مقالة منهجية

نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة لكشف آليات الحساسية في مرض باركنسون

7.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50960

⸱

يناير 7, 2014

 ,  ,  , 
1Center for Health Sciences, SRI International, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California-Santa Cruz

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن تولد يسوزيميس ليبوكسيجيناز (LOX) المنتجات التي قد تزيد أو تقلل من الاشتعال العصبي والتوليد العصبي. ويمكن لدراسة التفاعل بين الجينات والبيئة تحديد الآثار المحددة ل LOX isozyme. باستخدام نموذج 1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP) من تلف النيغروستريتال في اثنين من خطوط تحويل وراثيا نقص LOX isozyme يسمح للمقارنة بين مساهمة زوزيمي LOX على سلامة الدوبامين والالتهاب.

الملخص

وقد تورط نشاط ليبوكسيجيناز (LOX) في الاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر، ولكن آثاره في مرض باركنسون (PD) المسببة للأمراض هي أقل فهما. نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة لها فائدة في كشف تأثير مسارات خلوية محددة في السمية التي قد لا يمكن ملاحظتها باستخدام نموذج مرض وراثي أو سام فقط وحده. لتقييم ما إذا كان LOX isozymes متميزة تسهم بشكل انتقائي في التنكس العصبي PD ذات الصلة، يمكن الطعن في الفئران المعدلة وراثيا(أي 5-LOX و 12/15-LOX ناقص) مع السم الذي يحاكي إصابة الخلية والموت في الاضطراب. هنا نصف استخدام السم العصبي، 1-ميثيل-4-فينيل-1،2،3،6-رباعي هيدرودريدين (MPTP)، الذي ينتج آفة نيجروستريتال لتوضيح المساهمات المتميزة من إيزوزيميس LOX إلى التنكس العصبي المتعلقة PD. استخدام MPTP في الماوس، والرئيسيات غير البشرية، راسخة لتلخيص الضرر nigrostriatal في PD. يتم قياس مدى الآفات الناجمة عن MPTP من خلال تحليل HPLC للدوبامين ونواتج الأيض وتحليله شبه الكمي لللطخة الغربية لم المخطط لهيدروكسيلاز التيروزين (TH) ، وهو الإنزيم المقيد لمعدل تخليق الدوبامين. لتقييم العلامات الالتهابية ، والتي قد تظهر حساسية LOX انتقائية ، يتم إجراء البروتين الحمضي الرجفان الدبقية (GFAP) والكيمياء المناعية Iba-1 على أقسام الدماغ التي تحتوي على نيغرا substantia ، ويتم إجراء تحليل لطخة GFAP الغربية على متجانسات سترياتال. يمكن أن يوفر هذا النهج التجريبي رؤى جديدة في التفاعلات بين الجينات والبيئة الكامنة وراء الانحطاط النيغروستريتال وPD.

المقدمة

استخدام نماذج التفاعل بين الجينات والبيئة يوفر نهجا لمحاكاة عوامل الخطر التي من المرجح أن تؤثر على مرض باركنسون مجهول السبب (PD) ويتيح فرصة لتمييز الرؤى الميكانيكية التي من غير المرجح أن يتم توضيحها باستخدام نظام وراثي أو سام وحده1,2. هنا نوضح هذه النقطة ونصف تطبيق نموذج الماوس 1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-رباعي هيدروبيريدين (MPTP) من الضمور النيغروستريتال3 لفهم انتقائية سمية ليبوكسيجيناز (LOX) نشاط الإيزيمي على الاشتعال العصبي والسمية4. في حين تم تقييم دور لLOX isozymes على نطاق واسع في الاضطرابات الطرفية5,6 وكذلك مرض CNS بما في ذلك السكتة الدماغية7 ومرض الزهايمر8,9, دور عائلة الايزوزيم في وظيفة nigrostriatal والانحطاط المتعلقة PD ليست مفهومة جيدا والدراسة يبرر. وMPTP neurotoxin يدل على انحطاط تفضيلي للمسار nigrostriatal ويتلخص في استنفاد الدوبامين سترياتال وفقدان الخلايا الدوبامين النيجرال التي تكمن وراء الإعاقات الحركية في المرضى PD10. في حين أن هذا النموذج لا يستنسخ الكادر الكامل من السلوكيات PD غير الحركية والحركية وصريح α-synuclein إيجابية علم الأمراض الجسم ليوي, فقد كان من المفيد لتوضيح الأهداف الميكانيكية الرواية التي تسهم في الضرر nigrostriatal والاختبار في مرحلة مبكرة الترجمية كما هو أفضل نموذج غير الباضعة المميزة المتاحة لإنتاج موثوق بها وفاة الخلايا النيجرال يرافقه فقدان الدوبامين ستريانال11-15. الاستخدام الواسع للفأرة MPTP، مع نماذج تتراوح بين الحادة، تحت الحادة إلىالمزمنة 16-18،وقد سمح لتوحيد الجرعات أن يؤدي إلى أضرار خفيفة إلى شديدة nigrostriatal19،20 مع تفعيل آليات مختلفة من السمية اعتمادا على نظام العلاج18،21،22. وبالتالي، فإن هذا يسمح "نافذة من الآفات" أن تكون مستهدفة التي قد تؤدي إلى تعزيز أو تقليل إصابة النيغروستريتال اعتمادا على العامل العلاجي أو نموذج المعدلة وراثيا المستخدمة23-25.

ومن الضروري أيضا لإجراء دراسات بيولوجية تحويلية واكتشافية التقنيات المستخدمة لتقييم الضرر والأدلة التي توفرها هذه الأساليب. لنموذج الماوس MPTP, المقاييس المقررة لتقييم الآفات هي قياس علامات لهجة الدوبامين سترياتال, بما في ذلك الدوبامين والأيض من قبل HPLC, وتحليل بقعة الغربية من هيدروكسيلاز التيروزين (TH), إنزيم الحد من معدل في تخليق الدوبامين, ومؤشرات الأحداث التنكسية مثل التنشيط الدبقية باستخدام تحليل لطخة الغربية والكيمياء المناعية4. على الرغم من أن هذه هي الكلاسيكية الكيميائية العصبية، والبيوكيميائية، والإجراءات النسيجية، والتقنيات توفير قراءات حاسمة وقابلة للاستنساخ على مدى الضرر داخل المسار الدوبامين nigrostriatal، تشير إلى آليات السمية، وثبت أن أدوات قيمة في فهم الأحداث التنكسية في PD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يجب أن تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وطرق العناية بالحيوان من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). أجريت الدراسة الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها IACUC التابعة ل SRI International.

1. اقتناء وصيانة الفئران LOX ناقص

  1. شراء 5-LOX-ناقصة أو 12/15-LOX-نقص الفئران وسلالة كل منها والضوابط المتطابقة مع الجنس في سن 7-8 أسابيع والسماح لعدة أيام للتأقلم مع منشأة بعد الوصول.
  2. الحفاظ على الفئران في المساكن الجماعية على دورة 12 ساعة ضوء الظلام وإعطاء الغذاء ومياه الشرب الإعلانية libitum.

2. احتياطات MPTP، التخزين، التحضير، إزالة التلوث والتخلص

ملاحظة: وقد ثبت التسمم MPTP من التعرض عن طريق الوريد في البشر أن يسبب باركنسون10; MPTP هو ليبوفيلي للغاية ويمكن بسهولة عبور حاجز الدم في الدماغ26. وينبغي اتخاذ تدابير احترازية لضمان المناولة المأمونة وإزالة السموم والتخلص منها. التمثيل الغذائي ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك التحويل إلى 1-ميثيل-4-فينيل-2,3-dihydropyridinium بواسطة إنزيم مونوامين أوكسيداز B (MAO-B)27. يمكن استخدام مثبطات MAO-B في حالة التسمم البشري العرضي.

