يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50950

⸱

ديسمبر 20, 2013

 ,  ,  , 
1Lehrstuhl für Angewandte Physik and Center for Nanoscience, Ludwig-Maximilians-Universität

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" > السليلوزومات عبارة عن مجمعات متعددة الإنزيمات مصممة لهضم السليلوز. تم استخدام SMFS المستند إلى AFM لدراسة الخواص الميكانيكية والتكوين القابل للطي لتجميعات البروتين المرتبطة بالسليلوزوم. نقدم سير عمل كامل لتثبيت البروتين ، والحصول على البيانات ، وتحليل البيانات لدراسة تفاعلات مجمعات المستقبلات الفردية المشاركة في تجميع السليلوزوم.

الملخص

السليلوزومات عبارة عن مجمعات متعددة الإنزيمات منفصلة تستخدمها مجموعة فرعية من البكتيريا والفطريات اللاهوائية لهضم ركائز اللجنوسليلوزية. يتم توجيه تجميع الإنزيمات على بروتين السقالة غير التحفيزي من خلال التفاعلات بين عائلة من أزواج المستقبلات والترابط ذات الصلة التي تشتمل على وحدات التماسك وdockerin المتفاعلة. ينتج عن الارتباط القوي للغاية بين وحدات التماسك وعامل السهر ثوابت تفكك في النطاق المنخفض من البيكومولار إلى النانو المولار ، مما قد يعيق القياسات الدقيقة خارج المعدل بالطرق السائبة التقليدية. يقيس التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء (SMFS) باستخدام مجهر القوة الذرية استجابة الجزيئات الحيوية الفردية للقوة ، وعلى عكس طرق التلاعب بالجزيء الفردي الأخرى (أي الملقط البصري) ، فهو الأمثل لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط عالية التقارب بسبب قدرته على استكشاف نظام القوة العالية (>120 pN). نقدم هنا بروتوكولنا الكامل لدراسة تجميعات البروتين السليلوزومي على مستوى الجزيء الواحد. باستخدام طوبولوجيا البروتين المشتقة من السليلوسوم الأصلي ، عملنا مع بروتينات اندماج إنزيم دوكرين ووحدة ربط الكربوهيدرات (CBM-cohesin) ، ولكل منها مجموعة ثيول حرة يمكن الوصول إليها في بقايا السيستين الهندسية. نقدم بروتوكول تثبيت السطح الخاص بالموقع الخاص بنا ، جنبا إلى جنب مع إجراء القياس وتحليل البيانات للحصول على معلمات ربط مفصلة للمركب عالي التقارب. نوضح كيفية تحديد القوى التي تتكشف المجال الفرعي الفردي ، وقوى التمزق المعقدة ، ومعدلات الخروج الحركية ، والعرض المحتمل لبئر الربط. يتم وصف التطبيق الناجح لهذه الأساليب في توصيف تفاعل cohesin-dockerin المسؤول عن تجميع المجمعات السليولولوجية متعددة المجالات.

المقدمة

السليلوزومات عبارة عن مجمعات كبيرة متعددة الإنزيمات معروضة على سطح البكتيريا الحالة السليولية اللاهوائية (مثل C. thermocellum) التي تطورت لإزالة بلمرة ليجنوسليلوز جدار الخلية النباتية بكفاءة إلى السكريات قليلة السكاريد القابلة للذوبان1. السمة المركزية للسليلوزومات هي تفاعل التماسك عالي التقارب بين دوكرين. في النموذج الأبرز ، يتم عرض وحدة dockerin من الأحماض الأمينية 60-75 من النوع الأول المحفوظة للغاية في الطرف C للإنزيمات البكتيرية المختلفة. توجه وحدة dockerin تجميع مجموعات التآزرية من الإنزيمات على بروتين السقالة غير التحفيزي ("السقالة") ، والذي يتكون من بروتين متعدد من مجالات التماسك الخاصة بوحدة dockerin من النوع الأول. في المستويات الأعلى ، يمكن أن تصبح بنية السليلوجوم معقدة للغاية ، حيث تتضمن أزواج بديلة من التماسك وعامل السحر (على سبيل المثال النوع الثاني ، النوع الثالث) التي تثبت الهياكل على سطح الخلية وتسمح بتجميع الهياكل المتفرعة التي تحتوي على سقالات متعددة2. تظهر أنواع التماسك-دوكرين المختلفة ، على الرغم من وجود هياكل ذات صلة ، خصائص ربط تفاضلية تمنع التفاعل المتقاطع مع السقالات غير المقصودة أو المكونات من الأنواع البكتيرية الأخرى المنتجة للسليلوزوم. في حين أن مناهج المعلوماتية الحيوية قد نجحت في تحديد الآلاف من مكونات السليلوزوم الفريدة على المستوى الجيني ، إلا أن القليل من الهياكل البروتينية معروفة نسبيا ، ولا تزال الآليات العاملة في تحديد خصوصية cohesin-dockerin مجالا نشطا لأبحاث البيولوجيا الهيكلية.

