يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل

9.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/50936

⸱

ديسمبر 30, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Applications Science, Protochips, Inc., 2Virginia Tech Carilion Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

هنا نصف إجراء لتصوير المجمعات الفيروسية في السائل في قرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال.

الملخص

يستخدم الباحثون بانتظام المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEMs) لفحص الكيانات البيولوجية وتقييم المواد الجديدة. هنا، ونحن نصف تطبيق إضافي لهذه الصكوك- عرض التجمعات الفيروسية في بيئة سائلة. هذه الطريقة المثيرة والجديدة لتصور الهياكل البيولوجية تستخدم حامل عينة microfluidic المتقدمة مؤخرا. يوضح مقال الفيديو الخاص بنا كيفية تجميع واستخدام حامل microfluidic لتصوير العينات السائلة داخل TEM. على وجه الخصوص، نستخدم جزيئات ثنائية الطبقات من فيروس الروتا سيميان (DLPs) كنظام نموذج لدينا. كما نقوم بوصف الخطوات اللازمة لتغطية سطح الغرفة السائلة بأغشية بيولوجية تقارب تربط DLPs بنافذة المشاهدة. هذا يسمح لنا لتصوير التجميعات بطريقة مناسبة لتحديد هيكل 3D. وهكذا، نقدم لمحة أولى عن الجسيمات شبه البيئية في بيئة سائلة أصلية.

المقدمة

الهدف المشترك لعلماء الأحياء والمهندسين هو فهم الأعمال الداخلية للآلات الجزيئية. المجاهر الإلكترونية انتقال (TEMs) هي أدوات مثالية لتصور هذه التفاصيل المعقدة في القرار شبه الذري1-2. من أجل الحفاظ على نظام فراغ عالية من TEM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من العينات البيولوجية في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي3،والسكريات4، والأملاحالمعدنية الثقيلة5،أو مزيج من بعض من6. ونتيجة لذلك، قد تكشف صور العينات المضمنة عن لقطات محدودة فقط للعمليات الديناميكية.

قام بارسونز وزملاؤه بمحاولات مبكرة للحفاظ على العينات البيولوجية المرطبة في الغرف السائلة البيئية باستخدام مراحل ضخ تفاضلية. تم تسجيل أنماط الحيود الإلكترون من بلورات كاتالاز غير ملطخة بنجاح إلى قرار من 3 Å في حالةرطبة 7-8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص مجالات الدهون المنفصلة مرحليا في الأغشية المائية من كرات الدم الحمراء البشرية9-10. ومع ذلك ، فإن الحركة الناجمة عن نشر السائل وتدخله في شعاع الإلكترون ، أدت إلى فقدان شديد للقرار ولم تتم محاولة إجراء المزيد من التجارب باستخدام العينات البيولوجية حتى وقت قريب.

وقد تم إدخال أصحاب العينات الدقيقة الفلورية المطورة حديثا التي تستخدم رقائق أشباه الموصلات لتشكيل غرفة بيئية صغيرة الحجم. يمكن لهذه الأجهزة الحفاظ على عينات في السائل في حين يتم وضعها في عمود TEM11-12. وقد سمح هذا الاختراق التقني في التصوير TEM الباحثين لعرض، للمرة الأولى، الأحداث التقدمية على المستوى الجزيئي13. نشير إلى هذه الطريقة الجديدة باسم"في الموقع المجهر الجزيئي" كما يمكن الآن إجراء التجارب "داخل" العمود EM14-15. الهدف العام لهذه الطريقة هو تصوير التجمعات البيولوجية في السائل من أجل مراقبة سلوكياتها الديناميكية بدقة نانومتر. والأساس المنطقي وراء هذه التقنية المتقدمة هو تسجيل الملاحظات في الوقت الحقيقي ودراسة الخصائص الجديدة للآلات البيولوجية في الحل. هذه المنهجية توسع استخدام TEMs لأغراض أوسع في البيولوجيا الخلوية والجزيئية12-16.