  1. التأكد من أن الموظفين لديهم التدريب المناسب على السلامة والتعامل قبل استخدام MPTP كما تمليه لجنة الصحة والسلامة في المؤسسة. يجوز لكل مؤسسة وضع وتنفيذ إجراءات التشغيل القياسية الخاصة بها لاستخدام MPTP ، استنادا إلى توصيات محددة بشكل شامل في الأدبيات17،22.
  2. قبل التحضير، دون معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك ما يلي: معطف المختبر المتاح أو بدلة الجسم الكامل، قفازات النتريل المزدوجة، قناع الجراحية، غطاء الشعر، نظارات السلامة، ويغطي الأحذية المتاح. وينبغي ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء إعداد MPTP، ونموذج الحقن و 72 ساعة بعد الحقن عند التعامل مع الحيوانات و / أو الفراش.
  3. إجراء العمليات الحسابية قبل التحضير. وينبغي اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية لكميات الزواية؛ وعادة ما يستخدم تسليم 100-150 ميكرولتر للفئران 25-30 غرام.
    1. لإعداد محلول MPTP 3 ملغ /مل في المالحة، وتطبيق عامل تصحيح (1.211 MPTP-HCl: 1.0 MPTP قاعدة حرة)؛ تركيز MPTP-HCl في السيارة المالحة هو 3.633 ملغ / مل.
    2. إعداد جميع المعدات والإمدادات والكواشف اللازمة لإعداد MPTP وإزالة التلوث التسرب المحتملة قبل التعامل مع السم العصبي.
  4. إزالة قارورة مصدر MPTP-HCl من موقع التخزين المناسب.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ MPTP في RT في قارورة مغلقة داخل حاوية ثانوية وتخزينها داخل خزانة مؤمنة، المسمى "MPTP".
    1. تغطية المنطقة المحيطة المقاييس مع منصات أو مناشف ورقية مبللة مع محلول التبييض 10٪ للحد من خطر من مسحوق مسكوب. احتفظ بالأنسجة ومحلول التبييض بنسبة 10٪ في مكان قريب كإجراء وقائي.
    2. باستخدام توازن تحليلي يقع في غطاء الدخان، تزن 50 ملغ من MPTP-HCl في قارورة زجاجية مع احتواء الثانوية التي تحتوي على 10٪ الأنسجة غارقة في التبييض. تسمية قارورة الزجاج "MPTP" مع التركيز والتاريخ.
    3. قارورة مصدر وثيق ومسح الخارج مع التبييض 10٪.
  5. أضف ببطء 13.763 مل من المالحة المعقمة إلى القارورة واغلق تماما للخلط. (الحل هو 3.633mg/ml MPTP-HCl.)
    1. في غطاء محرك السيارة، قم بتعقيم محلول MPTP بعناية عن طريق الترشيح باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر في قارورة حقن تحمل علامة داخل حاوية ثانوية مع أنسجة غارقة في التبييض بنسبة 10٪. تنظيف أي تسرب مع الأنسجة المنقوعة التبييض.
    2. التخلص بعناية من حادة وقارورة في حاوية الخطر البيولوجي المسمى بشكل مناسب. الحفاظ على حل MPTP في قارورة في الحاوية الثانوية مع الأنسجة المنقوعة بالتبييض لنقلها إلى غرفة إجراء الحيوانات.
      ملاحظة: لا حل MPTP الأوتوكلاف للتعقيم كما تبخيره هو خطر استنشاق.
  6. عودة قارورة مصدر MPTP إلى الحاوية الثانوية ومكان في موقع التخزين. إزالة التلوث ملعقة، مقياس تحليلي وسطح غطاء محرك السيارة لمدة 10 دقيقة باستخدام التبييض 10٪.

3. إدارة MPTP

  1. إعداد أقفاص المتاح مع الأغطية المثقبة microisolator القياسية التي تحتوي على بطانات البوليستر المصفاة ملحوظ "MPTP" (ناقص شواء الغذاء الأسلاك)، بطانات قفص المتاح، حبيبات الطعام قبل الرطب وهيدرجيل كمصدر للمياه. وزن جميع الحيوانات وحجم قياسي من 3 ملغ / مل MPTP في المالحة المطلوبة لحقن 15 ملغ / كغ.
    ملاحظة: الأيض MPTP يمكن الكشف عنها في إفرازات لمدة 3 أيام بعد الحقن28,29; ومع ذلك ، تفرز الفئران MPTP n-oxide ، وهي مشتقة غير سامة لا تعبر الأغشية بسبب الزهريةالمائية 30.
    1. ارتداء جميع معدات الوقاية الشخصية المذكورة أعلاه وعقد الفئران على لوحة امتصاص المتاح، وحقن السيارة المالحة أو محلول MPTP لجرعة 15 ملغم / كغ في تجويف داخل الصفاق (أي p.)، يوميا لمدة 4 أيام مع حقنة أنبوبية قياس 26 المتاح.
    2. لا خلاصة حقنة بعد الاستخدام; التخلص في حاوية مخصصة ومسمي MPTP حادة المخاطر البيولوجية. الحفاظ على 10٪ التبييض والأنسجة القريبة لتنظيف أي بالتنقيط عرضي.
  2. وضع الحيوانات حقنها مع MPTP في أقفاص المتاح، ما يصل إلى 5 الفئران في القفص الواحد، ومنزل على رفوف مفتوحة. لا تستخدم الرفوف التهوية.
    1. وضع MPTP استخدام لافتات على الرف الذي يحتوي على الفئران وباب غرفة السكن حتى 72 ساعة بعد الحقن الماضي.
      ملاحظة: تأكد من أن درجة حرارة غرفة السكن تتراوح بين 22.2 - 24.4درجة مئوية، حيث تعاني الفئران من انخفاض حرارة عابر يصل إلى 12h بعد تسمم MPTP. 31
    2. إزالة التلوث سطح العمل مع التبييض بعد كل استخدام (انظر الخطوة 2.8)، والتخلص من بقايا MPTP الحل بإضافة حجم يعادل 10٪ التبييض، وتجاهل محتويات والنفايات السائلة الخطرة بيولوجيا.
    3. تجاهل جميع معدات الوقاية الشخصية المستخدمة في سلة التخلص المخصصة. إذا لزم الأمر، رش مع تبييض 10٪ قبل التخلص منها.
  3. تحقق من الحيوانات بانتظام وتحديث الغذاء والماء مصدر يوميا خلال نموذج الحقن و 72 ساعة بعد الحقن الماضي. ملاحظة: على الرغم من أنه لا يتوقع حدوث تلوث في المنطقة المحيطة مباشرة خارج القفص، فإن هذه المنطقة تعامل بمحلول التبييض كإجراء وقائي (كما هو موضح في الخطوة 2-8). يجب توخي الحذر عند التعامل مع جميع الفئران والمعدات خلال هذه الفترة.
    1. بعد ثلاثة أيام من الحقن الأخير، تخلص من جميع الأقفاص والبطانات في كيس المخاطر البيولوجية المسمى بشكل مناسب. استئناف استخدام معدات الوقاية الشخصية العادية والسكن العادي للحيوانات؛ إزالة لافتات الباب والجرف.

