مقالة منهجية

تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بوصفه

16.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50928

⸱

أكتوبر 26, 2013

 ,  , 
1Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie, Zentrum für operative Medizin der Universität Würzburg, 2Department of Medicinal Chemistry, Faculty of Life Sciences, University of Vienna

في هذه المقالة

ملخص

في المختبر يتم تطوير نماذج الصدمة إصابات الدماغ إلى إنتاج في الجسم الحي تشوه الدماغ. واستخدمت الإصابة تمتد الناجم عن الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية، الأبهر، والخلايا البطانية الدماغ. ومع ذلك، يستخدم نظامنا حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​النموذج الذي يمتلك خصائص تشكل نموذجا المشروعة للBBB إلى إنشاء نموذج في المختبر TBI.

الملخص

ويرجع ذلك إلى ارتفاع معدل الوفيات الحادثة التي نجمت عن إصابات في الدماغ (TBI)، والطرق التي من شأنها أن تمكن واحد لفهم أفضل للآليات الأساسية التي ينطوي عليها ذلك هي مفيدة لتلقي العلاج. هناك على حد سواء في والمجراة في المختبر الأساليب المتاحة لهذا الغرض. في الجسم الحي النماذج يمكن أن تحاكي إصابة في الرأس الفعلي كما يحدث خلال المصرف التجاري العراقي. ومع ذلك، في الجسم الحي تقنيات قد لا يتم استغلالها لدراسات علم وظائف الأعضاء على مستوى الخلية. وبالتالي، في أساليب المختبر هي أكثر فائدة لهذا الغرض نظرا لأنها توفر سهولة الوصول إلى الخلايا والبيئة خارج الخلية للتلاعب.

يقدم بروتوكول لدينا نموذج في المختبر من TBI باستخدام الإصابة تمتد في الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة. فإنه يستخدم الضغوط التي مورست على الخلايا المستزرعة في آبار مرنة القاع. الضغوط التي مورست يمكن بسهولة أن يسيطر ويمكن ان تنتج الاصابة التي تتراوح من منخفضة إلى شديدة. في الفئرانالدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) ولدت في المختبر لدينا هو نموذج مناسبة تماما للحاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​وبالتالي توفير ميزة لغيرها من النظم التي تستخدم تقنية مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لبساطة الأسلوب، يتم تكرار بسهولة التجريبية مجموعة عمليات. وهكذا، وهذا النموذج يمكن استخدامه في دراسة الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في المصرف التجاري العراقي في BBB.

المقدمة

إصابات في الدماغ (TBI) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. تتأثر حوالي 10 مليون شخص سنويا من قبل المصرف التجاري العراقي مما يجعلها صحية كبيرة ومشكلة طبية 1. ونتيجة لهذا، ومختلف في الجسم الحي ونماذج في المختبر من TBI وأنشئت وتطورت لدراسة آلياتها 2،3،4. فهم أفضل من TBI يمكن أن تساعد على تحسين علاج المريض وتقلل من الوفيات المرتبطة بها، اعتلال، والتكلفة.

نماذج كثيرة لإصابات الدماغ التي تستخدم على حد سواء في والمجراة في المختبر أساليب الوجود. في النماذج الحية يمكن أن تحاكي الحدث الفعلي من إصابة في الرأس. ومع ذلك، ونظرا لتعقيد الوضع في الجسم الحي، وسهولة الوصول إلى الأنسجة من الاهتمام ويصبح محدودا 2. في فهم الاستجابة الفسيولوجية من الخلايا الفردية نتيجة للإصابة وقعت، فمن المهم أن يتم عزل الخلايا من التأثيرات الشاملة التيقد تمنع أو تغيير استجابتهم الفردية 5. لهذا السبب، ونماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6.

