها. بدلا من ذلك ، استخدم مثقاب صغير متصل ب Dremel لإجراء بضع القحف.
    1. لإجراء حج القحف ، ضع شفرة مشرط أو مثقاب على سطح الجمجمة وقم بتدويرها ببطء حتى يتم حفر ما يكفي من العظام للكشف عن الأم الموجودة تحتها.
    2. بمجرد إجراء الحفر الأولي ، قم بتكبير حج القحف باستخدام ملقط دقيق لإزالة العظام بعناية من الحواف.
  6. املأ حقنة سعة 1 ميكرولتر بالمحلول الفيروسي المراد حقنه (UNC Vector Core).
    1. لتعزيز فعالية التعدي ، قم بإعداد محلول فيروسي يحتوي على 4 ميكروغرام / مل من البوليبرين.
  7. اخفض الإبرة في المنطقة المراد حقنها وقم بضغط 200 نيولتر من المحلول المحتوي على فيروس بمضخة حقنة.
    1. دع المحقنة تجلس لمدة 10 دقائق قبل سحب الإبرة.
  8. خياطة الجلد بالنايلون الأحادي غير القابل للامتصاص وتغطية الشق بمرهم مضاد حيوي.
    1. يجب إزالة الغرز بعد 7-10 أيام.
  9. حقن البوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كغ) لتسكين الألم بعد الجراحة.
  10. اسمح للحيوانات بالتعافي بعد الجراحة لمدة 14-21 يوما للسماح بالتعبير الكافي عن الرودوبسين القناة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الشريحة

  1. بعد فترة الشفاء ، قم بتخدير بعمق بتخدير الأيزوفلوران ، كما تم التحقق منه من خلال عدم وجود منعكس انسحابي عندما تكون القدم الخلفية و / أو أصابع القدم مضغوطة بإحكام.
  2. قم بتشريح الدماغ عن طريق قطع الرأس متبوعا بجروح خط الوسط والجمجمة.
  3. انزع الجمجمة عن خط الوسط لكشف الدماغ.
  4. قم بإزالة الدماغ بعناية باستخدام ملعقة مغرفة دقيقة لفصل الأعصاب القحفية عن قاعدة الدماغ.
  5. ضع الدماغ المقطوع بسرعة في دورق صغير سعة 100 مل يحتوي على سائل دماغي نخاعي اصطناعي بارد ومثلج (ACSF ؛ بالملليمتر: 125 كلوريد الصوديوم ، 3 كيلولولاريتر ، 1.25 هيدروكلوريدالصوديوم 2، 4 ، 1 ملجمليكلوريد2 ، 2 كلوريد المكالس2 ، 25 NaHCO3 ، 25 جلوكوز).
  6. قم بإزالة الدماغ من ACSF وضعه على شريحة مجهرية مغطاة بورق ترشيح مبلل مسبقا ب ACSF.
  7. قم بعمل قطع مانع للدماغ في الاتجاه المطلوب باستخدام شفرة حلاقة نظيفة.
  8. قم بلصق السطح المسدود للدماغ على مرحلة القطع باستخدام غراء لاصق فوري.
  9. انقل المرحلة إلى غرفة التقطيع الاهتزازية (تحفظ في الفريزر حتى تصبح جاهزة للتقطيع).
  10. صب ACSF المثلج البارد في غرفة التقطيع.
  11. قم بتقطيع أقسام الدماغ بحجم 400-500 ميكرومتر باستخدام قطاعة الأنسجة الاهتزازية.
  12. انقل شرائح الدماغ إلى غرفة احتجاز تحتوي على ACSF المؤكسج ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التجربة.
< p class = "jove_title" >3. التسجيل الفسيولوجي