4. حصاد الأنسجة

  1. قتل الحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم 7 أيام بعد الحقن MPTP الماضي. تشريح الدماغ على الفور على الجليد باستخدام قالب الدماغ المبردة مسبقا مع فتحات 1 ملم في الطائرة التاجية.
  2. تشريح المخطط من شريحة الدماغ الأمامي 2 مم سميكة على مستوى المفوض الأمامي.
    1. إزالة المناطق القشرية وشبه القشرية المحيطة باستخدام مشرط. أنسجة سترياتال تجميد المفاجئة من كل نصف الكرة الأرضية في أنبوب طرد دقيق منفصل 1.5 مل للتحليل الكيميائي العصبي أو الكيميائي الحيوي.
  3. كتلة ميدبراين / hindbrain في الطائرة التاجية على مستوى تحت المهاد الأمامي والأنسجة الغمر الإصلاح في محلول مائي 4٪ الفورمالديهايد.

5. معالجة الأنسجة

  1. عملية الكيمياء الحيوية
    1. تجانس الأنسجة المخططة من نصف الكرة الأرضية واحد باستخدام جهاز تعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية في 200-μL تريس-EDTA تحلل العازلة (25mM تريس قاعدة، 1mM EDTA، 1:100 بروتياز والكوكتيلات المثبطة فوسفاتاز) ل10 نبضات في 10-12 هرتز والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 4سC في 1000xg.
    2. يستنشق بعناية supernatant، وإعادة تشكيل بيليه في العازلة تحلل 150 ميكرولتر. وتستخدم كسور للتحليل الكيميائي الحيوي من قبل SDS-PAGE والنشاف الغربية.
      ملاحظة: استخدام بروتياز وفوسفاتاز العازلة التي تحتوي على مثبطات في غضون 1 ساعة من التحضير بسبب عدم الاستقرار في المحاليل المائية.
  2. عملية الكيمياء العصبية
    1. استخدم المخطط الذي تم تشريحه من نصف الكرة الأرضية الآخر من كل عينة مخزنة عند -80 درجة مئوية ل HPLC. تذوب الأنسجة سترياتال في أنابيب الميكروفون على الجليد، إضافة 500-ميكرولتر 0.3N حمض بيركلوريك (PCA) وتجانس باستخدام sonicator.
      ملاحظة: لجعل 100 مل من PCA 0.3N, قياس 90 مل ddH2O, إضافة إلى اسطوانة تخرج 100 مل, إضافة 2.58 مل من 70٪ PCA, وجلب إلى علامة 100 مل. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت العينة في 4°C لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. سونيكاتي الأنسجة سترياتال في 500-ميكرولتر الجليد الباردة 0.3N PCA، ل10 نبضات في 10-12 هرتز ومكان على الجليد. لضمان التجانس، عينات سونيكاتي للمرة الثانية لمدة 10 ثانية، ثم الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة في 4سC في 16100xg.
    3. على الفور decant supernatant إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية. الهواء الجافة كسر بيليه في غطاء محرك السيارة.
    4. الحفاظ على supernatant في -80 درجة مئوية حتى استخدامها لقياس الدوبامين والأيض، 3،4-حمض ديهيدروكيفينيليستيك (DOPAC) وحمض الهوموفانيليك (HVA) من قبل HPLC مع الكشف عن الكهروكيميائية.
    5. مرة واحدة جافة، وإعادة تشكيل كسر بيليه في 0.5N NaOH (500 ميكرولتر)، وs sonicate لفترة وجيزة. تخزين إعادة تشكيلها بيليه كسر في 4°C حتى استخدامها لتحديد البروتين الكلي باستخدام طريقة لوري.
  3. عملية الكيمياء المناعية
    1. الغمر إصلاح كتل منتصف وهندستها الدماغ بين عشية وضحاها في محلول مائي 4٪ الفورمالديهايد و cryoprotect في حلول السكروز متدرج (10٪ في المالحة الفوسفات العازلة (0.01 M PBS; 0.138 م NaCl، 0.0027 M KCl، وddH2O، درجة الحموضة 7.4) لمدة 24 ساعة، ثم 30٪ في PBS حتى تغرق الأنسجة) عند 4 درجة مئوية. لطخة لفترة وجيزة كتل cryoprotected لإزالة محلول السكروز الزائدة، وتجميد على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. تقسيم ميكروتوم من كتل الدماغ التي تحتوي على منتصف وعقل متأخر في cryostat.
      1. إزالة الأنسجة من -80 درجة مئوية، والاعتدال في -16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في cryostat، وجبل في وسائل الإعلام تضمين الأنسجة.
      2. جمع المقاطع التاجية في سمك 40 ميكرومتر في محلول بروتين التبريد (0.01M PBS مع 30٪ السكروز، 30٪ جلايكول الإيثيلين، درجة الحموضة 7.4) في -16 درجة مئوية. جمع الأنسجة بشكل متسلسل في 6 أنابيب 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الدقيق على فترات 240 أم وتخزينها في -20 درجة مئوية.