< p class = "jove_content">منذ اختراع مجهر القوة الذرية (AFM) بواسطة Binnig et al.3 ، تم تطوير أوضاع تشغيل AFM المختلفة وتحسينها باستمرار ، بما في ذلك التصوير غير الملامسة ، وتصوير وضع التذبذب4 ، والتحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي (SMFS) 5،6. تطورت SMFS إلى تقنية مستخدمة على نطاق واسع للتحقيق المباشر في البروتينات الفردية7-11 والأحماض النووية12-15 والبوليمرات الاصطناعية16-19. في تجربة SMFS نموذجية للتحقيق في ارتباط المستقبلاتوالرابطة 20،21 ، يتم تعديل طرف ناتئ AFM مع أحد شركاء الربط ، بينما يتم تعديل سطح زجاجي مسطح مع شريك الربط التكميلي. يتم ملامسة الكابول المعدل مع السطح مما يسمح للشركاء بالارتباط. ثم يتم سحب قاعدة الكابولي بسرعة ثابتة ويتم قياس القوة باستخدام طريقة انحراف الرافعة البصرية. تظهر آثار بيانات مسافة القوة الناتجة قمم تشبه أسنان المنشار إذا تم إنشاء ربط. في الحالات التي يتم فيها دمج شركاء الارتباط في مجالات بروتينية متعددة ، يمكن ربط كل ذروة في تتبع مسافة القوة بظهور مجال بروتيني واحد أو مجال فرعي مطوي ، بينما تتوافق الذروة الأخيرة مع تمزق واجهة ربط البروتين. يمكن استخدام المواضع المحددة للعناصر المقاومة للقوة كبصمة لتحديد مجالات البروتين المختلفة ذات الأهمية. يمكن استخدام هذه الطريقة لاستجواب الأحماض الأمينية المهمة المشاركة في طي البروتين وتثبيته. تم الإبلاغ عن العديد من النماذج في الأدبيات لمعالجة سلوك تمديد القوة المميز الذي لوحظ في تجارب SMFS. تشمل النماذج الأكثر استخداما نموذج السلسلة الموصلة بحرية (FJC)22 ، والسلسلة الشبيهة بالديدان (WLC) النموذج18،23-25 ، والسلسلة الدوارة بحرية (FRC) نموذج25،26.

في عملنا السابق11 ، استخدمنا التحليل الطيفي لقوة الجزيء المفرد للتحقيق في تفاعل وحدات cohesin و dockerin. هنا ، نقدم بروتوكولا تجريبيا لتشغيل السطح الزجاجي والناتئ باستخدام تركيبات بروتين إنزيم دوكرين وCBM-cohesin. نقدم أيضا بروتوكول SMFS المستند إلى AFM بما في ذلك إجراءات الحصول على البيانات وتحليلها. يمكن بسهولة تعميم البروتوكول الموصوف على الأنظمة الجزيئية الأخرى ، ويجب أن يكون مفيدا بشكل خاص للباحثين المهتمين بأزواج ترابط المستقبلات عالية التقارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يظهر في الشكل 1A مخطط لهندسة السحب المستخدمة في هذا العمل لسبر التفاعل بين الكوهيسين والدوكيرين (cohesin-dockerin). إن بروتوكول تثبيت البروتين المذكور هنا لوظائف العارضة الزجاجية (cantilever) وغطاء الزجاج هو نسخة معدلة من الإجراء المنشور سابقاً27. تم التعبير عن البروتينات من ناقلات بلازميدية في بكتيريا E. coli باستخدام الطرق التقليدية. صُممت البروتينات بمجموعة ثيول قابلة للوصول بالمذيب، والتي استُخدمت بالتزامن مع كيمياء المالييميد لربط البروتين عبر رابطة ثيويثير مستقرة بسطح غطاء الزجاج والعارضة الزجاجية. كانت بقايا السيستين المهندسة في كل من البروتينات الاندماجية CBM-cohesin و xylanase-dockerin موجودة باتجاه الطرف النتروجيني (N-terminal) للبروتينات، بعيداً عن واجهة الارتباط بين الكوهيسين والدوكيرين11. يظهر في الشكل 1B نظرة عامة مفصلة على الترابط الكيميائي المستخدم في تثبيت البروتين.