  1. بعد فترة الحضانة ، انقل شريحة إلى غرفة التسجيل على مرحلة مجهر معدلة.
  2. قم بتأمين الشريحة في الحمام أثناء التجربة باستخدام عدد قليل من خيوط النايلون المتصلة بحامل شريحة من الأسلاك البلاتينية.
  3. قم بتفريد الشريحة باستخدام ACSF باستمرار.
  4. اسحب ماصات التسجيل إلى مقاومة طرف تتراوح من 3 إلى 6 MΩ عند ملؤها بمحلول داخل الخلايا يحتوي على ما يلي (بالمللي مولار): 127 K-gluconate، 3 KColl، 1 MgCl2، 0.07 CaCl2، 10 HEPES، 2 Na 2-ATP، 0.3 Na-GTP، 0.1 EGTA. يجب أن يحتوي المحلول داخل الخلايا على درجة حموضة 7.3 ، معدلة باستخدام KOH أو حمض الجلوكونيك والأسمولية 280-290 mOsm.
  5. باستخدام إعداد تسجيل خلية كاملة مرئي قياسي ، ضع ماصة التسجيل بالقرب من الخلايا العصبية المراد تسجيلها أثناء الضغط الإيجابي22،23.
  6. حرر الضغط الإيجابي أثناء تطبيق الشفط لتشكيل ختم Gigaohm.
  7. قم بتطبيق شفط قصير لكسر الغشاء وتشكيل تسجيل تكوين الخلية الكاملة.
  8. سجل استجابات الخلايا العصبية إما في مشبك الجهد أو التيار.
فئة

4. التحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر

  1. بدء برامج وأجهزة الحصول على البيانات، الموضحة في التقارير السابقة23-29.
    ملاحظة: لقد استخدمنا كلا من برامج الاستحواذ Tidelwave25 ، ومؤخرا ، Ephus26 ، المكتوبة في Matlab وتم تطويرها بواسطة مختبر Karel Svboda في Janelia Farms30. للحصول على وصف كامل للتحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر في أفسوس ، انظر Suter et al.26 والدليل التفصيلي30.
    ملاحظة: الإعداد الموضح في هذه المقالة مشتق من الإعداد الموضح من قبل Shepherd (2012)23. يتم توجيه شعاع الليزر عبر نظام شعاع مفتوح من المرايا إلى المنفذ العلوي للمجهر من خلال العدسة الشيئية على الشريحة (الشكل 2).
  2. قم بتحويل جزء صغير من الليزر إلى الصمام الثنائي الضوئي باستخدام غطاء مجهر يوضع في مسار الليزر واستخدم الإخراج الحالي من هذا الصمام الثنائي الضوئي لمراقبة شدة الليزر أثناء التجارب.
    1. معايرة خرج تيار الصمام الثنائي الضوئي المسجل في البرنامج إلى طاقة الليزر المقاسة في المستوى البؤري الخلفي للهدف باستخدام مقياس الطاقة أثناء إعداد المعدات23.
  3. تحكم في قوة الليزر عن طريق تدوير عجلة متغيرة الكثافة محايدة. تراوحت طاقة الليزر المستخدمة بين 25-70 ميجاوات (في المستوى البؤري الخلفي) في تجاربنا.
  4. اضبط طول وتوقيت تحفيز الليزر عن طريق تعديل معلمات النبض لليزر والمصراع. عادة ما يكون طول التحفيز بالليزر 2 مللي ثانية.
  5. التقط صورة للمنطقة المراد تحفيزها باستخدام وظيفة "الاستيلاء على الفيديو".
  6. حدد شبكة التحفيز وفقا للأبعاد المطلوبة. نستخدم عادة مصفوفة تحفيز 16 × 16 مع تباعد 80 ميكرومتر بين الصفوف والأعمدة المجاورة.
  7. تراكب شبكة التعيين بالصورة المكتسبة واضبط إزاحة x و y و degree إلى الموقع والاتجاه المطلوبين.
  8. قم بتنشيط وظيفة "الخريطة" لبدء التحفيز والحصول على البيانات.
  9. بعد الحصول على استجابات التحفيز الضوئي ، قم بإجراء تحليل للبيانات المعينة باستخدام برنامج تحليل الخرائط غير المتصل بالإنترنت في Tidelwave25 أو برنامج "MapAnalysis" في Ephus26.
< p class = "jove_title" >5. تصوير الشريحة الثابتة