6. الانتفاخ المناعي

  1. تحديد تركيز البروتين في كسر النتوءات الفائقة (أعدت على النحو المبين في القسم 5.1) من قبل المقايسة BCA.
  2. حساب التخفيف المطلوب لكل عينة لتسفر عن 10 ميكروغرام لكل بئر تسليمها في 20 ميكرولتر من الحجم.
  3. تمييع البروتين الفائق مع 4X Laemmli العازلة وخالص التجانس لتسفر عن 10 ميكروغرام البروتين في محلول 1X Laemmli العازلة. حساب المثال:
    1. تحديد التركيز النهائي للبروتين والحجم المطلوب. في هذه الحالة، مطلوب 10 ميكروغرام في 20 ميكرولتر (0.5 ملغم/مل).
    2. تحديد الحجم النهائي للمحلول البروتين اللازمة. على الرغم من أن 20 ميكرولتر مطلوبة للتحميل، يجب إعداد حجم إضافي (30 ميكرولتر).
    3. منذ الحجم النهائي والتركيز معروفة، وتركيز البروتين الكسر الفائق هو معروف (يحددها المقايسة BCA)، وحساب حجم البروتين الفائق المطلوب باستخدام المعادلة:
      Vsupernatant = (Vالنهائي × جيمالنهائي)/C فائقة
      وهكذا، لتركيز البروتين فائقة من 1.5 ملغ / مل،
      Vفائقة = (30 ميكرولتر × 0.5 ملغم/مل)/1.5 ملغ/مل
      Vفائقة = 10 ميكرولتر
    4. حساب كمية 4X Laemmli العازلة المطلوبة لتحقيق تركيز 1x في 30 ميكرولتر من حجم (30 ميكرولتر / 4 = 7.5 ميكرولتر). ملاحظة: يجب تخفيف 4X Laemmli العازلة إلى قوة 1X في إعداد العينة.
    5. حساب كمية من العازلة التجانس المطلوبة لتحقيق حجم إلى 30 ميكرولتر (والحصول على تركيز البروتين النهائي المطلوب من 0.5 ملغ / مل):
    6. إعداد عينة عن طريق الدوامة ثم pipetting 10 ميكرولتر من البروتين الفائق في 12.5 ميكرولتر من العازلة التجانس. إضافة 7.5 ميكرولتر من العازلة Laemmli 4X للحصول على حل عمل عينة 30 ميكرولتر وتركيز 0.5 ملغم / مل.
  4. إعداد جميع العينات باستخدام الإجراء الموصوف، دوامة ويغلي لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيق العلوي لمنع التسرب والفتح بسبب الضغط أثناء الغليان.
  5. بعد 5 دقائق، ضع على الفور على الجليد. تحميل 20 ميكرولتر من عينة حل العمل لكل هلام جيدا (10 ميكروغرام من البروتين). عينات بروتين منفصلة من قبل SDS-PAGE على هلام تريس غليسين 12٪.
    1. استخدام سلم البروتين الملون مسبقا لتأكيد الأوزان الجزيئية. تشغيل العازلة هو 25 mM تريس قاعدة، 192 mM الجليسين، 0.1٪ SDS، وddH2O، pH 8.3.
    2. بروتينات منفصلة عن طريق الكهتروفورسيس: تعمل عند 80 فولت لمسح الآبار (10 دقائق) و 125 فولت (حوالي ساعة واحدة؛ حتى ينفصل سلم البروتين تماما) لحل البروتينات.
  6. إجراء نقل البروتين إلى النيتروسليلوز باستخدام غشاء نيتروسيلولوس 0.2 ميكرومتر في مخزن نقل تريس الجليسين (25 mM Tris، 192 mM glycine، 0.04٪ SDS، 20٪ الميثانول وddH2O، pH 8.3) بين عشية وضحاها لمدة 40 فولت في 4 درجة مئوية.
  7. غسل البقع نيتروسيلولوس في 1x تريس المالحة (TS; 25mM تريس, 0.9٪ NaCl في ddH2O, درجة الحموضة 7.4) لمدة 10 دقيقة في RT. lncubate في بونسو S لمدة 5 دقائق ثم شطف في ddH2O لتوفير التحقق الخام من تحميل البروتين المكافئ. مسح الصورة ضوئيا للاحتفاظ بسجل لدفتر الملاحظات وإزالة الاحتواء باستخدام PBS.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، اغسل البقعة في ميلي-كيو أو ddH2O التي تحتوي على HCl (0.2٪) لحوالي 5 دقائق. تفحص للسجل. إزالة بقعة بونسو S من الغشاء عن طريق خطوة الحضانة اللاحقة (أي مكان في العازلة حجب).
  8. كتلة البقع في 5٪ مسحوق الحليب غير الدهني في TS لمدة 1 ساعة في RT واحتضان 24h في 4 درجة مئوية مع أرنب المضادة للتيروزين هيدروكسيلاز (1:1000)، المضادةβ-أكتين (1:200)؛ المضادة لGFAP (1:1000) في 5٪ الحليب TS.
  9. غسل البقع 3 × 5 دقيقة في TS مع 0.05٪ توين-20 و 1 × 5 دقيقة في TS، ثم احتضان في الأجسام المضادة الثانوية HRP-المقترنة (1:5000 في TS تحتوي على الحليب 5٪)، مطابقة لأنواع الأولية، لمدة 2 ساعة في RT.
  10. إعداد الركيزة chemiluminescent باستخدام كميات متساوية من حلول الإنارة والبيروكسيد وتطبيق لمدة 1-3 دقيقة. في غرفة مظلمة، ضع لطخة في كم بلاستيكي للتعرض للفيلم وفضح الفيلم. ثم يتم تطوير الفيلم باستخدام معالج أوتوماتيكي.
  11. بقع الشريط مع العازلة تجريد المتاحة تجاريا في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وغسل 3x 10 دقيقة في TS مع 0.05٪ توين-20، و 1x 10 دقيقة في TS ومن ثم إعادة بروب لتحميل السيطرة أو غيرها من البروتين من الفائدة.
  12. قياس الإشارات بواسطة برنامج Image J لقياسات الكثافة البصرية وتطبيعها إلى التحكم الداخلي في التحميل β-actin.

7. الكيمياء العصبية

  1. يتم إعداد الأنسجة للتحليل كما هو موضح أعلاه في القسم 5.2. يرجى الرجوع إلى الجدول 1 لوصفة المرحلة المتنقلة.
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف ≥99.0٪ نقية ودرجة HPLC. ضمان سلامة العازلة مع نظيفة، والأواني الزجاجية مخصصة والحانات اثارة. وينبغي استخدام العازلة المرحلة المتنقلة في غضون سبعة أيام من التحضير.
    1. وزن فوسفات ديهيدروجين وحمض الستريك، إضافة 1 لتر من DDH2O ومزيج في اسطوانة تخرج 2-L. تصفية الحل من خلال غشاء GSTF 0.22-μm.
      ملاحظة: هذا يزيد من استخراج الملوثات في الفوسفات وحمض الستريك، مما يساعد على تقليل التيارات الخلفية.
    2. إضافة OSA تليها الحل أسيتونيتريل وEDTA. إضافة درجة HPLC DDH2O إلى حوالي 1900 مل قبل ضبط درجة الحموضة إلى 3.0 مع حمض الفوسفوريك.
    3. إضافة درجة HPLC DDH2O إلى علامة 2-L، ثم تصب في قارورة 2-L. إضافة شريط اثارة مخصصة، وdgas المرحلة المتنقلة عن طريق تحريكه تحت فراغ لمدة 10 دقائق >.
  2. إعداد معايير الدوبامين, و DOPAC و HVA للمنحنيات القياسية. يتم إعداد حلول المخزون من المعايير في 1 ملغ / مل في 0.3 N PCA.
    1. وزن 12.4 ملغ من الدوبامين-HCl, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ/مل الدوبامين.
    2. وزن 10.0 ملغ من DOPAC, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ / مل DOPAC.
    3. وزن 10.0 ملغ HVA, وإضافة 10.0 مل من 0.3 N PCA لجعل 1 ملغ / مل HVA.
  3. إعداد حلول معيار العمل من حلول المخزون. وتستخدم معايير من خمس نقاط لتوليد منحنى التركيز.
    1. لقياس الدوبامين سترياتال, إعداد تركيزات قياسية من 12.5 نانوغرام / مل, 25 نانوغرام / مل, 50 نانوغرام / مل, 100 نانوغرام / مل, و 200 نانوغرام / مل.
    2. لsriatal DOPAC، وإعداد تركيزات قياسية من 2.5 نانوغرام / مل، 5 نانوغرام / مل، 10 نانوغرام / مل، 20 نانوغرام / مل، و 40 نانوغرام / مل.
    3. بالنسبة إلى سداسي الأطراف سداسي الأطراف، قم بإعداد تركيزات قياسية تبلغ 5 نانوغرام/مل، و10 نانوغرام/مل، و20 نانوغرام/مل، و40 نانوغرام/مل، و80 نانوغرام/مل.
    4. توليد معايير من خمس نقاط: تمييع 1 ملغ / مل محلول مخزون الدوبامين إلى 5 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA. تمييع 1 ملغ / مل DOPAC حل الأسهم إلى 1 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA، وتمييع 1 ملغ / مل محلول الأسهم HVA إلى 2 ميكروغرام / مل باستخدام 0.3N PCA.
    5. نقل 1 مل من الدوبامين 5 ميكروغرام / مل، 1 مل من 1 ميكروغرام / مل DOPAC، و 1 مل من 2 ميكروغرام / مل HVA في قارورة حجمية 25 مل وجلب الحجم إلى علامة 25 مل مع 0.3 N PCA.
      ملاحظة: تحتوي المعايير المختلطة في القارورة الحجمية على أعلى تركيز لمعايير النقاط الخمس: 200 نانوغرام/مل من الدوبامين، و40 نانوغرام/مل من DOPAC، و80 نانوغرام/مل من HVA.
    6. نقل 1 مل من المعايير المختلطة إلى أنابيب طرد مركزي صغيرة نظيفة 1.5 مل. تنفيذ 1:1 المخفف التسلسلي أربع مرات لتوليد المعايير اللاحقة من أربع نقاط.
      1. على سبيل المثال، إلى 250 ميكرولتر من المعايير المختلطة، أضف 250 ميكرولتر من العينة العازلة ودوامة بدقة لإنتاج معايير مختلطة بنسبة 50٪ من التركيزات الأصلية؛ تكرار العملية حتى يتم تحقيق التخفيف المطلوب.
  4. إعداد نظام HPLC (مضخة، أوتومبلر، عكس المرحلة العمود (C18، 150×3.2 ملم، 3 ميكرومتر)). تطهير المضخة مع مرحلة متنقلة جديدة لتحل محل جميع الحلول السابقة في نظام HPLC وفقاعات الهواء المحاصرين مع مرحلة المحمول الطازجة. قم بتبريد الكواتومبلر إلى 4 درجات مئوية. قم بتدفئة العمود إلى 35 درجة مئوية، مما يقلل من الضغط الكلي.
    1. تعيين الجهد في -150 mV و 220 mV للأقطاب الكهربائية الأولى والثانية من الكاشف الكهروكيميائية، على التوالي. توازن النظام لمدة 2 ساعة على الأقل، وبين عشية وضحاها بشكل مثالي، مع مرحلة المحمول بمعدل تدفق 0.2 مل / دقيقة.
      ملاحظة: أثناء التوازن يجب تشغيل الخلايا ومراقبة قراءة الأساس. تشير القراءة المستقرة إلى أن النظام جاهز للاستخدام. لمدة ساعتين من مرحلة التوازن، والسماح للمرحلة المتنقلة للذهاب إلى حاوية النفايات بدلا من إعادة تدويرها. بعد هذه الفترة، يمكن إعادة تدوير المرحلة المتنقلة بين عشية وضحاها لتحقيق التوازن.
    2. بمجرد اكتمال التوازن، قم بتعديل معدل تدفق المرحلة المتنقلة إلى 0.6 مل/دقيقة. حقن 20 ميكرولتر من كل من المعايير من خمس نقاط.
  5. تذوب عينات سترياتال على الجليد، وحقن 2 × 20 ميكرولتر من كل عينة في نظام HPLC. استخدام المعايير في البداية وعشوائية في جميع أنحاء كل مجموعة من العينات سترياتال.
  6. استخدام البرنامج لتحليل المنطقة تحت الدوبامين, DOPAC, وقمم HVA التي تنتجها المعايير والعينات. تحديد التحليلات حسب وقت الاحتفاظ وقياسها من خلال مقارنة المنطقة تحت الذروة بمساحة منحنى 5 نقاط لمعيارها المقابل.
  7. إعداد جزء بيليه كما هو موضح في القسم 5.2.3. إجراء فحص البروتين لوري على بيليه سترياتال. ملاحظة: هذا المقايسة سوف قياس كمية البروتين الموجودة في عينات سترياتال في ملغ / مل; وتستخدم هذه المعلومات لتحديد تركيز نانوغرام / ملغ من التحليل.