في أنظمة المختبر التي توظف استخدام حمولة الميكانيكية إلى الخلايا أو الأنسجة لتحديد التعديلات التي تسببها مثل هذه الطريقة من الإصابة وقد وضعت. على سبيل المثال، تم تأسيس طريقة لدراسة تأثير الإصابة الميكانيكية إلى الخلايا النجمية ل، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 7،8،9. في المختبر نموذج الصدمة التي أنشئت لدراسة القوارض والقابلية للتفاعل نجمية الإنسان 10 يعمل جهاز التحكم في ضغط متطابقة إلى ما نستخدمه لنموذجنا. تم تطبيق نفس الأسلوب للحث على الإصابة من خلال تمتد في الدماغ microvessel الخلايا البطانية الماوس (bEnd3) 11 والخلايا العصبية القشرية 12،13 وكذلك، endoth الدماغيخلايا الخنازير الليل من الأطفال حديثي الولادة 14. الجهاز بتشوهات الجزء السفلي من ثقافة جيدا وبالتالي إنتاج الميكانيكية إصابة تمتد 10. أنه يلحق الضرر على الخلايا المستزرعة من تطبيق ضغط الهواء فوق الخلايا. هذا الضغط يمكن أن يصرف الغشاء الذي على الخلايا تنمو، وبالتالي تمتد الخلايا. ويمكن تحقيق درجات مختلفة من التمدد (أي "منخفض" المعتدلة "، أو" خطير ") عن طريق تحديد مدة النبضة الضغط الجوي وكثافة وفقا لذلك. ارتبط هذا الأسلوب من الإصابة التي يسببها تمتد مع الإصابات في الجسم الحي 7. علاوة على ذلك ، وهذه الطريقة من الإصابة يسمح لمراقبة دقيقة من البيئة خارج الخلية ويمكن بسهولة أن تتكرر.

على الرغم من أن نهج مماثل قد استخدمت للعديد من أنواع خلايا الدماغ الأخرى بما في ذلك bEnd3، نموذجنا هو مزية من حيث أنه يجعل من استخدام الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الفئران (cEND) التي تم إنشاؤهافي المختبر لدينا. هذا خط الخلية هو نموذج مناسبة تماما من حاجز الدم في الدماغ (BBB). في مزارع الخلايا في المختبر تستخدم كنماذج BBB ينبغي أن تمتلك الخصائص التي تمكنها لتكون بمثابة شاشة النفاذية. أحد المعايير الهامة لفي نموذج الخلية المختبر ليكون مؤشرا من BBB نفاذية هو أنه ينبغي أن تمتلك بنية الخلية من الناحية الفسيولوجية واقعية 15. على الرغم من bEnd3 الخلايا عرض مميز المغزل شكل يشبه الحرشفية في الثقافة 16، أنهم يظهرون سلوكا التخلق غير النظامية في المختبر حيث أنها تشكل تجاويف تشبه الكيس بدلا من تركيبات أنبوبية العادية في الليفين المواد الهلامية 17. وعلاوة على ذلك، عندما تم حقن الخلايا الجنينية في الفئران والأطفال حديثي الولادة، والتي يسببها تزايد بسرعة الأورام المميتة على الفئران الجنينية ولكن ليس في الفئران حديثي الولادة وصغار. وبالتالي اقترح أن العمليات التي تحكم واحد أو أكثر طبيعي البطانية النمو، والهجرة، والتمايز قد تم تعديلها أو eliminatإد في هذا الخط الخلية 18. من ناحية أخرى، تظاهر المورفولوجية والتقييم immunocytochemical من قياسات التدفق البطانية وBBB التعبير علامة، الكهربيولوجي، وparacellular أن لدينا نموذج BBB cEND هو في الواقع نموذج مناسب من BBB 19.