  1. بعد التسجيلات ، انقل شريحة الدماغ إلى 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 0.01 M PBS (pH7.4) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  2. انقل الشريحة في 30٪ سكروز في 4٪ PFA / 0.01 M PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بقص أقسام 50 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد وجمعها في 0.01 M PBS.
  4. اشطف الأقسام في 0.01 M PBS مرتين في درجة حرارة الغرفة.
  5. قم بتركيب الأقسام والغطاء في وسط مناسب مضاد للبهتان.
  6. نقل الأقسام إلى المجهر متحد البؤر.
  7. ركز على عائد الاستثمار باستخدام الضوء الأبيض.
  8. اختر الطول الموجي وحجم التصوير والتكرار للحصول على الصورة. بالنسبة ل YFP ، نستخدم 514 نانومتر (Ex) / 527 نانومتر (Em).

النتائج

تم تنفيذ التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للإسقاطات العصبية بين المنطقة البصرية الأولية (V1) والمنطقة البصرية الثانوية (V2) في الفأر بعد حقن pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP في المنطقة V1 لفأر من سلالة Balb/C (الشكل 3). ويقوم محفز CaMKIIa في هذا التركيب الفيروسي بتوجيه التعبير النوعي لبروتين channelrhodopsin-EYFP في العصبونات الاستثارية الغلوتاماتيرجية.1,15بعد تحضير الشرائح للتسجيل الفسيولوجي، فإن تعبير ألياف الـ channelrhodopsin-EYFP، أي: لُوحظ الفلورة فوق البنفسجية لبروتين EYFP المقترن وهو ينتقل من V1 إلى V2 (الشكل 3أ). بالإضافة إلى ذلك، لوحظت أيضاً الألياف القشرية المهادية في النواة الركبية الوحشية (LGN) (الشكل 3أكشفت تسجيلات تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (Whole-cell patch clamp) من عصبون في المنطقة البصرية الثانية (V2) عن تيارات ما بعد التشابك الاستثارية (EPSCs) التي تم تحفيزها عقب التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للألياف التي تعبر عن بروتين channelrhodopsin-EYFP في الطبقات السفلية من المنطقة V2.الشكل 3ب).

في مثال آخر، تم تحقيق التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للإسقاطات القشرية المهادية من الطبقة 6 للقشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) إلى النواة البطنية الخلفية (VP) باستخدام هذا البروتوكول. هنا، استخدمنا نهج Cre-Lox لاستهداف تعبير channelrhodopsin بشكل محدد في عصبونات الطبقة 6 والإسقاطات القشرية المهادية المعنية. وبشكل صريح، قمنا بحقن pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA في S1 للفئران من سلالة B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd (الشكلان 1 و 4). تعبر سلالة الفئران المعدلة وراثياً هذه عن Cre-recombinase تحديداً في العصبونات القشرية المهادية في الطبقة 621، وبالتالي يؤدي ذلك إلى تعبير ChR-YFP فقط في تلك العصبونات بعد عفنها بواسطة بناء AAV "المؤطر" (floxed). وبعد تحضير الشرائح، لوحظت ألياف channelrhodopsin-EYFP في عصبونات الطبقة 6 والألياف التي تسقط على الطبقة 4 وVP (الشكلان 4A و 4B). وكشف التسجيل الفسيولوجي من عصبون VPm باستخدام تقنية whole-cell patch clamp أن تيارات ما بعد التشابك الاستثارة (EPSCs) يمكن استحثاثها بعد التحفيز الضوئي بالمسح الليزري بالقرب من العصبون المسجل (الشكلان 4C و 4D).