8. الكيمياء المناعية

  1. GFAP/TH الفلورة المناعية المزدوجة
    1. إزالة الأنابيب التي تحتوي على منتصف الدماغ المقطعية من -20 درجة مئوية الفريزر وجلب إلى RT. إزالة أقسام الأنسجة التي تحتوي على نيغرا substantia من محلول التبريد في صينية تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    2. ضع أقسام الأنسجة في إدراج البوليسترين مع قيعان شبكة البوليستر للكيمياء المناعية العائمة الحرة. غسل 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    3. نقل المقاطع إلى لوحة 96 جيدا مع حل كتلة 180 ميكرولتر (5٪ مصل الحمير العادي، 1٪ PVP، 1٪ BSA و 0.3٪ تريتون X-100 في PBS) في كل بئر. احتضان 40 دقيقة في RT.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل والحضانة مع هياج خفيف على شاكر.
    4. نقل المقاطع إلى الآبار التي تحتوي على محلول الأجسام المضادة الأولي (180 ميكرولتر لكل بئر). احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية، أرنب المضادة GFAP (1:1000) والأغنام المضادة للTH (1:400) المخفف في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA و 0.3٪ TX-100، لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. IgG من الأنواع الأولية بمثابة السيطرة السلبية على المناعة.
    5. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (1:200 حمار المضادة للأرانب 568 و 1:200 FITC حمار المضادة للأغنام في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ TX-100). استخدام احباط لحماية الحل من الضوء أثناء التحضير والحضانة. احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
      1. للسيطرة السلبية، أقسام الحضانة في IgG من الأنواع الأولية المخفف إلى نفس التركيز المستخدم للأجسام المضادة الأولية.
      2. غسل 2 × برنامج تلفزيوني و 1 × TS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT. ماونت أقسام الأنسجة على الشرائح بالإضافة إلى الشرائح في تصاعد المتوسطة مع وصمة عار Hoechst و coverslip.
    6. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية (1:200 حمار المضادة للأرانب 568 و 1:200 FITC حمار المضادة للأغنام في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ TX-100). استخدام احباط لحماية الحل من الضوء أثناء التحضير والحضانة. احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
    7. غسل 2 × برنامج تلفزيوني و 1 × TS لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT. ماونت أقسام الأنسجة على الشرائح بالإضافة إلى الشرائح في تصاعد المتوسطة مع وصمة عار Hoechst و coverslip.
    8. حماية الشرائح من الضوء والأكسدة حتى التصوير عن طريق تخزين في مربع الشريحة في 4 درجة مئوية.
    9. تحليل السيطرة السلبية أولا لتحديد مستوى الخلفية من الفلورسينس، ثم تقييم لالخمول المناعي الإيجابي باستخدام المجهر الفلورسنت.
  2. الكيمياء المناعية Iba1 مع هطول الأمطار الكروموجين
    1. إزالة الأنابيب التي تحتوي على منتصف الدماغ المقطعية من -20 درجة مئوية الفريزر وجلب إلى RT. إزالة أقسام الأنسجة التي تحتوي على نيغرا substantia من محلول التبريد في صينية تحتوي على برنامج تلفزيوني.
    2. ضع أقسام الأنسجة في إدراج البوليسترين للكيمياء المناعية العائمة الحرة. غسل أقسام 3 × 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني، ووضع أقسام مباشرة في لوحة 12 جيدا تحتوي على ما قبل ساخنة 10 mM حمض الستريك monohydrate، درجة الحموضة 9.0، 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، لاسترجاع epitope.
    3. لوحة باردة 20 دقيقة في RT. أقسام العودة لإدراج وغسل 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    4. نقل المقاطع إلى لوحة 96 بئر تحتوي على محلول حجب 180 ميكرولتر (10٪ مصل الماعز العادي، 1٪ BSA في PBS) لكل بئر، واحتضان 40 دقيقة في RT.
    5. نقل المقاطع إلى الآبار التي تحتوي على 180 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية المخففة (1:1000 في 1٪ BSA-PBS). حضانة بين عشية وضحاها في 4°C.
    6. نقل المقاطع إلى إدراج. غسل 3 × 5 دقيقة برنامج تلفزيوني وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية البيوتينية (1:200 في 1.5٪ مصل طبيعي-PBS) لمدة 1 ساعة في RT.
    7. إعداد حل ABC 30 دقيقة قبل الاستخدام. غسل 3 × 5 دقيقة برنامج تلفزيوني ونقل إلى حل ABC لمدة 1 ساعة في RT.
    8. إعداد حل DAB في غطاء محرك السيارة. غسل 2x 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني و 1x 5 دقيقة في TS، واحتضان أقسام في DAB.
      1. تطوير لمدة 3-4 دقائق. يجب أن تظل السيطرة السلبية خفيفة اللون.
        ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان كما DAB هو مادة مسرطنة معروفة. وينبغي الحفاظ على حل من برمنغنات البوتاسيوم 0.2M في DDH2O لإزالة التلوث على مقربة في حالة التنقيط العرضي.
    9. شطف أقسام لفترة وجيزة في DDH2O، ثم في TS 3 × 5 دقيقة. جبل أقسام على الشرائح بالإضافة إلى الهواء الجاف بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة الدخان.
    10. إزالة التلوث DAB النفايات مع حجم متساو من برمنغنات البوتاسيوم 0.2M في ddH2O، دوامة، واحتضان في غطاء الدخان بين عشية وضحاها قبل تخزين في سلة المهملات DAB المسمى بشكل مناسب في غطاء الدخان.
      ملاحظة: لا يزيل محلول التبييض خصائص الطفرات في DAB.
      1. إزالة التلوث من العناصر التي سيتم إعادة استخدامها (أي إدراج البوليسترين) وغسلها بالمنظفات.
    11. الجفاف / مضادةلاحتواء طفيفة مع كريسيل البنفسجي (السيرة الذاتية). جميع خطوات الجفاف / الغسيل هي 3 دقائق: الإيثانول 70٪، 95٪، 100٪، 95٪، ddH2O، CV (30 ثانية)، ddH20 × 2، 95٪ الإيثانول + حمض الخليك الجليدي (0.1٪) x 2، الإيثانول 100٪، والزيلين.
    12. Coverlip في distyrene-toluene-xylene تصاعد المتوسطة والجافة في غطاء محرك السيارة الدخان.
    13. لاحظ النشاط المناعي الإيجابي بواسطة المجهر الخفيف. IgG من الأنواع الأولية بمثابة السيطرة السلبية على المناعة.