في مقال الفيديو الحالي ، نقدم بروتوكولا شاملا لتجميع واستخدام حامل عينة microfluidic متاح تجاريا. يستخدم هؤلاء أصحاب المتخصصة رقاقات نيتريد السيليكون المنتجة مع الفواصل المتكاملة لتشكيل غرفة السائل الذي يحيط أحجام دقيقة من الحل. يتم حفر رقيقة وشفافة النوافذ في الرقائق الدقيقة لأغراض التصوير12. نحن نثبت الاستخدام السليم لحامل microfluidic لفحص جزيئات فيروس الروتا سيميان ذات الطبقات المزدوجة (DLPs) في السائل باستخدام TEM. لضمان أن التجمعات البيولوجية ، مثل DLPs ، لا تنتشر بسرعة على مسافات كبيرة أثناء التصوير ، نستخدم نهج التقاط التقارب لربطها بسطح الغرفةالدقيقة 16. هذه الخطوة التقاط الجزيئية له ميزة كبيرة على التقنيات البديلة لتصوير العينات البيولوجية في السائل لأنه يسمح للحصول على الصور التي سيتم استخدامها لروتين معالجة المصب. هذه الخطوة التقاط المستخدمة جنبا إلى جنب مع التصوير microfluidic فريدة من نوعها لإجراءاتنا17. القراء الذين يستخدمون تطبيقات البيولوجيا الهيكلية باستخدام TEM أو غرف التصوير microfluidic قد تنظر في استخدام تقنيات التقاط تقارب عندما الملاحظات الديناميكية على المستوى الجزيئي هي الهدف النهائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أجهزة التقاط التقارب16

  1. تنظيف رقائق السيليكون نيتريد E عن طريق احتضان لهم في 15 مل من الأسيتون لمدة 2 دقيقة تليها 15 مل من الميثانول لمدة 2 دقيقة (الشكل 1A). السماح للرقائق لتجف تحت تدفق الهواء صفح.
  2. احتضان رقائق المجففة على لوحة اثارة ساخنة (دون اثارة) لمدة 1.5 ساعة في 150 درجة مئوية، ثم السماح لهم لتبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  3. استخدام المحاقن هاملتون لتكوين خليط الدهون في أنابيب زجاجية صغيرة لاحتواء 25٪ الكلوروفورم، 55٪ DLPC (1،2-dilauroyl-phosphocholine) في الكلوروفورم (1 ملغ / مل) و 20٪ ني-NTA الدهون (1،2-dioleoyl-iminodiacetic حمض-سكرينيل-النيكل الملح) في الكلوروفورم (1 ملغ/مل) لحجم إجمالي قدره 40 ميكرولتر.
  4. تطبيق 1 ميكرولتر aliquot من الخليط على كل قطرة 15 ميكرولتر من الماء ميلي كيو على قطعة من بارا فيلم في طبق بيتري الرطبة (الشكل 1B). احتضان عينات على الجليد لمدة 60 دقيقة على الأقل.

2. التقاط الجزيئات الكلية17

  1. ضع رقاقة E مع فاصل متكامل 150 نانومتر على رأس عينة أحادية الطبقة واحتضان لمدة 1 دقيقة(الشكل 1C).
  2. رفع بلطف رقاقة الخروج من العينة وإضافة aliquot 3 ميكرولتر من له الموسومة البروتين A. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة(الشكل 1D).
  3. لطخة بعيدا إسقاط الزائدة باستخدام Whatman #1 ورقة تصفية وإضافة على الفور aliquot 3 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة. حضانة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة الحل الزائد باستخدام حقنة هاملتون وإضافة على الفور 1 ميكرولتر aliquot من DLPs فيروس الروتا (0.1 ملغ / مل) في محلول عازلة تحتوي على 50 م م HEPES (درجة الحموضة 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 و 10 mM CaCl2. حضانة لمدة 2 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. وقد وصفت إعداد DLPs سابقا18.