1. تحضير العينة

  1. المحاليل المنظمة
    1. تحضير محلول ملحي منظم من Tris مدعم بالكالسيوم (TBS): 25 mM TRIS، و75 mM NaCl، و1 mM CaCl2، وبدرجة حموضة pH 7.2
    2. تحضير محلول بورات الصوديوم المنظم: 50 mM Na2B4O7، وبدرجة حموضة pH 8.5
      يظهر مخطط تدفق العملية الذي يوضح خطوات تحضير العينة في الشكل 2.
      يوصى باستخدام ملاقط ذاتية القفل عند التعامل مع العوارض (cantilevers) والشرائح الزجاجية الغطائية (cover glasses).
  2. السيلنة الأمينية للشريحة الزجاجية الغطائية (ساعة ونصف تقريباً)
    1. وضع الشريحة الزجاجية الغطائية (قطر 24 mm، وسماكة 0.5 mm) في حامل PTFE.
    2. معالجة الشريحة الزجاجية الغطائية بالموجات فوق الصوتية في مزيج من الإيثانول والماء فائق النقاء بنسبة 1:1 (حجم/حجم) لمدة 15 min.
    3. شطف الشريحة الزجاجية الغطائية بالماء فائق النقاء.
    4. وضع الشريحة الزجاجية الغطائية في محلول بيرانا (1:1 H2SO4 (مركز) : H2O2 (30%) (حجم/حجم)) لمدة 30 min، ثم شطفها جيداً بالماء فائق النقاء. تجفيف الشريحة الزجاجية الغطائية تحت تيار خفيف من N2. تنبيه: محلول بيرانا مسبب للتآكل بشدة، لذا يلزم استخدام واقيات للعين والجلد.
    5. غمر الشريحة الزجاجية الغطائية في مزيج من الإيثانول والماء فائق النقاء و3-aminopropyl dimethyl ethoxysilane بنسبة 45:5:1 (حجم/حجم). توضع على جهاز هزاز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 60 min (بسرعة 50 rpm تقريباً).
    6. غمر الشريحة الزجاجية الغطائية بالتتابع في الإيثانول والماء فائق النقاء (مرتين لكل منهما). تجفيف الشريحة الزجاجية الغطائية تحت تيار خفيف من N2.
    7. تجفيف الشريحة الزجاجية الغطائية في فرن (80 °C لمدة 30 min).
    8. يمكن تخزين الشرائح الزجاجية الغطائية المسيلنة تحت غاز الأرجون لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
  3. السيلنة الأمينية للعوارض (ساعة ونصف تقريباً)
    ملاحظة: البروتوكول المعروض لوظيفية الرأس مناسب لرؤوس العوارض المصنوعة من السيليكون.
    1. وضع العوارض على شريحة زجاجية نظيفة، ومعالجتها بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية (UV-ozone) لمدة 15 min.
    2. غمر العوارض لمدة 3 min في مزيج من الإيثانول و3-aminopropyl dimethyl ethoxysilane بنسبة 1:1 (حجم/حجم) مع كمية محفزة (0.25% (حجم/حجم)) من الماء فائق النقاء.
    3. شطف العوارض مع تحريك خفيف بالتتابع لمدة 60 sec في دوارق تحتوي على التولوين، والإيثانول، والماء فائق النقاء. تجفيف العوارض بعناية على ورق ترشيح بين عمليات الشطف.
    4. وضع العوارض على شريحة زجاجية نظيفة وتجفيفها في الفرن (80 °C لمدة 30 min).
  4. اختزال ثنائي كبريتيد البروتين (3 ساعات تقريباً)
    يجب تحضير جميع المحاليل للحصول على 30 µl تقريباً من البروتين المخفف لكل عارضة، و20 µl من البروتين المخفف لكل شريحة زجاجية غطائية. يجب خلط محاليل البروتين مع جل اختزال ثنائي الكبريتيد Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) بنسبة 1:2 (حجم/حجم).
    1. تحضير حصص من حبيبات TCEP المختزلة لثنائي الكبريتيد في أنابيب دقيقة. يوصى بقص رؤوس الماصات الدقيقة بالمقص لتوسيع قطر الفتحة عند سحب ملاط حبيبات TCEP.
    2. شطف ملاط حبيبات TCEP باستخدام 1 ml من محلول TBS المنظم، والطرد المركزي بسرعة 850 rcf لمدة 3 min.