تم تقييم مورفولوجيا الألياف الموصومة بسهولة أكبر بعد التسجيلات الفسيولوجية. هنا، قمنا بإعادة تقطيع (50 μm) تحضيرات الشرائح التي تعبر عن channelrhodopsin-EYFP في العصبونات القشرية المهادية في الطبقة 6 (الشكل 5). وكشف ذلك عن نمط دقيق من الألياف الموصومة التي تعبر من الطبقة 6 إلى الطبقة 4، حيث انتهت وتفرعت بشكل مكثف (الشكل 5A). بالإضافة إلى ذلك، لوحظ دخول الألياف القشرية المهادية إلى المادة البيضاء وهي تعبر باتجاه المهاد (الشكلان 5A و 5B).

مخطط لتحرير الجينات باستخدام Cre-loxP للتعبير الموجه عن ChR-YFP في نموذج فأر.
الشكل 1. توضيح تخطيطي للتعبير الموجه عن channelrhodopsin عبر منهجية Cre-Lox. يتم حقن الفئران المعدلة وراثياً والتي تعبر عن Cre-recombinase في المجموعات العصبية المستهدفة بفيروس 'floxed' يشفر لـ channelrhodopsin المدمج مع بروتين فلوري، مثل YFP. وبعد عملية عفن الجينات (transfection)، ستعبر فقط العصبونات التي تحتوي على Cre-recombinase عن channelrhodopsin-EYFP. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مخطط للمجهر الليزري يوضح بصريات الليزر، والمرآة ثنائية اللون، وكاميرا CCD، وإعدادات المسح.
الشكل 2. توضيح تخطيطي لإعدادات التحفيز الضوئي. (أ) مخطط لإعدادات التحفيز الضوئي بالمسح الليزري. يتم توجيه شعاع الليزر بالتتابع عبر نظام شعاع مفتوح إلى غالق ومرشح كثافة متعادلة (N.D.). وتعكس شريحة غطاء جزءاً من الشعاع إلى ديود ضوئي متصل بمضخم لقياس قدرة الليزر. وتُستخدم جلفانومترات مرآتية لتحديد موقع شعاع الليزر عبر عدسة مسح، والتي توجه الشعاع من خلال منفذ جانبي في الجزء العلوي من المجهر. ثم ينعكس الشعاع لأسفل عبر العدسة الشيئية إلى تحضير الشريحة باستخدام مرآة ثنائية اللون. لمزيد من التفاصيل، انظر Lam وSherman23 وShepherd29. (ب) مثال لنمط شبكة التحفيز الضوئي للتجربة التمثيلية الموضحة في الشكل 3. تظهر شبكة تحفيز بحجم 16 x 16 متراكبة فوق صورة مجهرية لتحضير الشريحة. وتشير النجمة الحمراء إلى موقع عصبون تم تسجيله باستخدام تقنية تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole-cell patch clamp). يتم توجيه موقع شعاع الليزر إلى كل موقع من المواقع 256 في شبكة التحفيز عن طريق التحديد الموضعي المحوسب للجلفانومترات المرآتية. وتوضح الصورة مواقع الليزر لأول 5 مواقع تحفيز. أما الاستجابات من العصبون المسجل للتحفيز الضوئي في كل موقع فهي موضحة في الشكل 3. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مخطط خريطة التصوير العصبي؛ تحليل القشرة البصرية LGN و V1 و V2؛ دراسة الروابط العصبية.
الشكل 3. التحفيز الضوئي بالمسح الليزري للإسقاطات القشرية-القشرية من القشرة البصرية الأولية (V1) إلى القشرة البصرية الثانوية (V2) في الفأر. (A) صورة مجهرية فلورية للإصابة النسيجية تظهر ألياف channelrhodopsin-EYFP من V1 إلى V2 وفي النواة الركبية الجانبية (LGN). يتم تحفيز التعبير المحدد لـ channelrhodopsin-EYFP في العصبونات الغلوتاماتيرجية الاستثارية بواسطة بنية فيروسية تحتوي على محفز CaMKIIa. (B) تيارات ما بعد التشابك الاستثارية (EPSCs) المستحثة من عصبون في V2 عقب التحفيز الضوئي بالمسح الليزري. تشير النجمة الحمراء إلى موقع التسجيل. أشرطة المقياس: (A) 500 µm، (B) 200 pA، 100 msec. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مخطط للطبقة القشرية مع تحليل منطقة VP؛ يوضح خرائط النشاط الكهربائي الدقيق؛ بيانات الفيزيولوجيا الكهربائية.
الشكل 4. التحفيز الضوئي بمسح الليزر للإسقاطات القشرية المهادية من القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) إلى النواة البطنية الخلفية (VP) في الفأر. (أ) صورة فلورية من تحضير الشريحة تظهر ألياف channelrhodopsin-EYFP في S1. (ب) صورة فلورية للألياف المحددة في VP. (ج) تيارات ما بعد التشابك الاستثارية (EPSCs) المستحثة من عصبون في VP عقب التحفيز الضوئي بمسح الليزر. (د) مخطط لمتوسط تيارات EPSCs. تشير النجمة الحمراء إلى موقع التسجيل. تتوافق الآثار المحددة في (ج) مع القيم المحددة في (د). أشرطة المقياس: (أ) 250 µm، (ب) 250 µm، (ج) 100 pA، 100 msec. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