3. تجميع غرفة Microfluidic وتحميل حامل عينة في الموقع

  1. تحميل الرطب E-رقاقة تحتوي على عينة الفيروسية في غيض من حامل العينة microfluidic. توهج التفريغ الثانية شقة E-رقاقة لمدة دقيقة واحدة ثم تحميلها على رأس رقاقة المسافة(الشكل 2، لوحات 1-5).
  2. بدلا من ذلك، لزيادة التباين من الجزيئات البيولوجية، يمكن إضافة وصمة عار المعادن الثقيلة(على سبيل المثال 0.2٪ أورانيل formate) إلى عينات الرطب قبل وضع الشريحة E الثانية على العينة الرطب. ومع ذلك، فإن الشريحة E التي تحتوي على العينة تحتاج إلى غسلها بماء ميلي كيو قبل إضافة كاشف التباين.
  3. ساندويتش التجميع بأكمله معا لتشكيل الضميمة مختومة، التي عقدت في مكان ميكانيكيا داخل حامل من قبل 3 مسامير النحاس(الشكل 2،لوحات 6-8).
  4. بعد التجميع، يتم ضخ طرف الحامل إلى10-6 تور باستخدام محطة ضخ جافة بضخ توربو قبل وضع الحامل داخل TEM.

4. التصوير في السائل باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

  1. قم بتحميل حامل العينة في الموقع في مجهر إلكترون ناقل الحركة (FEI Company) المجهز بخيوط LaB6 ويعمل بمعدل 120 كيلو فولت.
  2. قم بتشغيل خيوط TEM وضبط الارتفاع المتمحور حول مرحلة المجهر فيما يتعلق بالعينة باستخدام وظيفة المتذبذب لإمالة العينة من -15 درجة إلى +15 درجة ذهابا وإيابا في العمود. هذا الإجراء يضبط المرحلة في الاتجاه z للمساعدة في حساب سمك السليم للغرفة السائلة. تضمن هذه الخطوة أيضا استخدام تكبير دقيق عند تسجيل الصور.
  3. تسجيل الصور على طول حواف وفي مناطق الزاوية من غرفة microfluidic أولا. تحتوي هذه المناطق عادة على الحل أنحف. تسجيل صور العينات في ظل ظروف جرعة منخفضة (1-3 الإلكترونات / Å2)باستخدام كاميرا CCD. استخدام التكبير الاسمي من 6000X - 30000X.
  4. تحديد قيمة ديفوكوس المناسبة من خلال التركيز على حافة غرفة السوائل. استخدم قيمة -1.5 ميكرومتر لتسجيل الصور عند تكبير 30,000X. إذا واجه حل سميك أو إذا لم يتم استخدام عامل التباين في إعداد العينة، استخدم قيم defocus أعلى في نطاق -2 إلى -4 ميكرومتر.
  5. لضمان احتواء الحل في غرفة microfluidic في جميع أنحاء التجارب ، ركز شعاع الإلكترون حتى تتشكل الفقاعات في السائل داخل الجهاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر الصور التمثيلية ل DLPs في السائل باستخدام الرقائق الإلكترونية التي تم تفريغها توهج(الشكل 3A)أقل DLPs في منطقة عرض معينة، ويفترض أن يكون ذلك بسبب الانتشار، بالمقارنة مع DLPs التي يتم إثراء على أجهزة التقاط التقارب(الشكل 3B). إضافة أورانيل formate في غرفة التصوير يعزز التباين من العينة، وبالتالي رؤية DLPs الفردية في الحل(الشكل 3C،لوحة أعلى). أفضل التباين يسمح لمعالجة الصور المصب مثل متوسط الجسيمات(الشكل 3C، لوحة أسفل) و 3D إجراءات إعادة الإعمار