9. الإحصاءات

  1. تقييم الاختلافات بين الوسائل من خلال تحليل الفرق في اتجاه واحد (ANOVA) لمقارنة الاختلافات بين النمط الجيني و ANOVA ثنائي الاتجاه لمقارنة الاختلافات بين النمط الجيني والعلاج السام. استخدام تحليل توكي HSD بعد مخصص عندما لوحظت الاختلافات من خلال اختبار ANOVA(ص≤0.05).
    ملاحظة: يتم إجراء التجارب (مع n = 6-9 فئران/مجموعة) مرتين على الأقل لضمان إمكانية إعادة الإنتاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هذا النموذج التعرض للسموم يمكن أن تنتج كبيرة ويمكن الكشف عنها 20٪ استنفاد الدوبامين سترياتال في MPTP- مقابل الحيوانات التي تحقن المالحة. من المهم ملاحظة أن الكثير من MPTP المختلفة قد تسفر عن آفات أكثر أو أقل قليلا. وبالتالي ، من أجل دقة أفضل ، يوصى بإجراء تجربة أولية على فئران النمط البري قبل استخدامها في المعدلات عندما يتم استخدام الكثير من السموم العصبية الجديدة. استخدام الآفات خفيفة إلى معتدلة يسمح لتأثير المتحول إلى أن يلاحظ; قد تنتج آفة شديدة "تأثير الكلمة" مع إصابة قوية جدا لتوهين أو الضرر بحيث يحجب تأثير تغيير ورا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سمح لنا تصميم دراسة التفاعل بين الجينات والبيئة هذه بالحصول على معلومات جديدة حول الطبيعة المزدوجة ل 5-LOX isozyme في المسار النيغروستريتال. من خلال أداء HPLC لقياس مونوامينات سترياتال بعد المعالجة المالحة أو MPTP في المعدلات التي تفتقر إلى 5-LOX isozyme وزمالات القمامة البرية الخاصة بهم ، تمكنا من ملاحظة أن نقصه يبدو وقائيا في ظل ظروف سامة(الشكل 1)، ولكن في ظل الظروف العادية ، يقلل نقص الإنزيم من مستويات الدوبامين المخططة وقد يكون ضارا. وهكذا، ونحن قادرون على إثبات أن 5-LOX isozyme يساهم في لهجة الدوبام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد شيء للكشف عنه.