مجهر فلوري يوضح الهياكل العصبية، المحددة بعلامات خضراء؛ مخطط مقارنة.
الشكل 5. تصوير عصبونات الطبقة 6 التي تعبر عن channelrhodopsin-EYFP في القشرة الحسية الجسدية الأولية (S1) للفأر. (A-B) عصبونات محددة في الطبقة 6 وألياف ممتدة إلى الطبقة 4 والمادة البيضاء. أشرطة المقياس: (A) 250 µm، (B) 250 µm. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المناقشة

يوضح البروتوكول الموصوف بالتفصيل نهجا للتقييم في المختبر للتضاريس الوظيفية وفسيولوجيا الدوائر العصبية ، والذي لا يقتصر على التحقيق في دوائر الدماغ الأمامي ، أي تلك الموجودة في المهاد والقشرة. تم توفير العديد من التركيبات الفيروسية للتعداء البصري الوراثي للمجتمع العلمي ويمكن الحصول عليها بسهولة من UNC Vector Core. للحصول على وصف للتركيبات الفيروسية المتاحة بسهولة ، راجع UNC Vector Core31 ، صفحة موارد علم البصريات الوراثي في مختبر Deisseroth في جامعة ستانفورد32 ومختبر Boyden لعلم الأعصاب الاصطناعي في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا33. تم تطوير متغيرات هذه الأوبسين من قبل هذه المختبرات وتتيح أوضاعا واسعة النطاق للتحكم في استثارة الخلايا العصبية1،2. يتطلب الحصول على هذه النواقل من UNC Vector Core اتفاقية نقل المواد من المختبرات الأصلية. في هذا البروتوكول ، نلاحظ أن إضافة البوليبرين تعزز فعالية تعديس. بالإضافة إلى ذلك ، هناك متغير آخر يؤثر على التعبير وهو فترة التعافي بعد الجراحة ، والتي نلاحظ أن فترة 14 يوما على الأقل كافية للحصول على تعبير قوي في مسارات الدماغ الأمامي للفئران.

من أجل التعداء المستهدف لمجموعات عصبية معينة ، تم تطوير العديد من خطوط الفئران المعدلة وراثيا Cre-، والتي يمكن استخدامها مع التركيبات الفيروسية ذات إطار القراءة المفتوح "المتساوية" التي تمتطويرها 11. تتوفر العديد من السلالات ذات الصلة بأبحاث علم الأعصاب من خلال مراكز الموارد الإقليمية للفأر المتحولة34. يتم تقديم أطالس أنماط تعبير Cre-recombinase في هذه الخطوط المعدلة وراثيا من خلال قاعدة بيانات GENSAT35. بالإضافة إلى ذلك ، تقدم مختبرات جاكسون العديد من السلالات المعدلة وراثيا ، بالإضافة إلى سلالات أخرى تعبر بشكل أساسي عن opsins في مجموعات عصبية محددة. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لاستخدام خطوط الفئران هذه في مراعاة الوقت اللازم للحصول على مستعمرة تكاثر وإنشائها ، والتي قد تختلف بناء على سلالة معينة ذات أهمية.