يتميز البطانة الدماغ في الجسم الحي من قبل نفاذية ضيق للغاية مع المقاومة الكهربائية عبر البطانية (طير) تتراوح بين 2،000-5،000 Ωcm 2. لدراسات الدماغ خصائص الحاجز الأوعية الدموية الدقيقة لصيدلة، ينبغي النظر التقييد paracellular وضيق من الخلايا. في معظم الدماغ الخلايا البطانية الشعرية (BCEC)، وهذا لا يتم الاحتفاظ باسم خلايا المعرض طير تتراوح 50-100 Ωcm 2 20. وخلد الدماغ البطانية خلية bEnd3 خط يولد القيم طير من لا يزيد عن 60 Ωcm 2 15. في المقابل تمايز الخلايا cEND مع المتوسط ​​تحتوي خفض العرض المصلالقيم طير تتراوح 300-500 Ωcm 2 19،21.

حتى الآن، نماذج في المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ النادرة. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف الخلايا البطانية الدماغ التي تكون بمثابة نموذج للBBB قد تكون مفيدة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم نموذج في المختبر يمكن أن تحاكي التأثير الفعلي أن خلايا الدماغ، وتحديدا الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة من BBB، تتلقاه خلال المصرف التجاري العراقي. والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو أن كمية من إصابة تطبيقها على خلايا وكذلك بيئة خارج الخلية يمكن السيطرة عليها بسهولة بطريقة دقيقة مما يتيح سهولة استنساخ التجريبية انشاء.

البروتوكول

1. البذر من الخلايا البطانية في لوحات جيدة

  1. زراعة الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران الخلايا البطانية (cEND) في T75 قارورة الثقافة، وتغيير المتوسطة (DMEM تحتوي على 10٪ FCS، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، 1٪ L-الجلوتامين) مرتين في الأسبوع، حتى يتم التوصل إلى نقطة التقاء. (للاطلاع على جيل وتخليد من الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة، الرجاء مراجعة Burek وآخرون، 2012؛. فورستر وآخرون، 2005 21،19).
  2. غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني ويعرض للتريبسين الخلايا مع 2 مل دافئ حل التربسين EDTA-.
  3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى فرقت طبقة الخلايا.
  4. إضافة 8 مل مستنبت في الخلايا. اضغط على قارورة عدة مرات لفصل الخلايا.
  5. عرض الخلايا تحت المجهر لضمان حياد تام من القارورة.
  6. ماصة المتوسطة مع الخلايا منفصلة صعودا وهبوطا. دوامة القارورة لمزج suspensi الخليةعلى.
  7. يستغرق 20 ميكرولتر لتعليق الخلية، وضعت في عدادة الكريات وحساب عدد الخلايا.
  8. تحديد كثافة الخلية والبذور 20،000 خلية / سم 2 في البئر.
  9. نقل تعليق خلية في collagen1 precoated 6 جيدا مرنة القاع لوحات ثقافة (57.75 سم 2) في إجمالي حجم 3 مل / جيد. كل بئر تبلغ مساحتها 9.62 سم 2.
  10. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد حتى متموجة. تغيير ثقافة المتوسط ​​مرتين في الأسبوع.

2. تمايز الخلايا قبل الاصابة الإمتداد التي يسببها

  1. تغيير ثقافة المتوسط ​​من الخلايا مع تمايز المتوسطة (DMEM تحتوي على 1٪ مصل-جردت مصل العجل الجنين (ssFCS)، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين).
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

3. الاصابات التي يسببها تمتد من الخلايا البطانية

  1. بدوره على إصابة جهاز تحكم الخلية.
  2. تعيين التأخير إلى 50 ميللي ثانية.
  3. ضبط منظم ضغط إلى 15 رطل لكل بوصة مربعة واضغط على الزناد عدة مرات حتى يصبح الضغط الذروة المسجلة مستقرة.
  4. ضبط منظم ضغط إلى القيمة المطلوبة. استخدام الجدول 1 كدليل لتوليد درجات مختلفة من إصابات التمدد.
  5. وضع لوحة الثقافة مرنة ذات قاع 6 جيدا (57.75 سم 2) في حامل صينية. تأكد من أن يتم تعيين محدد جيدا لحجم جيدا الصحيح (أي بئر كبيرة).
  6. ضع قابس محول بشدة على البئر. الاستمرار على قابس بقوة في مكانها بيد واحدة بينما من ناحية أخرى يدفع على الزناد.
  7. تسجيل ذروة الضغط المتولدة.
  8. وضع لوحة على الفور العودة الى الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة من الوقت المطلوب أو استخدامها على الفور للنجاح التجارب أو التقييم.