شكر وتقدير

وقد مولت هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة NIGMS 056062.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-ميثيل -4-فينيل -1،2،3،6-tetra-hydropyridine hydrochloride (MPTP-HCL)Sigma-AldrichM0896لنمذجة PD
4٪ فورمالديهايد (بارافورمالدهايد) محلول ، مخزن بالفوسفات (PFA) BUP0157الأمريكية MasterTech Scientificلتثبيت الغمر
كاشف ACS لحمض البركلوريك ، 70٪ (PCA)244252سيجما ألدريتشلاستخراج
حمض HPLCتريس بيسسيجما ألدريتشT1503لتجانس الأنسجة
حمض الإيثيلين ديامينوتترا أسيتيك ثنائي الصوديوم ثنائي هيدرات الملح (EDTA)سيجما ألدريتشE1644لتجانس الأنسجة
كوكتيل مثبط البروتيازسيجما ألدريتشP8340لتجانس الأنسجة
كوكتيل مثبط الفوسفاتيزسيجما ألدريتشP5726لتجانس الأنسجة
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)سيجما ألدريتشS5881لفحص البروتين لوري
السكروز ، البيولوجيا الجزيئية ، & ge ؛ 99.5٪ (GC) Sigma-AldrichS0389للحماية من التبريد
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، مسحوق ، درجة الحموضة 7.4 (ل 0.01 M PBS)Sigma-AldrichP3813لمجموعة
فحص البروتين IHC BCAPierce / Thermo23225لتقدير البروتين
Novex 12٪ Tris-Glycine Mini Gels 1.0 مم ، 12 بئرInvitrogen /Life Technologies EC60052BOXلعينة SDS-PAGE
NuPAGE LDS العازلة (4x)Invitrogen / Life TechnologiesNP0007ل SDS-PAGE
Novex Sharp Prestained Protein Standard   ؛سلم البروتين Invitrogen / LifeTechnologies LC5800
GlycineSigma-AldrichG7126ل SDS-PAGE
كبريتات دوديسيل الصوديوم ، الرحلان الكهربائي ، 98.5٪ (SDS)Sigma-AldrichL3771ل SDS-PAGE
كحول الميثيل ، اللامائي ، الكاشف   ؛الميثانول SPM1057C الأمريكي MasterTech Scientificلنقل
كلوريد الصوديوم (NaCl) ، كاشف ACSSigma-AldrichS9888الملحي والمخازن مسحوق
الحليب الجاف الخالي من الدسمقرنفلn / aلمحلول
Ponceau S المناعي في 5٪ حمض الخليك   ؛Sigma-AldrichP7170للنشاف المناعي
المضاد للتيروزين هيدروكسيلاز (TH) ، الأغنام متعددChemicon / MilliporeAB1542للتألق المناعي   ؛
هيدروكسيلاز مضاد للتيروزين (TH) ، متعدد النسيلة للأرانبPel-Freez BiologicalsP40101-0للنشاف المناعي
المضاد للبيتا ؛ الأكتين ، الأرنبSigma-AldrichA2066للبروتين
الحمضي الليفي المضاد للبقع المناعية (GFAP) ، الأرانب متعدد النسيلةChemicon / MilliporeAB5804للبروتين
الحمضي الليفي المضاد للدبقي المناعي (GFAP) ،Covance IncSMI-22Rللنشاف المناعي
Tween-20Sigma-AldrichP1379للنشاف
المناعي للماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ، بيروكسيداز مترافق   ؛فيشر Scientific31462للماعز المناعي المضاد
للأغنام ، بيروكسيداز مترافقبيرس / ثيرمو31480للماعز المناعي
المضاد للفأر ، بيرس/المترافق بيرس / ثيرمو 31430للتألق المناعي
SuperSignal West Pico Chemiluminescent SubstratePierce / Thermo34078للنشاف
المناعيفيلم CL-XPosure 7 بوصة × 9.5 بوصة & nbsp ؛بيرس / ثيرمو34089للنشاف المناعي
استعادة اللطخة الغربية تجريد العازلة   ؛بيرس / ثيرمو21059للنشاف المناعي
أحادي هيدرات حامض الستريك ، كاشف ACS ، & ge ؛ 99.0٪ سيجما ألدريتشC1909
لمصل الحمار العاديMilliporeS30-100MLل IHC
Polyvinylpyrrolidone (PVP)Sigma-AldrichP5288
لألبومين مصل الأبقار IHC (BSA) ،Sigma-AldrichA3294المجفف بالتجميد ل IHC
Triton X-100Fisher ScientificBP151-01ل IHC
الحمار المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 568-labeled Invitrogen / Life TechnologiesA10042ل IHC
الحمار المضادة للأغنام IgG (H + L) ، FITC   ؛Jackson ImmunoResearch713-095-147لوسيط التثبيت الصلب IHC
VECTASHIELD معمختبراتH-1500لمصل
الماعز العاديMilliporeS26-100MLل IHC
VECTASTAIN ABC KIT (Rabbit IgG) & nbsp ؛مختبرات ناقلاتPK-4001للخدمات الصحية العالمية ؛ 10 & ل كل من المحاليل A و B لكل 1 مل PBS (لكل تعليمات)
DAB Peroxidase Substrate Kit ، 3،3'-diaminobenzidineVector LaboratoriesSK-4100ل IHC ؛ لكل 5 مل DDH 2 < / sub >O ، أضف 2 قطرات محلول مخزون عازل ، 2 قطرات DAB ، و 1 قطرة H2< / sub>O2< / sub> (H2< / sub> O2 < / sub>يضاف مباشرة قبل الاستخدام)
بيروكسيد الهيدروجين ، 30٪سيجما-ألدريتش216763لإخماد الخطوة في IHC
Rabbit anti-Iba1Biocare MedicalsCP290Aلمحلول IHC
Cresyl Violet Solution ، قوة منتظمة   ؛FD NeurotechnologiesPS102-01Counterstain ل Iba1 IHC
95٪ إيثانول ، كاشف الكحولSigma-AldrichR8382الجفاف ل IHC
100٪ الإيثانولالمطلق Mallinckrodt7019-10الجفاف لحمض الخليك IHC
Sigma-AldrichA6283destaining ل IHC
XyleneSigma-Aldrichعامل مقاصة 534056 لوسيط تركيب IHC
DPX MountantSigma-Aldrich06522لمركب DAB IHC
O.C.T. - تضمين القسم المجمد المتوسطة EMOCTCSالمدمج الأمريكيلقطع ناظم
برمنجنات البوتاسيومسيجما ألدريتش223468لتطهير محلول DAB
دوبامين هيدروكلوريدسيجما ألدريتشH8502لحمض HPLC
3،4-ثنائي هيدروكسي فينيل أسيتيك (DOPAC) سيجماألدريتش850217لحمض HPLC
هوموفانيليك (HVA)سيجما ألدريتشH1252لحمض
بيركلوريك HPLC (PCA) - 70٪سيجما ألدريتش244252ل HPLC
فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم أحادي الهيدراتسيجما ألدريتش71504لحمض
الستريك أحادي الهيدراتسيجما ألدريتشC1909ل HPLC
1-أوكتان سولفونيك حمض ملح الصوديوم (OSA)سيجما ألدريتشO8380ل HPLC
EDTASigma-AldrichE1644ل HPLC
AcetonitrileEMDAX0145-1للمياه
المقطرة منزوعة الأيونات HPLC HPLC (ddH2< / sub>O)Milliporeل HPLC
0.22 & micro ؛ م غشاء GSTFMilliporeللترشيح
البوليسترين Corning NetwellsSigma-AldrichCLS3477مع قاع شبكة البوليستر ،
لتعطيل الخلايا بالموجات فوق الصوتية IHC (Soniprep 150) MSEMSE.41371.274
جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf5414R
ESA MD-150 عمود الطور العكسي   ؛ESA
HPLC (Ultimate 3000)الآلي DionexISO-3100BM
HPLC (Ultimate 3000)كاشف الكهروكيميائي DionexWPS-3000TSL
ESACoulochem III
Guard CellESA5020
الخلية التحليليةESA5011A
برنامج ChromeleonDionex
Eclipse E400NikonE400مجهر الضوء / الفلورسنت
قفص الماوس القابل للتصرفAncareN10HT
Microfilter أعلىAncareN10MBT
5-LOX- الفئران الناقصةمختبر جاكسون004155
الفئران التي تعاني من نقص 12/15-LOXمختبر جاكسون002778
النسيلة أحادي النسيلة للفأر. ثيرمو IHC DAPI Vector IHC وسيط التبريد إدراجمضخة جهاز أخذ العينات