بالنسبة للتحفيز الضوئي ، استخدمنا وتكييفنا الإعداد الذي طوره مختبر الراعي في جامعة نورث وسترن ، والموصوف في بروتوكولحديث 29. على الرغم من تحسينه لفك الغلوتامات ، إلا أن هذا الإعداد قابل أيضا للتحفيز الضوئي للقناة رودوبسين دون تعديل. يتيح هذا الإعداد التحكم المكاني الدقيق وتحديد مواقع التحفيز الضوئي ، مما يتيح تقييم التضاريس الوظيفية لتعصيب قناة رودوبسين للخلايا العصبية المسجلة. على الرغم من تعزيز التحكم المكاني باستخدام طريقة التحفيز الضوئي هذه ، إلا أنها باهظة التكلفة أكثر من الطرق التي تستخدم إضاءة المجال القائمة على LED20. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم توحيد أنسجة المخ هو قيد لعلم البصريات الوراثي ، أو أي تقنيات تنطوي على التلاعب بالضوء. من الناحية العملية ، نادرا ما يكون عاملا لأن النتائج تفسر في الغالب بطريقة نوعية. في حالة الحاجة إلى مزيد من المقارنة الكمية بين مناطق الدماغ ، يمكن للمرء دائما استخدام أقصى شدة للضوء لتحقيق استجابات "مشبعة".

بالإضافة إلى ذلك ، استخدمنا كلا من برامج Tidelwave و Ephus المكتوبة في Matlab للتحكم في التحفيز الضوئي بالمسح الضوئي بالليزر والحصول على البيانات25،26. ومع ذلك ، فمن المستحسن أن يستخدم أولئك الذين يقومون بإعداد نظام مماثل برنامج Ephus26 الأحدث ، والذي يتوفر الدعم من خلال موقع تطوير Janelia Farms30. تتمثل الخطوة الأساسية في اختيار أي من حزم البرامج هذه لاستخدامها ، نظرا لأن متطلبات أجهزتها تختلف قليلا. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم برامج تحليل الخرائط وفقا لبرامج الحصول على البيانات الخاصة بها.

يمكن تعديل العديد من هذه الخطوات لتناسب الإعداد الخاص بالممارس. يمكن إجراء حقن المحاليل الفيروسية باستخدام آليات التوصيل إلى جانب المحقنة ، على سبيل المثال ، تعمل الماصات الزجاجية الشعرية المسحوبة إلى أقطار الأطراف ~ 40 ميكرومتر بشكل جيد أيضا. بالنسبة للعمليات الجراحية ، يمكن استبدال حامل الرأس غير التجسيمي إذا لم تكن هذه الإحداثيات مطلوبة لتوجيه الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تغيير تركيبات ACSF والمحلول داخل الخلايا اعتمادا على المتطلبات التجريبية المحددة ، على سبيل المثال استبدال السيزيوم أو محلول عالي الكلوريد داخل الخلايا لعزل التيارات المثبطة. أيضا ، يمكن أيضا إجراء بديل لتصوير أنماط التعبير في شرائح ثابتة في الشريحة الحية على جهاز تصوير مناسب مع نظام تروية الحمام.