4. تقييم الاصابات الإمتداد بواسطة الفحص صبغ امتصاص

  1. وفور الخلايا STRمحفورا (الخطوة 3.7)، إضافة 30 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل للبقاء وصمة عار أن يقوم بدور المنبه السمسة (يرجى الاطلاع على الجدول التكميلي للمواد والمعدات) إلى مستنبت الخلية (ملاحظة: 10 ميكرولتر من محلول الصبغة هو لاستخدامها في كل مل من مستنبت الخلية).
  2. عند إضافة الصبغة إلى الخلايا، وعرض على الفور تحت المجهر مضان.

5. تقييم الاصابات الإمتداد بواسطة إنزيم اللاكتات (LDH) بيان

  1. مباشرة بعد وتمتد الخلايا (الخطوة 3.7)، وإزالة 200 ميكرولتر من مستنبت الخلية من البئر. تفعل الشيء نفسه بالنسبة كل نقطة زمنية بعد الاصابه كنت ترغب أن تدرج في التحقيق الخاص من LDH الإفراج (أي على سبيل المثال 30 دقيقة، 1 ساعة، 2 ساعة، الخ.)
  2. أجهزة الطرد المركزي في مستنبت الخلية في أعلى الإعداد من microcentrifuge لمدة 5 دقائق لإزالة أي حطام خلية. إزالة طاف واستخدام هذا للخطوات اللاحقة.
  3. بمجرد حأنهى افي الخطوة 5.1 و لقد أخذ العينات الضرورية التي ترغب في الحصول من النقاط الزمنية المختلفة التي ترغب في التحقيق، ليز الخلايا باستخدام الحل تحلل المدرجة في LDH فحص عدة (انظر الجدول التكميلي للمواد والمعدات).
  4. وضع 100 ميكرولتر من مقايسة المتوسطة المدرجة في مقايسة كيتو كل بئر من لوحة 96 بئرا المنصوص عليها في عدة.
  5. وضع 100 ميكرولتر من خلية خالية من الخلايا المتوسطة الثقافة في بئرين موازية من لوحة 96-آبار المدرجة في هذه المجموعة مقايسة.
  6. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. قراءة الامتصاصية في 492 نانومتر.

النتائج

الخلايا المستزرعة على الكولاجين أنا precoated 6 جيدا مرنة لوحات ثقافة القاع (57.75 سم 2) تعرضوا لدرجات مختلفة من الإصابة تمتد باستخدام جهاز نقالة الخلية. بعد إخضاع الخلايا للإصابة، وكانوا فحصها تحت المجهر لآثار الإصابات التي يسببها تمتد إلى مورفولوجيا الخلايا. ولوحظ أن درجة أكبر من امتداد كما تم تطبيقها على الخلايا ويمكن أيضا أن يلاحظ وجود درجة أكبر من تشويه الخلية (الشكل 1). كما هو مبين في الشكل 1A، خلايا السيطرة التي لم تتعرض للإصابة تظهر بشكل منتظم على شكل الخلايا البطانية الوعائية (cEND) دون أي إشارة من تورم الخلية أو تشويه. عندما تم تطبيق الإصابة تمتد (أرقام 1B-D)، ويمكن ملاحظة التشوه تحت المجهر الخفيفة. بعد تمتد الخلايا بشدة مع الضغط الذروة بين 3.5-4.5 رطل، ظهرت الخلايا cEND تراجع بشكل ملحوظ، وتورم ومشوه مع لا المسافات بين الخلايا قادرة. وبالإضافة إلى ذلك، زادت أيضا من امتصاص الجدوى وصمة عار (100 نانومتر تركيز النهائي) كما تمت زيادة درجة الإصابة تمتد (الشكل 2). الجدوى وصمة عار المستخدمة هي impermeant صبغ الخلايا السليمة إلى أن يصبح نفيذ عندما يتم اختراق غشاء البلازما سلامة الخلايا. تم استبعاد الصبغة من معظم الخلايا السيطرة، وبالتالي، كانت ملطخة فقط عدد قليل من الخلايا (الشكل 2A) بالمقارنة مع الخلايا امتدت (أرقام 2B-D). المزيد من الخلايا fluoresced الأخضر مع درجة التعرض للإصابات التمدد.