    3. إزالة السائل الطافي بعناية والتخلص منه باستخدام ماصة دقيقة.
    4. تكرار الخطوتين 1.4.2-1.4.3 مرتين.
    5. إضافة محلول البروتين المركز (1-10 mg/ml) إلى حبيبات TCEP (بنسبة 1:2 بروتين : ملاط حبيبات TCEP (حجم/حجم)) والخلط بلطف عن طريق التحريك برأس الماصة الدقيقة، مع تجنب إدخال فقاعات الهواء.
    6. وضع خليط ملاط البروتين/حبيبات TCEP على جهاز تدوير (rotator) لمدة 2.5 hr.
  5. البيجلة (PEGylation) للشرائح الزجاجية الغطائية والعوارض (ساعة ونصف تقريباً)
    1. قبل التعديل باستخدام روابط NHS-PEG-maleimide، تنقع العوارض والشرائح الزجاجية الغطائية المسيلنة أمينياً في محلول بورات الصوديوم المنظم (pH 8.5) لمدة 45 min لإزالة البروتونات من مجموعات الأمين الأولية على السطح.
    2. التأكد من تدفئة مسحوق NHS-PEG-maleimide إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل فتح الغطاء ووزن الكمية المناسبة لتحضير محلول بتركيز 25 mM. يجب تخزين NHS-PEG-maleimide غير المستخدم تحت غاز الأرجون عند -20 °C. يلزم توفير 30 µl تقريباً من محلول البوليمر لكل عارضة، و90 µl لكل شريحتين زجاجيتين غطائيتين (موضوعتين فوق بعضهما).
    3. بعد وزن NHS-PEG-maleimide بكتلة 5 kDa، يضاف محلول بورات الصوديوم المنظم ويستخدم جهاز الرج (vortex) للحصول على محلول بتركيز 25 mM.
      ملاحظة: يجب استخدام المحلول بأسرع وقت ممكن نظراً لقصر عمر النصف لـ NHS عند pH 8.5. يجب إتمام عملية الرج ونقل السائل إلى العوارض/الشرائح الغطائية في غضون 1-2 min.
    4. تحضين العوارض في قطرات بحجم 30 µl من محلول NHS-PEG-maleimide في طبق بتري. بالنسبة للشرائح الزجاجية الغطائية، يوضع 90 µl من محلول NHS-PEG-maleimide على شريحة واحدة، ثم توضع شريحة ثانية فوقها لإنشاء "ساندوتش" من الشرائح الغطائية وبينهما محلول NHS-PEG-maleimide.
    5. تحضين العوارض/الشرائح الغطائية مع محلول NHS-PEG-maleimide في جو مشبع بالماء في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 hr.
  6. اقتران البروتين (ساعتان تقريباً)
    هام: تقليل تعريض العوارض والشرائح الزجاجية الغطائية المبيجلة للهواء إلى أدنى حد.
    1. طرد حبيبات TCEP/محاليل البروتين المختزل مركزياً بسرعة 100 rcf لمدة 1 min وجمع السائل الطافي.
    2. تخفيف محلول البروتين باستخدام TBS، بحيث يتراوح تركيز البروتين أثناء الاقتران السطحي بين 0.5-2 mg/ml. تترك محاليل البروتين المختزلة والمخففة جانباً لبضع دقائق أثناء شطف العوارض والشرائح الغطائية.
    3. شطف العوارض والشرائح الغطائية في ثلاثة دوارق متتالية من الماء فائق النقاء.
    4. إزالة السائل المتبقي من الشرائح الغطائية بعناية عن طريق ملامسة الحواف إلى ورق ترشيح تحت تيار خفيف من N2. إزالة السائل المتبقي من العوارض بعناية عن طريق ملامستها لورق ترشيح. إضافة محلول البروتين المخفف فوراً.
    5. تثبيت الشرائح الغطائية في حامل عينات مناسب يتوافق مع جهاز AFM.
    6. تحضين الشرائح الغطائية والعوارض المبيجلة مع محاليل البروتين المخففة المقابلة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1-2 hr.
    7. شطف العوارض في ثلاثة دوارق متتالية باستخدام TBS لإزالة البروتينات غير المرتبطة. يتم شطف الشرائح الغطائية بالماصة 10 مرات على الأقل.
    8. تخزين العوارض والشرائح الغطائية في محلول TBS قبل عملية القياس.

