مقالة منهجية

عزل الغدد متعددة الخلايا القابلة للحياة من أنسجة النبات آكل اللحوم ، Nepenthes

4.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50993

⸱

ديسمبر 22, 2013

 ,  ,  , 
1Laboratoire Agronomie et Environnement, Université de Lorraine, 2Department of Bioorganic Chemistry, Max Planck Institute for Chemical Ecology, 3aura optik

في هذه المقالة

ملخص

< p class = "jove_content" > الغدد النباتية هي هياكل متخصصة مسؤولة عن التخليق الحيوي وإفراز العديد من المركبات المشاركة في التفاعلات مع البيئة الحيوية. لتمكين إجراء دراسات حول خصائصها الجزيئية والكيميائية الحيوية ، تم إنشاء تقنية التحضير الدقيق الميكانيكية من أجل عزل الغدد المفردة النشطة الأيضية ، هنا من نبات Nepenthes آكل اللحوم.

الملخص

تمتلك العديد من النباتات هياكل متخصصة تشارك في إنتاج وإفراز مركبات وبروتينات محددة منخفضة الوزن الجزيئي. يتم توطين هذه الهياكل دائما على أسطح النبات. من بينها الرحيق أو ثلاثيات الغدية. غالبا ما تستخدم المركبات المفرزة في التفاعلات مع البيئة الحيوية ، على سبيل المثال كجاذبات للملقحات أو رادع ضد العاشبة. يمكن العثور على < p class = "jove_content" > الغدد الفريدة من نوعها في عدة جوانب في النباتات آكلة اللحوم. في ما يسمى بنباتات الإبريق من جنس Nepenthes ، تفرز الغدد ثنائية الوظيفة داخل مصيدة المزالق من ناحية السائل الهضمي ، بما في ذلك جميع الإنزيمات اللازمة لهضم الفريسة ، ومن ناحية أخرى تمتص العناصر الغذائية المنطلقة. وبالتالي ، فإن هذه الغدد تمثل نسيجا مثاليا ومتخصصا مخصصا مسبقا لدراسة الآليات الجزيئية والكيميائية الحيوية والفسيولوجية الأساسية لإفراز البروتين وامتصاص العناصر الغذائية في النباتات. علاوة على ذلك ، يمكن بشكل عام التخليق الحيوي للمركبات الثانوية التي تنتجها العديد من النباتات المجهزة بهياكل غدية مباشرة في الغدد.

من أجل العمل على مثل هذه الهياكل المتخصصة ، يجب عزلها بكفاءة وسرعة ونشطة في التمثيل الغذائي وبدون تلوث بالأنسجة الأخرى. لذلك ، تم تطوير تقنية التحضير الدقيق الميكانيكية وتطبيقها للدراسات على سائل الهضم Nepenthes. هنا ، يتم تقديم بروتوكول تم استخدامه لإعداد غدد مفردة ثنائية الوظيفة بنجاح من مصائد Nepenthes ، بناء على منصة أخذ العينات المجهرية الآلية. يمكن عزل الغدد واستخدامها مباشرة لتحليل التعبير الجيني بواسطة تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد تحضير الحمض النووي الريبي.

المقدمة

تنتج النباتات مجموعة واسعة وكبيرة من المركبات ذات التطبيقات الصناعية والدوائية المختلفة، والتي تتراوح من الجزيئات ذات الوزن الجزيئي الصغير إلى البوليمرات. وغالباً ما يتم إنتاج هذه المركبات وإفرازها بواسطة تراكيب متخصصة للغاية، يقع الكثير منها على سطح النباتات مثل الشعيرات الغدية أو الغدد الرحيقية، أو داخلياً مثل الخلايا المنفردة أو قنوات اللاتكس والراتنج، على التوالي. ومع ذلك، فإن المعروف عن بيولوجيا هذه التراكيب الإفرازية المتخصصة قليل نسبياً، رغم أن جميع أنواع هذه الغدد تظهر العديد من السمات التي تشير إلى وجود عملية أيض نشطة. وبشكل خاص، يمكن اعتبار غدد النباتات الآكلة للحوم مثل Nepenthes أنظمة نموذجية في بيولوجيا الخلية النباتية1.