كعلامة البيوكيميائية للإصابة، وإطلاق سراح من نازعة اكتات (LDH) تم فحص انزيم أيضا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. يظهر الشكل رقم 3 أن زيادة الخلية تمتد الإصابة تسبب زيادة الإفراج LDH.

928/50928fig1.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 1. ضوء الفحص المجهري للخلايا طبيعية مقابل الجرحى. (A) عادي غير المتمدد أحادي الطبقة الخلية متكدسة معبأة istightly وممدود. عندما تم امتدت الخلايا عن طريق تطبيق الضغط نبض ذروة 1.8-2.0 رطل (أي امتداد منخفض) تظهر أقل المدمجة، ومساحات يتبين من السهام (B). عندما الخلايا أصيب باعتدال مع 2.5-3.0 ذروة الضغط والنبض، وبعض منهم ظهرت منتفخة ومشوهة (C). الخلايا تصبح تراجع مع امتداد شديدة من 3.5-4.5 رطل، كما يشير إليه السهم (D). التكبير 100X. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-1
الشكل 2. فلورescence الفحص المجهري للخلايا الطبيعية مقابل إصابة الخلايا تعامل مع بقاء 2HR وصمة عار بعد إصابة A: خلايا غير المتمدد السيطرة دينار بحريني: خلايا امتدت (B - منخفض، C - معتدل، D - شديد).. التكبير 100X. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-2
الشكل (3). وقد تم قياس اللاكتات نازعة (LDH) الافراج الانزيم في طاف بعد إصابة التمدد. LDH تطلق في مستنبت على فترات زمنية مختلفة تمتد بعد الإصابة التي يسببها. وأعرب عن LDH كنسبة مئوية من إجمالي LDH نشره (LDH في وسائل الإعلام بالإضافة إلى الخلايا). القيم هي ± SEM. ن عن كل نقطة زمنية هي 5، باستثناء ساعة 0 Value يتعرض إلى تمدد شديد حيث n = 3. لم الإفراج LDH من الخلايا التي تعرضت لتمتد منخفضة ومعتدلة لا تختلف كثيرا عن تلك الضوابط غير المتمدد وعن بعضها البعض. الخلايا التي تم امتدت بشدة الإفراج عن مبلغ أكبر بكثير من LDH بالمقارنة مع جميع العينات الأخرى، باستثناء عينة امتدت معتدلة في 1 ساعة. (P <0.05، عامل واحد ANOVA، طريقة هولم-Sidak). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الجدول 1. توجيه لتوليد درجات مختلفة من إصابات التمدد.