2. الحصول على البيانات

في هذا العمل، تم استخدام مجهر قوة ذرية (AFM)28 مصنع خصيصاً، يتم التحكم فيه بواسطة وحدة تحكم MFP-3D AFM من شركة Asylum Research وباستخدام برنامج Igor Pro مكتوب خصيصاً لهذا الغرض. ويتم قياس انحراف العارضة عبر طريقة انحراف الشعاع الضوئي29. وتعتبر بروتوكولات تحضير العينات وتحليل البيانات المقدمة هنا قابلة للتطبيق بغض النظر عن طراز AFM المستخدم. ومع ذلك، يجب أن يكون طراز AFM مناسباً للقياس في السوائل، وأن يدعم نطاق سرعة متاح على piezo-z يتراوح تقريباً بين 200-5,000 nm/sec.

  1. قم بتثبيت الكابول الوظيفي (functionalized cantilever) والسطح الزجاجي على مجهر القوة الذرية (AFM). يجب أن يظل السطح مغطى بالمحلول المنظم طوال الإجراء. عند تثبيت الكابول، قلل من فترة التعرض للهواء. بعد ضبط شعاع الليزر بشكل صحيح، اترك النظام ليصل إلى حالة التوازن لمدة 30 min على الأقل لتقليل أي تأثيرات للانجراف، وأعد الضبط إذا لزم الأمر.
  2. سجل طيف الضوضاء الحرارية بينما يكون الكابول بعيداً عن السطح، أي في غياب تأثيرات التخميد.
  3. استخدم طريقة قليلة التداخل مثل النهج الصوتي للعثور على السطح دون إتلاف طرف الكابول قبل القياس. إذا كان ذلك ممكناً، اقترب يدوياً من السطح بالكابول واستخدم سماعات الرأس للاستماع إلى الضوضاء الحرارية في مخرج الانحراف الخام من متحكم AFM. بمجرد اقتراب الكابول من السطح، سيُسمع تغير واضح في الصوت.
    ملاحظة: يجب أن يكون طرف الكابول الآن على مسافة 2-5 µm من السطح. تعتمد طبيعة تغير الصوت على الكابول المستخدم. تردد الرنين للكابول المستخدم في هذا العمل هو 25 kHz تقريباً في الماء، وهو أعلى من نطاق السمع البشري. وبسبب تأثيرات التخميد بالقرب من السطح، ينزاح الرنين نحو ترددات أقل، مما يجعل رنين الكابول ضمن النطاق المسموع. وبالتالي، يتم إدراك زيادة ظاهرة في التردد وكثافة الصوت.
    في الحالات التي لا يتوفر فيها مخرج صوتي لإشارة الانحراف، يمكن الاقتراب من السطح باستخدام piezo-z مع تفعيل التغذية الراجعة النشطة على إشارة الانحراف. وبمجرد زيادة إشارة الانحراف بمقدار محدد نتيجة لغرز السطح، يتم إيقاف عملية الاقتراب.
  4. حدد حساسية الرافعة الضوئية العكسية (InvOLS)، والتي تمثل مسافة إزاحة الطرف (بالـ nm) لكل فولت من إشارة الانحراف. يتم ذلك عن طريق غرز السطح بطرف الكابول. يوصى بجهد نقطة ضبط للانحراف يتوافق مع إزاحة طرف الكابول بمقدار 3 nm تقريباً.
  5. حدد ثابت الزنبرك للكابول عن طريق مطابقة دالة استجابة المذبذب التوافقي البسيط مع طيف الضوضاء الحرارية، وفقاً لنظرية تساوي توزيع الطاقة30,31.
  6. ابدأ الروتين التجريبي. في هذا العمل، تم استخدام مجموعة معلمات القياس التالية: سرعة الاقتراب: 3,000 nm/sec؛ قوة الغرز: 180 pN؛ زمن المكوث على السطح: 10 msec؛ سرعات السحب: 0.2، 0.7، 2.0، 5.0 µm/sec مع معدلات أخذ عينات تبلغ 2,000، 5,000، 15,000، 20,000 Hz على التوالي؛ مسافة السحب: 500 nm.
    ملاحظة: يجب ألا يتم ضبط معدل أخذ العينات بأكثر من 10 نقاط/nm لتجنب الإفراط في أخذ العينات وللحفاظ على أحجام بيانات معقولة.
  7. بعد كل تتبع للقوة والمسافة، قم بتفعيل مراحل piezo-x و piezo-y لتعريض موقع سطح جديد للكابول في كل منحنى قوة-مسافة. تقوم هذه التقنية بفحص مساحة أكبر من سطح الزجاج الغطائي خلال القياسات طويلة المدى.
  8. استخدم إعادة التصفير الدورية لمرحلة الانحراف (أي موضع الثنائي الضوئي) وارتفاع هيكل piezo-z خلال القياسات طويلة المدى في حال انجراف إشارة الانحراف خارج النطاق، أو فقدان الاتصال بالسطح.
  9. عند الانتهاء من عملية القياس، أجرِ قياس InvOLS آخر بقوة غرز أعلى بكثير من تلك المستخدمة قبل القياسات للحصول على قيمة InvOLS أكثر دقة.
  10. سجل طيف ضوضاء حرارية آخر بعيداً عن السطح. حدد ثابت الزنبرك في نهاية التشغيل التجريبي.

3. تحليل البيانات

يوضح المخطط الانسيابي في الشكل 3 عملية تحليل البيانات. قم بإجراء جميع عمليات معالجة البيانات باستخدام حزمة برمجيات مناسبة مثل Igor Pro أو MATLAB. أولاً، قم بتحويل الإشارة الخام من الكاشف إلى وحدات القوة، وصحح قيم الإزاحة والانجراف. بعد ذلك، استخدم نماذج مرونة البوليمرات الحيوية لتحديد حواجز الطاقة في مسارات فك الطي، وتحديد النطاقات الفرعية للبروتين. وأخيراً، يتم الحصول على المعاملات الحركية والطاقية للتفاعل بين المستقبل والرابط.