تعتبر النباتات الآكلة للحوم موضوعاً للعديد من الدراسات منذ عام 1875 عندما نُشر كتاب تشارلز داروين "النباتات الآكلة للحشرات"2. ومع ذلك، لم يتم إجراء أبحاث على المستوى الجزيئي إلا في السنوات القليلة الماضية، ولا تزال معرفتنا محدودة. على سبيل المثال، لا يزال التركيب البروتيني لسائل الهضم في النباتات الإبريقية من جنس Nepenthes غير معروف بالكامل. ومؤخراً فقط تم تحديد العديد من البروتينات المحللة مائياً وعدد قليل من الجينات المقابلة لها أيضاً3. في المصائد الساقطة لنبات Nepenthes (الشكل 1)، تتركز غدد متعددة الخلايا في الجزء السفلي الداخلي من الأباريق. تقوم هذه الغدد بكل من إنتاج وإفراز الإنزيمات الهاضمة في سائل الإبريق وامتصاص العناصر الغذائية الذائبة منه4. وبناءً على ذلك، تمثل هذه الغدد ثنائية الوظيفة نسيجاً دقيقاً فريداً يشغل موقعاً ويوفر وظيفة مركزية في آلية التغذية على اللحوم في نبات Nepenthes ، وهو ما يستحق الدراسة بالتفصيل.

تشريح النباتات آكلة اللحوم، تفاصيل جرة Nepenthes، دراسة نباتية، آلية المصيدة، التكيف.
الشكل 1. جرة Nepenthes alata. يحتوي الجزء السفلي من الجرة على السائل الهضمي والغدد في الداخل. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

في علوم النبات، تعتمد العديد من النهج التجريبية على "المواد السائبة" (bulk material) لأنه لا يتم فحص نسيج محدد بل أعضاء كاملة. ونتيجة لذلك، فإن تجانس هذه المواد وتحليلها لا يمكن أن يقدم سوى نتائج مخففة وتناسبية بالنسبة للأنسجة والخلايا الفردية5. ولحل هذه المشكلة، تم تطوير تقنيات التحضير الدقيق، مثل ما يسمى بتشريح الميكرو بالتقاط الليزر (LCM)، واستُخدمت بنجاح لحصد أنسجة نباتية محددة وتحليل محتوياتها الفردية6. ومع ذلك، غالباً ما تكون تقنية LCM محدودة إذا كانت المكونات الخلوية المستهدفة غير مستقرة و/أو سريعة التحلل مثل RNA. وفي مثل هذه الحالة، تكون الحاجة إلى تثبيت الأنسجة مسبقاً، وهي عملية تستغرق وقتاً وغالباً ما يصاحبها تحلل الجزيئات الحيوية، أمراً غير مفيد. علاوة على ذلك، وبسبب المحتوى المائي العالي للعديد من الأنسجة النباتية وقوة جدران الخلايا، غالباً ما تفشل تقنية LCM في التحضير مباشرة من الأنسجة الطازجة7. إن أي نهج لدراسة المكونات الخلوية الموجودة في الغدد الإفرازية، بدءاً من الجينات و mRNA والبروتينات وصولاً إلى المركبات الثانوية وتخليقها الحيوي، يتطلب تقنيات بديلة لهذا التحضير الخاص. وبالتالي، تبرز الحاجة إلى تقنيات محددة لعزل خلايا مفردة أو حتى غدد متعددة الخلايا تظل سليمة بعد عملية التحضير.

يُقدَّم هنا منهج يعتمد على منصة أخذ عينات مجهرية ميكانيكية تتميز بتصوير مجهري مباشر. وتُعد هذه التقنية سريعة وفعالة في تحضير الغدد الفردية من أباريق نيبينثس (Nepenthes) الأنواع. وتعتبر هذه الغدد متعددة الخلايا ثنائية الوظيفة، أي، تشارك هذه الخلايا في عمليات الإفراز والامتصاص على حد سواء، وهي خلايا ساكنة، وتتغلظ طبقات الخلايا غير المعرضة (للوسط الخارجي) لتكوين البشرة الداخلية. ويمكن عزل الغدد بأكملها دون الأنسجة المجاورة لها، وترسيبها بطريقة محددة بدقة في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وتُطبق هذه التقنية لدراسة جينات محددة بالإضافة إلى التعبير الجيني في أنسجة الغدد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