منظم ضغط الضغط الذروة درجة الإصابة
15 PSI 1.2-1.5 رطل <منخفض
20-25 PSI 1.8-2.0 رطل منخفض
30-35 PSI 2.5-3.0 رطل معتدل
40-50 PSI 3.5-4.5 رطل حاد
60 PSI 4،8-6،0 رطل > الشديدة

المناقشة

وقد درس تأثير الإصابة الميكانيكية في المختبر، وأنشئت طرق الخلايا النجمية، الخلايا العصبية، الخلايا الدبقية والخلايا البطانية الأبهر 8، 9، 22. هناك، ومع ذلك، لا يزال حتى الآن لا يعرف في نموذج المختبر من الإصابة تمتد في مثقف الخلايا البطانية الدماغ. نماذج الخلوية من الصدمة توفر مزايا قيمة على النماذج الحيوانية منذ البيئة الميكانيكية للخلايا يمكن تسيطر على وجه التحديد 6. وبالتالي، نموذج في المختبر لصدمة بسبب الاصابة تمتد باستخدام مثقف خلايا المخ البطانية التي تكون بمثابة نموذج من حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​مثل ما يعرض بروتوكول لدينا قد تكون مفيدة.

هذا البروتوكول يجعل من استخدام الخلايا cEND، وهو نموذج BBB أنشئت في المختبر لدينا. منذ غالبا ما تم توثيقه BBB انهيار في المرضى الذين يعانون المصرف التجاري العراقي TBI وغالبا ما يرتبط اختلال BBB الذي يمكن أن يؤدي إلى تشكيل وذمة 23، 24، وطريقة بريهented هنا على وجه التحديد قد يمكن استخدامها في إجراء الدراسات BBB فيما يتعلق TBI.

في هذا النموذج، فمن المهم أن تأخذ الرعاية من مدى يتم تطبيق درجة الإصابة تمتد إلى الخلايا. في بقدر ما يصابون الخلايا في أي حال، وأيا كان مع كمية الضغط يتم تطبيقها، ودرجة الإصابة التي يمكن أن تؤثر الخلايا البطانية تختلف كثيرا كثيرا من أنواع الخلايا الأخرى. الخلايا البطانية الأبهر هي أكثر مقاومة للإصابة تمتد من الخلايا النجمية أو الخلايا الدبقية المختلطة 9. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها إصلاح بسرعة أكبر بعد الإصابة بالمقارنة مع أنواع الخلايا الأخرى. لذلك، للخلايا البطانية الدماغ، الخلايا cEND خاصة، أكبر كمية من الإصابة تمتد اللازمة لإنتاج على درجة عالية من الاصابة. يمكن للمرء تحقيق الدرجة المطلوبة من الإصابة من خلال تطبيق ضغط المقابلة مبين في الجدول 1. لخلايا cEND، ومع ذلك، ويفضل إصابة شديدة بسبب مقاومتهم للتوتر. أظهرت فحوصات أجريت LDHكما أن درجة زيادات تمتد، ويفرز أكثر LDH في طاف. في المقابل، فإن الخلايا التي أعطيت كمية قليلة من الإصابة تمتد أنتجت LDH في مبلغ مماثل للسيطرة على الخلايا. كما ورد في البروتوكول، يجب على المرء الحرص على أن يتم استخدام كمية مناسبة من المتوسط ​​منذ زيادة أو نقصان في كمية متوسطة قد يؤدي إلى اختلافات في الضغط الذروة تطبيقها على الآبار. على سبيل المثال، تحتوي كذلك 5 مل من السوائل يسجل ذروة الضغط في المتوسط ​​من 4.0 رطل بينما بئر فارغة يسجل بمتوسط ​​3.8 رطل عندما يتم تطبيق الضغط 45 رطل لكل بوصة مربعة. لذا، فمن الأفضل لدفع الزناد عدة مرات على مدى التحكم بشكل جيد للتأكد من أن الضغط الذروة التي سيتم إنشاء يتوافق مع المبلغ المطلوب.