  1. تحويل الوحدات وتصحيحات البيانات
    1. اضرب إشارة الانحراف الخام (بالفولت) في قيمة InvOLS (nm/volt) وثابت النابض (pN/nm) لتحويل جهد الكاشف إلى وحدات القوة.
    2. قم بإزاحة البيانات بحيث تكون قيمة القوة للكانتليفر غير المُحمل صفر pN، وذلك عن طريق حساب متوسط قيم القوة من آخر 10% من منحنى القوة-المسافة (الذي تم الحصول عليه في أبعد نقطة عن السطح)، ثم طرح هذا المتوسط من جميع قيم القوة في منحنى البيانات.
    3. قم بإزاحة كل منحنى في اتجاه x بحيث يكون أول تقاطع مع محور المسافة عند مسافة 0 nm.
    4. تعتمد قيمة InvOLS على موضع بقعة الليزر على الكانتليفر. وحتى الكميات الضئيلة من الانزياح في نظام القراءة الضوئية قد تسبب تغيرات ملحوظة في InvOLS عندما تكون بصمة الكانتليفر قابلة للمقارنة مع حجم بقعة الليزر. يتم تصحيح ذلك من خلال تحليل الضوضاء في إشارة الانحراف عند قوة صفر. وبافتراض ثبات الظروف المحيطة، تتناسب الضوضاء في إشارة الانحراف تناسباً طردياً مع InvOLS.
      1. قس قيمة جذر متوسط المربعات (RMS) للانحراف (مستوى الضوضاء عند قوة صفر) لآخر 10% من كل منحنى قوة-مسافة.
      2. ارسم الضوضاء مقابل رقم المنحنى وقم بتطبيق مطابقة مناسبة. عادةً ما تكون المطابقة الأسية في شكل صيغة الاضمحلال الأسي، N(n_i)=N_0 * e^(-kn_i)، تمثيل رياضي. هي الأكثر فعالية، حيث تمثل N الضوضاء، و ni رقم المنحنى، بينما N0 و k هما معاملا المطابقة. وقد تكون المطابقة الخطية مناسبة أيضاً لبعض مجموعات البيانات.
      3. حدد عامل القياس (SF) لكل منحنى:

        المعادلة 1:
        معادلة التوازن الساكن؛ (SF)=(N₀e^(-knᵢ)+C)/(N₀e^(-knₓ)+C)؛ صيغة رياضية
        حيث ni هو رقم المنحنى، و nf هو رقم المنحنى النهائي، و C هو مقدار الإزاحة.
      4. بعد ذلك، اقسم جميع قيم القوة في كل منحنى فردي على عامل القياس. تقوم هذه العملية بتغيير مقياس كل منحنى وفقاً لنسبة قيمة ضوضاء RMS للمنحنى الحالي إلى قيمة ضوضاء RMS للمنحنى النهائي الذي تم الحصول عليه مباشرة قبل قياس InvOLS.
      5. أجرِ تصحيحاً للانحراف لتحويل محور المسافة (z) إلى التمدد الجزيئي (z*). وهذا يعوض عن انحناء الكانتليفر تحت تأثير القوة، مما يقلل المسافة بين طرف الكانتليفر والعينة عن القيمة التي يبلغها موضع مستشعر z-piezo.

        المعادلة 2:
        معادلة التوازن الساكن، z* = z - F/k، صيغة؛ حسابات فيزيائية، تحليل القوة
        حيث z هو موضع مستشعر z المقاس، و F هي القوة المؤثرة على الكانتليفر، و k هو ثابت النابض.
  2. تحليل طول الكنتور
    طول الكنتور للبروتين هو أقصى طول ممتد لسلسلة الببتيد. تشير حالة طي البروتين إلى هندسته والمسافة من الطرف إلى الطرف التي تحددها البنية الثانوية والثالثية. يرتبط طول كنتور البروتين ارتباطاً مباشراً بحالة طيه9,25,32. تختلف مواضع تمزقات محددة في منحنيات القوة-التمدد بشكل كبير بسبب تعدد تشتت روابط PEG، بالإضافة إلى المعاملات الخارجية مثل درجة الحرارة وخصائص المنظم ومعدلات التحميل. وهذا يعقد التحليل المباشر للبيانات، ولكن يمكن التغلب على ذلك عن طريق تحويل بيانات القوة-التمدد إلى حيز طول الكنتور. تتيح هذه التقنية إجراء المتوسطات على مجموعات بيانات ضخمة، وتسمح باستخدام التعرف التلقائي على الأنماط لتحديد أحداث فك الطي المميزة. وبالتالي، يمكن فرز منحنيات القوة الفردية بناءً على نوع التفاعل الملحوظ. يتم استخدام الإجراء الموصوف سابقاً25 لتحويل بيانات القوة-التمدد إلى حيز طول الكنتور.
    1. يؤدي حل نموذج WLC (المعادلة 3)23 لطول الكنتور L عند طول استمرار ثابت p إلى المعادلة 4، والتي توفر طول الكنتور L(x,u). هنا، x هي المسافة و u=F*p/kBT، حيث kB هو ثابت بولتزمان و T هي درجة الحرارة. يتم أخذ الحلول الحقيقية فقط في الاعتبار. والقيود الإضافية هي x، F>0, L>0, x>0؛