المراجع

  1. Manning-Bog, A. B., Langston, J. W. Model fusion, the next phase in developing animal models for Parkinson's disease. Neurotox. Res. 11, 219-240 (2007).
  2. Vance, J. M., Ali, S., Bradley, W. G., Singer, C., Di Monte, D. A. Gene-environment interactions in Parkinson's disease and other forms of parkinsonism. Neurotoxicology. 31, 598-602 (2010).
  3. Heikkila, R. E., Hess, A., Duvoisin, R. C. Dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine in mice. Science. 224, 1451-1453 (1984).
  4. Chou, V. P., Holman, T. R., Manning-Bog, A. B. Differential contribution of lipoxygenase isozymes to nigrostriatal vulnerability. Neuroscience. 228, 73-82 (2013).
  5. Deschamps, J. D., Kenyon, V. A., Holman, T. R. Baicalein is a potent in vitro inhibitor against both reticulocyte 15-human and platelet 12-human lipoxygenases. Bioorg. Med.Chem. 14, 4295-4301 (2006).
  6. Weaver, J. R., et al. Integration of pro-inflammatory cytokines, 12-lipoxygenase and NOX-1 in pancreatic islet beta cell dysfunction. Mol. Cell Endocrinol. 358, 88-95 (2012).
  7. Yigitkanli, K., et al. Inhibition of 12/15-lipoxygenase as therapeutic strategy to treat stroke. Ann. Neurol. 73, 129-135 (2013).
  8. van Leyen, K., et al. Novel lipoxygenase inhibitors as neuroprotective reagents. J Neurosci. Res. 86, 904-909 (2008).
  9. Chu, J., Pratico, D. 5-lipoxygenase as an endogenous modulator of amyloid beta formation in vivo. Ann. Neurol. 69, 34-46 (2011).
  10. Langston, J. W., Ballard, P., Tetrud, J. W., Irwin, I. Chronic Parkinsonism in humans due to a product of meperidine-analog synthesis. Science. 219, 979-980 (1983).
  11. Bove, J., Perier, C. Neurotoxin-based models of Parkinson's disease. Neuroscience. 211, 51-76 (2012).
  12. Beal, M. F. Neuroprotective effects of creatine. Amino Acids. 40, 1305-1313 (2011).
  13. Jackson-Lewis, V., Blesa, J., Przedborski, S. Animal models of Parkinson's disease. Parkinsonism Relat. Disord. 18, 183-185 (2012).
  14. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
  15. Wang, H., Shimoji, M., Yu, S. W., Dawson, T. M., Dawson, V. L. Apoptosis inducing factor and PARP-mediated injury in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 991, 132-139 (2003).
  16. Petroske, E., Meredith, G. E., Callen, S., Totterdell, S., Lau, Y. S. Mouse model of Parkinsonism: a comparison between subacute MPTP and chronic MPTP/probenecid treatment. Neuroscience. 106, 589-601 (2001).
  17. Przedborski, S., et al. The parkinsonian toxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP): a technical review of its utility and safety. J. Neurochem. 76, 1265-1274 (2001).
  18. Thomas, B., et al. Mitochondrial permeability transition pore component cyclophilin D distinguishes nigrostriatal dopaminergic death paradigms in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Antioxid. Redox. Signal. 16, 855-868 (2012).
  19. Sonsalla, P. K., Heikkila, R. E. The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic neurotoxicity in mice. Eur. J. Pharmacol. 129, 339-345 (1986).
  20. Di Monte, D. A., et al. Relationship among nigrostriatal denervation, parkinsonism, and dyskinesias in the MPTP primate model. Mov. Disord. 15, 459-466 (2000).
  21. Lee, K. W., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 mediates MPTP toxicity and regulates glial activation. PLoS One. 7, (2012).
  22. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat. Protoc. 2, 141-151 (2007).
  23. Bolin, L. M., Strycharska-Orczyk, I., Murray, R., Langston, J. W., Di Monte, D. Increased vulnerability of dopaminergic neurons in MPTP-lesioned interleukin-6 deficient mice. J. Neurochem. 83, 167-175 (2002).
  24. Manning-Bog, A. B., et al. Increased vulnerability of nigrostriatal terminals in DJ-1-deficient mice is mediated by the dopamine transporter. Neurobiol. Dis. 27, 141-150 (2007).
  25. Quik, M., Di Monte, D. A. Nicotine administration reduces striatal MPP+ levels in mice. Brain Res. 917, 219-224 (2001).
  26. Markey, S. P., Johannessen, J. N., Chiueh, C. C., Burns, R. S., Herkenham, M. A. Intraneuronal generation of a pyridinium metabolite may cause drug-induced parkinsonism. Nature. 311, 464-467 (1984).
  27. Heikkila, R. E., Manzino, L., Cabbat, F. S., Duvoisin, R. C. Protection against the dopaminergic neurotoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine by monoamine oxidase inhibitors. Nature. 311, 467-469 (1984).
  28. Crampton, J. M., Runice, C. E., Doyle, T. J., Lau, Y. S., Wilson, J. A. MPTP in mice: treatment, distribution and possible source of contamination. Life Sci. 42, 73-78 (1988).
  29. Yang, S. C., Markey, S. P., Bankiewicz, K. S., London, W. T., Lunn, G. Recommended safe practices for using the neurotoxin MPTP in animal experiments. Lab. Anim. Sci. 38, 563-567 (1988).
  30. Lau, Y. S., Novikova, L., Roels, C. MPTP treatment in mice does not transmit and cause Parkinsonian neurotoxicity in non-treated cagemates through close contact. Neuroscience research. 52, 371-378 (2005).
  31. Satoh, N., et al. Central hypothermic effects of some analogues of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP). Neurosci. Lett. 80, 100-105 (1987).
  32. Fernagut, P. O., et al. Behavioral and histopathological consequences of paraquat intoxication in mice: effects of alpha-synuclein over-expression. Synapse. 61, 991-1001 (2007).
  33. Manning-Bog, A. B., McCormack, A. L., Purisai, M. G., Bolin, L. M., Di Monte, D. A. Alpha-synuclein overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J. Neurosci. 23, 3095-3099 (2003).
  34. Richfield, E. K., et al. Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein in transgenic mice. Exp. Neurol. 175, 35-48 (2002).
  35. Thomas, B., et al. Resistance to MPTP-neurotoxicity in alpha-synuclein knockout mice is complemented by human alpha-synuclein and associated with increased beta-synuclein and Akt activation. PloS one. 6, (2011).
  36. Smeyne, M., Goloubeva, O., Smeyne, R. J. Strain-dependent susceptibility to MPTP and MPP(+)-induced parkinsonism is determined by glia. Glia. 34, 73-80 (2001).
  37. Hamre, K., Tharp, R., Poon, K., Xiong, X., Smeyne, R. J. Differential strain susceptibility following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) administration acts in an autosomal dominant fashion: quantitative analysis in seven strains of Mus musculus. Brain Res. 828, 91-103 (1999).
  38. Sedelis, M., et al. MPTP susceptibility in the mouse: behavioral, neurochemical, and histological analysis of gender and strain differences. Behav. Genet. 30, 171-182 (2000).
  39. Boyd, J. D., et al. Response to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) differs in mouse strains and reveals a divergence in JNK signaling and COX-2 induction prior to loss of neurons in the substantia nigra pars compacta. Brain Res. 1175, 107-116 (2007).
  40. Ookubo, M., Yokoyama, H., Kato, H., Araki, T. Gender differences on MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) neurotoxicity in C57BL/6 mice. Molecular and cellular endocrinology. 311, 62-68 (2009).
  41. Kenchappa, R. S., Diwakar, L., Annepu, J., Ravindranath, V. Estrogen and neuroprotection: higher constitutive expression of glutaredoxin in female mice offers protection against MPTP-mediated neurodegeneration. FASEB J. 18, 1102-1104 (2004).
  42. Jackson-Lewis, V., Jakowec, M., Burke, R. E., Przedborski, S. Time course and morphology of dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Neurodegeneration. 4, 257-269 (1995).
  43. Mizuno, Y., Sone, N., Saitoh, T. Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the enzymes in the electron transport system in mouse brain. J. Neurochem. 48, 1787-1793 (1987).
  44. Nicklas, W. J., Youngster, S. K., Kindt, M. V., Heikkila, R. E. M. P. T. P. MPP+ and mitochondrial function. Life Sci. 40, 721-729 (1987).
  45. Nicklas, W. J., Vyas, I., Heikkila, R. E. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahydropyridine. Life Sci. 36, 2503-2508 (1985).
  46. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J. Neurosci. 22, 1763-1771 (2002).
  47. Kurkowska-Jastrzebska, I., Wronska, A., Kohutnicka, M., Czlonkowski, A., Czlonkowska, A. The inflammatory reaction following 1-methyl-4-phenyl-1,2,3, 6-tetrahydropyridine intoxication in mouse. Exp. Neurol. 156, 50-61 (1999).
  48. Tatton, N. A., Kish, S. J. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience. 77, 1037-1048 (1997).
  49. Furuya, T., et al. Caspase-11 mediates inflammatory dopaminergic cell death in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci. 24, 1865-1872 (2004).
  50. Anderson, D. W., Bradbury, K. A., Schneider, J. S. Neuroprotection in Parkinson models varies with toxin administration protocol. Eur. J. Neurosci. 24, 3174-3182 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MPTP Iba 1

مقالات ذات صلة