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في عملنا المقدم ، استخدمنا نهج التقاط التقارب لربط DLPs فيروس الروتا إلى منصة microfluidic. وقد سمح ذلك بالتصوير الموقعي للمجمعات الجزيئية الكبيرة في بيئة دقيقة سائلة. نهج التقاط كبيرة فيما يتعلق تقنيات التصوير microfluidic أخرى لأنه ي توطين العينات البيولوجية إلى نافذة التصوير لنفي القضايا الانتشار الكبيرة التي تنشأ أثناء تسجيل الصور في السائل. ومع ذلك ، فإن واحدة من أهم الخطوات في بروتوكولنا تنطوي على نقل بيو فيلم الدهون إلى سطح الرقاقة الدقيقة. إذا فشلت الطبقة الأحادية الدهنية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

صاحبة البلاغ، مادلين ج. ديوك، موظفة في شركة Protochips.

شكر وتقدير

يعترف المؤلفون بالدكتور مايكل ج. فريدلاندر، مدير معهد فرجينيا للتكنولوجيا كاريليون للأبحاث لتشجيعه مساعينا البحثية. وقد تم دعم هذا المشروع من خلال صناديق التنمية لS.M.M وD.F.K. وجزئيا بمبادرة نانو بيو من معهد التكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الرقائق الإلكترونية ، رقاقة فاصلProtochips، Inc.EPB-52TBD400 مو ؛ م × 50 مو ؛ م نافذة
E-chip ، أعلى رقاقةProtochips، Inc.EPT-45W400 & م × 50 مو ؛ m window
Ni-NTA الدهونAvanti Polar Lipids790404Pشكل مسحوق
DLPC (12: 0) دهونAvanti Polar Lipids850335Pشكل مسحوق
قوارير حجمية   ؛فيشر ساينتفيك20-812A; 20-812C1 مل; 5 مل 
محاقن هاميلتونشركة هاميلتون80300 ، 804001-10 & l; 1-25 مو ؛ ل
ورق ترشيح Whatman # 1Whatman1001 090100 قطعة ، 90 مم
أطباق بتري زجاجيةCorning70165-101100 مم × 15 مم
ماصات زجاجية باستورVWR14673-01014673-010
أنابيب ثقافة زجاجيةVWR47729-5666 مم × 50 مم
أسيتونفيشر ScientificA11-11 لتر
ميثانولفيشر ساينتفيكA412-11 لتر
كلوروفورم علوم النسخ المجهريالإلكتروني 12550100 ml 
له الموسومة بروتين AAbcam، Inc.ab5295310 مجم
نظام المياه Milli-QEMD Millipore Corp.Z00QSV001مياه فائقة النقاء
HEPESفيشر ScientificBP310-500500
جم معدات 
Poseidon In situ< / em> حامل العينةProtochips، Inc.  متوافق مع FEI
Spirit BioTwin TEMFEI Co.120 كيلو فولت
النسر 2K HS CCD كاميراFEI Co.10  Å/أخذ العينات بالبكسل في محطة الضخ الجافة 30,000X
Gatan 655Gatan، Inc.طرف حامل المضخة إلى 10-6  < / sup>range
PELCO easiGlow ، وحدة تفريغ التوهجTed Pella، Inc.  وضع القطبية
السلبية Isotemp تسخين لوحةتحريك فيشر ScientificHeat إلى 150 & ordm; C لمدة 1.5 ساعة

المراجع

  1. Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
  2. Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
  3. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
  4. Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
  5. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
  6. Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
  7. Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
  8. Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
  9. Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
  10. Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
  11. Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  12. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
  13. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  14. Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
  15. Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
  16. Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
  17. Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
  18. Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
  19. Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
  20. Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
  21. Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
  22. Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid
Posted by JoVE Editors on 10/10/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/50936

الوسوم

بيئة سائلةحامل الموائع الدقيقةالالتقاط بالألفةالجسيمات الشبيهة بالفيروسات لروتافيروسالتصوير بالمجهر الإلكتروني النافذتصوير الفيروساتتتبع الجسيمات النانويةالمجهر الإلكتروني
في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.