      المعادلة 3:
      صيغة القوة-التمدد، F(x,L)، معادلة فيزياء البوليمرات، توضح المرونة الإنتروبية.

      المعادلة 4:
      التوازن الساكن، L(x,u)، صيغة معقدة، مخطط تعليمي، تفسير التعبير التحليلي.
      حيث،
      معادلة الدالة متعددة الحدود \( g(u) \)، تحليل رياضي، حساب رمزي.
    2. ارسم نقاط البيانات المحولة في مخطط للقوة مقابل طول الكنتور. طبق عتبة قوة تبلغ 10 pN تقريباً لاستبعاد الضوضاء. يمكن استبعاد التفاعلات غير النوعية عن طريق تطبيق مرشح طول التمرير العالي. قم بتجميع مدرج تكراري لأطوال الكنتور.
    3. أجرِ ارتباطاً متبادلاً33 للمدرجات التكرارية التي تم الحصول عليها مع مدرج تكراري نموذجي، وقم بالإزاحة على طول محور x لتصحيح تعدد تشتت PEG. استخدم قيم الارتباط الناتجة لقياس التشابه بين منحنيات البيانات الفردية. وبذلك، يمكن فرز منحنيات البيانات إلى فئات محددة مسبقاً لتبسيط التحليل اللاحق.
    4. استخدم تقنية مماثلة للعثور على الميزات المتكررة في منحنى واحد عن طريق الارتباط الذاتي، على سبيل المثال، في حالة فك طي نطاقات Ig المتعددة.
    5. افرز المنحنيات يدوياً لاستقصاء أحداث فك طي أخرى.
  3. تحليل معدل التحميل
    استخلص المعلومات الحركية والطاقية حول تفكك المستقبل-الرابط عن طريق تطبيق نماذج مناسبة على طيف القوة، أي مخطط قوة التمزق مقابل ln(معدل التحميل).
    1. لسرعة سحب معينة، حدد قوة التمزق ومعدل التحميل لأحداث التمزق المستهدفة:
      1. أجرِ مطابقة خطية لمنحنى القوة-الزمن في جوار حدث التمزق المستهدف. حدد معدل التحميل من ميل الخط المطابق للقمة. كرر هذا الإجراء لكل منحنى يظهر حدث التمزق المستهدف.
      2. حدد قوة التمزق الأكثر احتمالاً عن طريق تطبيق مطابقة غاوسية على مدرج تكراري لقوى التمزق. يمكن استخدام دوال مطابقة بديلة.
      3. حدد معدل التحميل الأكثر احتمالاً.
    2. كرر الخطوات 3.3.3.1 - 3.3.3.3 لجميع سرعات السحب.
    3. ارسم قوى التمزق الأكثر احتمالاً مقابل اللوغاريتم الطبيعي لمعدلات التحميل الأكثر احتمالاً للحصول على طيف القوة.
    4. طبق نموذجاً نظرياً مناسباً على طيف القوة لاستخلاص المعاملات الحركية والطاقية (الشكل 4C). في كثير من الحالات، يمكن استخدام نموذج Bell-Evans الخطي20,34 والذي سيعطي تقديرات جيدة لـ koff، وهو معدل التفكك في غياب القوة، و Dx، وهي المسافة إلى الحالة الانتقالية على طول إحداثي التفاعل، كما هو موضح في المعادلة 5.

      المعادلة 5:
      معادلة القوة الساكنة ⟨F⟩، k_B T/Δx، تحليل الصيغة لتجارب التقلبات الحرارية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمنا الإجراء الموصوف لاستقصاء زوج كوهيسين-دوكرين (cohesin-dockerin) من النوع الأول من بكتيريا C. thermocellum. وعند حدوث الارتباط الناجح لزوج الكوهيسين-دوكرين، أظهرت آثار مسافة القوة المسجلة أنماط قمم مميزة. ويظهر أثر نموذجي في الشكل 4a. تمثل كل قمة في الأثر عملية فتح نطاق فرعي واحد من البروتين، بينما تقابل القمة الأخيرة تفكك معقد المستقبل-الرابط.