باختصار ، سيمكن هذا البروتوكول الممارس من توصيف التضاريس الوظيفية وعلم وظائف الأعضاء المشبكي للإسقاطات في المختبر ، والتي قد لا تكون ممكنة باستخدام الطرق القياسية ، على سبيل المثال. توصيف الإسقاطات بعيدة المدى التي لا يمكن حفظها في شريحة. يمكن تطبيق بروتوكول التعدي الموصوف على التجارب البصرية الوراثية في الجسم الحي 1-3،12،14 ، نظرا لأن آلية التسليم هي نفسها. أخيرا ، على الرغم من أن هذا البروتوكول يصف تعداء الفئران ، إلا أنه يمكن استخدام العديد من النواقل الفيروسية المتاحة لنقل هذه الأوبسين والتعبير عنها نظريا في مجموعة واسعة من أنواع الثدييات ، مما يتيح عددا لا يحصى من الدراسات المقارنة والخاصة بالأنواع1-3.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة. تلقى المؤلف (CCL) منحة نشر من Leica Microsystems ، والتي تنتج أداة مستخدمة في هذا التصوير لهذا البروتوكول.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منحة NIH / NIDCD R03 DC 011361 ، ومنح SVM CORP LAV3202 ، ومنحة NSF-LA EPSCoR PFUND86 ، ومنحة نشر من Leica Microsystems (CCL) ومنحة NIH / NIDCD R01 DC 008794 (SMS).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PolybreneSanta Cruz BiotechSC134220
Paraformaldehyde 32٪ حلEMS15714
VECTASHIELDVector LabsH-1400
AAV التركيبات الفيروسيةUNC Vector CoreNA
Mouse حامل رأس تجسيميStoelting51730
حاقن Nanocoolهارفارد جهاز703040
ليزر الأشعة فوق البنفسجية: 355 نانومتر ، Nd: YVO4 ؛ 1 واط ؛DPSS Lasers، Inc3500
GalvonometersCambridge Scanning6210
MirrorsCambridge Scanning6m2003S-A
mountCambridge Scanning6102103L
كابلكامبريدج المسحالضوئي 6010-19-120
سائق / وحدة تحكمكامبريدج المسحالضوئي 67121-1
مصراع - مطلي ZM (متوافق مع الأشعة فوق البنفسجية)UniblitzL23-ZM2
Shutter ControllerUniblitzVMM-D1
مضخم التيارStanford Research SystemsSR570
6713 المجلسالوطنيللأدوات 777741-01
2110 صندوق الاختراقNationalInstruments 777643-01
PCI-MIO-16E-4الأدوات الوطنية777383-01
BNC-2090الأدوات الوطنية777270-01
الكابلاتالوطنية الآلات184749-01
MATLABMathworks
TCS SP2Leica Microsystems

المراجع

  1. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).
  2. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).
  3. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, 9-34 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons. Neuron. 33, 15-22 (2001).
  6. Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).
  7. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
  8. Lanyi, J. K. Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump. Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).
  9. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2, (2007).
  10. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).
  11. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  12. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  13. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit. Science. 324, 354-359 (2009).
  14. Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. Gain control by layer six in cortical circuits of vision. Nature. 483, 47-52 (2012).
  15. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
  16. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).
  17. Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65, 230-245 (2010).
  18. Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. Intracortical convergence of layer 6 neurons. Neuroreport. 23, 736-740 (2012).
  19. Mancuso, J. J., et al. Optogenetic probing of functional brain circuitry. Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).
  20. Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons. J. Vis. Exp. (57), (2011).
  21. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).
  22. Cox, C. L., Sherman, S. M. Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus. Neuron. 27, 597-610 (2000).
  23. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat. J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).
  24. Lam, Y. W., Sherman, S. M. Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus. Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).
  25. Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex. Neuron. 38, 277-289 (2003).
  26. Suter, B. A., et al. Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments. Front Neural Circuits. 4, (2010).
  27. Lee, C. C., Sherman, S. M. Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).
  28. Lee, C. C., Sherman, S. M. Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission. Hear Res. , 287-2843 (2012).
  29. Shepherd, G. M. Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate. , Cold Spring. 998-1004 (2012).
  30. ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: http://www.ephus.org (2003).
  31. UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: http://genetherapy.unc.edu/services.htm (2003).
  32. Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics (2003).
  33. Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: http://syntheticneurobiology.org (2003).
  34. Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.mmrrc.org (2003).
  35. GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: http://www.gensat.org/cre.jsp (2003).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Cre lox
الليزر مسح ضوئي للدوائر الدماغ الأمامي المستهدفة Optogenetically
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.