في تجاربنا استخدمنا الجدوى وصمة عار لتحديد تأثير تمتد إلى نفاذية غشاء الخلية. البصريات من لوحات ثقافة مرنة ذات قاع كنا تمكننا من السادسEW الخلايا الملون مباشرة تحت المجهر. ومع ذلك، عندما يريد أحد لإجراء دراسات immunolabelling مباشرة بعد تمتد الإصابة، قد تنشأ صعوبات. أولا، قد يكون حجم وسمك لوحة تمثل مشكلة مع بعض منصات العرض المجهر. ثانيا، قد البصريات من غشاء مرن من البئر يكون عائقا لمسح المشاهدة.

على الرغم من القيود المذكورة آنفا، ومع ذلك، فإن الإجراء الموضح يمكن استخدامها كنموذج للفي المختبر إصابة الميكانيكية للBBB. إصابات في الدماغ (TBI) ينطوي على عنصرين، وهما نقص تروية والصدمة. يمكن أن يحدث نقص التروية واصابة الثانوية بعد TBI في الحالات عندما يكون هناك فقدان الدم الخطيرة الناتجة في انخفاض ضغط الدم أو نتيجة لتورم الدماغ تقييد امدادات الاوكسجين الى الدماغ. وتعتبر على أنها تأخر، والضرر غير آلي تمثل العمليات المرضية متتالية بدأت في لحظة إصابة 25. حدوث نقص الأكسجة علىأي fter حادة إصابات في الدماغ هو 26 مشترك. الحرمان الجلوكوز الأكسجين (OGD) هو الأسلوب المستخدمة حاليا إلى نموذج نقص التروية في المختبر. وبالتالي، إخضاع الخلايا لOGD بمثابة إهانة الثانوية إلى الخلايا بعد امتداد يمكن أن تحاكي وقوع TBI يليه نقص التروية. وبالتالي، لتحسين موقعنا الحالي في نموذج المختبر من TBI ونمط ذلك في أقرب وقت ممكن إلى TBI الفعلية كما يحدث في الجسم الحي، في المستقبل سوف تستخدم أيضا OGD في تركيبة مع إصابة التمدد.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG، المؤسسة الألمانية للبحوث) تحت رقم المنحة FO 315/4- والبرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية المنحة رقم HEALTH-F2-2009-241778 إلى CF.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدة التحكم في إصابة الخلية IIالتصميم والتصنيع المخصص ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية  ؛
لوحة ثقافة Bioflex - الكولاجين من النوع الأولFlexcell ، Dunn LabortechnikBF - 3001C& nbsp ؛
دولبيكو s النسر المعدل s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796  ;
مصل عجل الجنين (FCS)مختبرات PAAA15110-1333التركيز النهائي 10٪ ، معطل بالحرارة (30 دقيقة عند 56 درجة ؛ ج)
تخزين L-glutamineBiochrom AGK0282: ≤ -15 & deg ؛ C
MEM فيتامينBiochrom AGK0373التخزين: ≤ -15 ° C
Na-pyruvateBiochrom AGL0473  ؛
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEA)Biochrom AGK0293التخزين عند 4 درجات ؛ C
Penicilin / StreptomycinBiochrom AGA2212التخزين: ≤ -15 & deg; C
مصل عجل الجنين ، تجريد من الفحم (ssFCS) LifeTechnologies12676-011  ؛
حل التربسين-EDTAمختبرات PAAL11-004التخزين: ≤ -15 ° C
Image-iT DEAD GreenLife TechnologiesI10291التخزين: & le; -15 ° ؛ C ، محمي من
الضوء Cellular Detection Kit PLUS (LDH)   ؛Roche4744926001التخزين: ≤ -15 ° ج

المراجع

  1. Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
  2. Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
  3. Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. Experimental traumatic brain injury. Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).
  4. Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
  5. Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
  6. Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
  7. Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
  8. McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
  9. Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
  10. Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
  11. Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
  12. Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
  13. Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
  14. Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
  15. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
  16. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
  17. Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
  18. RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
  19. Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
  20. Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. A cell culturemodel of the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  21. Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
  22. Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
  23. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
  24. Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
  25. Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
  26. Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LDH

مقالات ذات صلة