بالنسبة لمعقد CBM-cohesin-dockerin-xylanase الذي تم استقصاؤه في هذا العمل، فإن الارتفاع الأولي في القوة يتوافق مع تمدد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

للحصول على بيانات ذات مغزى من تجارب التحليل الطيفي لقوة الجزيء الفردي ، من الضروري تحقيق هندسة سحب محددة جيدا وقابلة للتكرار. ينتج عن البروتوكول المستخدم هنا تجميد مجمعات البروتين الخاصة بالموقع في هندسة سحب محددة.

تم اختيار الكابوليات المستخدمة في هذه الدراسة بسبب حساسيتها للقوة وتردد الرنين العالي في الماء. علاوة على ذلك ، فإن انحناء الطرف الصغير البالغ حوالي 10 نانومتر مفيد لتجارب جزيء واحد بسبب انخفاض احتمالية التفاعلات المتعددة. ومع ذلك ، فإن البصمة الصغيرة (38 × 16 ميكرومتر2) ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالتمويل من منحة متقدمة من مجلس البحوث الأوروبي إلى Hermann Gaub. يقر مايكل أ. ناش بامتنان بالتمويل المقدم من المجتمع في العلوم - برنامج زمالة برانكو فايس. يشكر المؤلفون إدوارد أ. باير ويوآف باراك ودانيال ب. فرايد في معهد وايزمان للعلوم على توفير البروتينات المستخدمة في هذه الدراسة بسخاء. يشكر المؤلفون هيرمان إي جوب وإلياس إم بوشنر وستيفان دبليو ستال على المناقشات المفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-أمينوبروبيل ثنائي ميثيل إيثوكسيسيلانABCR GmbHAB110423
5 كيلو دالتون NHS-PEG-maleimideRapp Polymer13 5000-65-35
TCEP جل اختزال ثاني كبريتيدThermo Scientific ، بيرس77712www.thermoscientific.com/pierce< / a>
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان
BioLever ناتئ نيتريد السيليكونالصغير أوليمبوسBL-AC40TS-C2دفعات ناعمة
XYZ مشغلات كهرضغطيةPhysik Instrumente GmbH
الأشعة تحت الحمراء " طيف واسع" ليزر الأشعة تحت الحمراءSuperlum
MFP-3D AFM ControllerAsylum Research
Igor Pro 6.31Wavemetricsالحصول على البيانات وتحليلها
كلوريد
كلوريد
الكالسيوم مقياس الأس الهيدروجيني
بورات
ملاقط
غطاء نظاراتThermo Scientific ، Menzel-Gl & auml ؛ قطر ser24 مم ، سمك 0.5 مم
حامل عينةمصنوع حسب الطلب
حمام
نقاء تحليليللإيثانول
حمض الكبريتيك (مركز)النقاء التحليلي
بيروكسيد الهيدروجين (30٪)نقاء تحليلي
شاكر مداري
التولوينالنقاء التحليلي
ورق
شرائح زجاجية الأنابيب
الدقيقة الماصات
الطردالمركزي مناسبة للأنابيب الدقيقة
الدوار
أطباق
أكواب
مجهر
الصوديوم الصوديوم PTFE Sonicatorترشيح الدقيقة أجهزة بتري بصري

المراجع

  1. Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).
  2. Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. From Cellulosomes to Cellulosomics. Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).
  3. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  4. Garcı́a, R., Perez, R. Dynamic atomic force microscopy methods. Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).
  5. Engel, A., Müller, D. J. Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope. Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).
  6. Li, H., Cao, Y. Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials. Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).
  7. Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  8. Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).
  9. Puchner, E. M., Gaub, H. E. Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).
  12. Boland, T., Ratner, B. D. Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).
  13. Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. B-S Transition in Short Oligonucleotides. Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).
  14. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).
  15. Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. Cytosine methylation alters DNA mechanical properties. Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).
  16. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  17. Giannotti, M. I., Vancso, G. J. Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy. Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).
  18. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).
  19. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold. ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  20. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).
  21. Morfill, J., Neumann, J., et al. Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide. Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).
  22. Ortiz, C., Hadziioannou, G. Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy. Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).
  23. Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. Entropic Elasticity of l-phage DNA. Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).
  24. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).
  25. Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern. Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).
  26. Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers. Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).
  27. Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments. Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).
  28. Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope. Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).
  29. Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture. J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).
  30. Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants. Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).
  31. Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration. Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).
  32. Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds. Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).
  33. Dietz, H., Rief, M. Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition. Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).
  34. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  35. Dietz, H., Rief, M. Protein structure by mechanical triangulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).
  36. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments. Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).
  37. Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التحقيق في أنظمة مستقبلات الترابط في السليلوسوم باستخدام التحليل الطيفي لقوة الجزيء الواحد القائم على AFM
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.