فئة

1. تحضير المواد النباتية

  1. نمت جميع أنواع Nepenthes إما في البيوت الزجاجية MPI للإيكولوجيا الكيميائية أو الحديقة النباتية في جينا ، ألمانيا.
  2. لتحضير إفراز الأنسجة ، قم بحصاد إبريق وإزالة الثلث العلوي بما في ذلك الغطاء والمحيط والمنطقة الزلقة. يمكن استخدام الإبريق إما طازجا أو مجمدا في النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >2. التشريح المجهري لأنسجة الإبريق

  1. تتكون منصة أخذ العينات المجهرية من مجهر مجسمة ومعالج دقيق ، يتم توصيله مباشرة بجسم المجهر ويتم تشغيله بواسطة عصا تحكم ثلاثية الأبعاد. هنا ، تم استخدام نموذج أولي مبكر للأوريكا كما هو موثق (الشكل 2 أ).
  2. لتشريح الغدد الإفرازية من أباريق Nepenthes ، استخدم ملقطا دقيقا وقم بإرفاقه بالمتلاعب (الشكلان 2 أ و 2 ب).
  3. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، عالج جميع الأدوات (شفرات الحلاقة ، الملقط ، الملاعب الدقيقة ، الملقط الدقيق ، شريحة الكائن) باستخدام RNaseZAP.
  4. قم بإعداد أنابيب التجميع عن طريق إضافة 9 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز و 1 ميكرولتر مثبط RNase في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل لاستخراج الحمض النووي الريبي. لتفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من عينات الأنسجة ، استخدم الماء الخالي من النوكلياز فقط (10 ميكرولتر).
    1. خذ الإبريق الطازج أو المجمد وقم بإزالة قطعة 1-2 سم2 من الأنسجة التي تحتوي على الغدد الإفرازية باستخدام شفرة حلاقة وملاقط. اغسل الأنسجة بالماء. أضف 0.1٪ ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) إذا تم استخراج الحمض النووي الريبي.
    2. قم بتثبيت المادة النباتية بشريط لاصق مزدوج الوجه على شريحة كائن (يجب أن يكون السطح المغطى بالغدة متجها لأعلى ، الشكلان 2C و 2D) وقم بتأمين الشريحة بشريط لاصق على مرحلة عالمية ، والتي يجب تطبيقها بطاولة متحركة.
    3. لاستخراج الأحماض النووية ، يجب أن يتم التحضير على الجليد. لذلك ، خذ صندوقا مسطحا من الستايروفوم ، ضع المرحلة العالمية التي تحتوي على العينة بالداخل واملأ الصندوق بالثلج. بعد ذلك ضع الصندوق تحت المجهر.
    4. للتحضير ، وضع الغدد مهم جدا. الغدد الإفرازية مغطاة جزئيا بغطاء واقي (الشكل 3) ولا يمكن الوصول إليها إلا عن طريق الملقط من جانب واحد. علاوة على ذلك ، يجب ضبط زاوية العينة إلى الملقط عن طريق إمالة طاولة المرحلة العالمية بحوالي 135 درجة ، اعتمادا على أنواع Nepenthes.
    5. يتم التشريح المجهري تحت التحكم البصري. لعزل الغدة ، استخدم مرشحا غير للأشعة فوق البنفسجية ، للحد من تدهور الحمض النووي والحمض النووي الريبي.
    6. انقل المعالج الدقيق والملقط عبر لوحة التحكم إلى الغدة المحددة. عند الوصول إلى الغدة ، ضع كل ذراع من الملقط على جانبي الغدة. قم بإزالة الغدة من الأنسجة المتبقية عن طريق إغلاق الملقط (الشكل 4 أ).
    7. قم بتوجيه الغدة المتصلة بالملقط بعيدا عن الجسم وإلى أنبوب التجميع. اجعل أطراف الملقط ملامسة للمحلول الموجود في الأنبوب (الشكل 4 ب). يجب ملاحظة تحرير الغدة عن طريق فتح الملقط جيدا ، لأن الغدد تميل إلى الالتصاق بطرف الأداة. يمكن تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج تفاعل البوليميراز المتسلسل أو الحمض النووي الريبي.
فئة

3. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر من أنسجة Nepenthes

  1. لإثبات كفاءة طريقة التحضير ، يمكن إجراء نهج تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة من أنسجة الغدة دون خطوة استخراج الحمض النووي.
  2. لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم بادئات خاصة بالجينات ؛ هنا ترميز لتسلسل بروتين شبيه بالثوماتين (TLP) (إلى الأمام: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3 '، عكس: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
    1. اجمع 1-5 غدد في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. لتفاعل 50 ميكرولتر ، أضف 5 ميكرولتر من 10x Taq buffer ، و 1 ميكرولتر 10 ملي مولار ثلاثي فوسفات ديوكسي نوكليوزيد (dNTPs) ، و 3 ميكرولتر 25 ملي مولار MgCl2 ، و 0.4 ميكرولتر (1.25 U) بوليميراز Taq DNA ، و 1 ميكرولتر (100 ميكرولتر) من كل برايمر ، و 28.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    2. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي: التمسخ الأولي 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ 35 دورة من التمسخ (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، التلدين (59 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، والتمديد (72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) ؛ وخطوة تمديد نهائية لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    3. إثبات تضخيم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. لذلك استخدم 1.5٪ (وزن / حجم) الاغاروز وقم بإذابته في 1x TAE (40 ملي مولار قاعدة تريس ، 20 ملي مولار حمض الخليك الجليدي ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8). سخني المحلول في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز. إلى محلول الاغاروز 100 مل ، أضف 1 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم (10 ميكروغرام / ميكرولتر) للتصور النهائي. قم بتشغيل الجل في 1x TAE buffer عند 300 فولت ، 115 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة تقريبا في غرفة الرحلان الكهربائي. يجب أن يكون الحجم الصحيح لأمبليكون TLP عند 690 نقطة أساس.
فئة

4. استخراج الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة الصغيرة والنسخ العكسي

  1. قم بتنفيذ الخطوات التالية على الجليد. لاستخراج الحمض النووي الريبي ، تم استخدام طريقتين للاستخراج ، مجموعة Micro Kit لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي ومجموعة عزل mRNA المطبقة بالخرز المغناطيسي.
  2. اجمع ما لا يقل عن 30 غدة إفرازية عن طريق التحضير المجهري في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحتوي على 1 ميكرولتر من مثبط RNase و 9 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. بعد ذلك ، قم بتحليل الأنسجة في جهاز تدوير حراري لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي.
    1. بعد التحضير ، أضف 90 ميكرولتر من محلول التحلل إلى العينة واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية. بعد ذلك قم بتحميل مزيج التفاعل على العمود (المرفق مع المجموعة) واستمر في خطوات الغسيل كما هو موضح في دليل الشركة المصنعة.
    2. قم بتخطيب الحمض النووي الريبي مرتين بمحلول شطف 10 ميكرولتر على التوالي واستمر في علاج DNase I.
    3. إلى 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخرج ، أضف 2 ميكرولتر من 10x DNase I buffer و 1 ميكرولتر DNase I (مزود بمجموعة استخراج الحمض النووي الريبي) واحتضن ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أوقف التفاعل بإضافة 2 ميكرولتر من كاشف تعطيل DNase واحتضانه لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد خطوة الطرد المركزي لمدة 1.5 دقيقة بأقصى سرعة ، يمكن نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب جديد خال من RNase. حدد تركيز الحمض النووي الريبي لكل عينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. يجب تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
  4. استخراج الرنا المرسال باستخدام الخرز المغناطيسي.
    1. اضبط حجم العينة على 100 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للتحلل / الربط (المزود في المجموعة) واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 75 درجة مئوية. أضف 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المرفق بطبقة Oligo (dT) 25 المتدلية واخلط التفاعل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يرتبط mRNA بواسطة ذيل poly (A) ب Oligo (dT) 25 المتدلي من الخرز.
    2. قم بتنفيذ خطوات غسيل mRNA المرتبط بالخرز المغناطيسي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. يمكن إزالة المحاليل باستخدام مغناطيس. أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولتر 10 ملي مخازلة Tris-HCl (درجة الحموضة 7.5).
    3. قم بإزالة ملوثات الحمض النووي الجيني عن طريق معالجة العينة ب 2U (1 ميكرولتر) من DNase (2 ميكرولتر 10x DNase buffer و 17 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة محلول الإنزيم بواسطة المغناطيس ويتم تعليق الخرزات في 20 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-HCl عازلة. لا يمكن قياس تركيز الحمض النووي الريبي لأنه متصل بالخرز. يجب تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
  5. للنسخ العكسي ، استخدم مجموعة توليف (كدنا). تم إجراء ردود الفعل باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    1. للنسخ العكسي لإجمالي الحمض النووي الريبي ، أضف 1 ميكرولتر (100 ميكرولتر) أوليغو (dT) 20 برايمر أو 1 ميكرولتر (0.4 ميكروجرام) Hexamers عشوائي ، 1 ميكرولتر مثبط RNase ، و 1 ميكرولتر 10 ملي مولار dNTP امزج إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي واضبط الحجم إلى 14 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز. احتضن عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم ضع العينات على الجليد. أضف 1 ميكرولتر 0.1M DTT ، و 1 ميكرولتر نسخ عكسي ، و 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x RT. يتم احتضان التفاعلات لمدة 55 دقيقة عند 50 درجة مئوية ، تليها خطوة تعطيل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد النسخ العكسي يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
    2. بالنسبة للرنا المرسال المرتبط بالخرز المغناطيسي ، استبدل المخزن المؤقت Tris-HCl بمزيج التفاعل الأول (مثبط RNase 1 ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر 10 ملي مولار dNTP Mix ، و 12 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز) واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية. بسبب البروز Oligo (dT) 25 للخرز ، ليس من الضروري إضافة برايمر Oligo (dT) 20 أو Hexamers عشوائي إلى العينات. بعد ذلك اتبع البروتوكول أعلاه (الخطوة 4.5.1).
    3. قم بقياس تركيز (كدنا) باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية.

5. تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

  1. بالنسبة للتحليلات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، استخدم إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام Micro Kit و SYBR Green QPCR Master Mix. لضمان كمية متساوية من النصوص ، اضبط تركيز (كدنا) لكل عينة على نفس القيمة بعد النسخ العكسي.
  2. بالإضافة إلى العينات ، يتم إدخال تفاعلات التحكم. استخدم عنصر تحكم غير قالب للكشف عن التلوث في الكواشف والتحقق من جودة البادئات. للتحقق من عدم وجود الحمض النووي الجيني ، قم بتشغيل عنصر تحكم غير RT. يجب أن يكون كلا التفاعلين سالبين (لا توجد إشارة مضنية) في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
  3. لضمان مستوى نسخ متساو بين العينات المختلفة ، استخدم جينا مرجعيا واحدا على الأقل. هنا ، تم استخدام أزواج التمهيدي المصممة لترميز الأكتين (إلى الأمام: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCACAGG-3 '، العكس: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') و 18SrRNA (إلى الأمام: 5'-CTTGATTCTATGGGTGGTGGGTG-3'، العكس: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). كجين مستهدف ، تم اختيار TLP (إلى الأمام: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3 '، العكس: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). كان حجم كل جزء مضخم حوالي 100 نقطة أساس.
  4. لتفاعل 25 ميكرولتر ، أضف 12.5 ميكرولتر 2x SYBR Green QPCR Master Mix ، و cDNA (≥20 نانوغرام) ، و 400 نانومتر من كل برايمر ، و 30 نانومتر من الصبغة المرجعية السلبية ROX (مرفقة مع مجموعة). اضبط حجم العينة على 25 ميكرولتر بماء خال من النوكلياز.
  5. تم إجراء التفاعلات في جهاز تدوير حراري QPCR مع البرنامج التالي: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتنشيط البوليميراز ؛ 40 دورة من التمسخ (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، التلدين (61 درجة مئوية لمدة 60 ثانية) ، والتمديد (72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة) ؛ يليه منحنى التفكك (95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية). يعد منحنى التفكك ضروريا لتحديد عدم وجود ثنائيات التمهيدي ، والتي يمكن اكتشافها من خلال ذروة إضافية.
  6. حدد الكفاءة (E) لكل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام طريقة ليو وسانت8. يمكن انحراف الكفاءة عن الجزء الخطي من منحنى التضخيم. هنا يرتبط رقم الamplicon النسبي (Rn ، A) لنقطة دورة واحدة (CPA) بكمية الأمبليكونات (Rn ، B) لدورة أخرى (CPB).
  7. قم بتحليل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام أداة برنامج التعبير النسبي (REST 2009، http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html) أو برنامج مشابه. استخدم البرنامج لحساب نسبة التعبير عن الجين في عينة معالجة مقارنة بعنصر تحكم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحضير غدد مفردة من نسيج أباريق Nepenthes، تم تطوير وتطبيق تقنية تشريح دقيق ميكانيكية. يجب أن تكون منصة التحضير الدقيق مجهزة بملقط دقيق، متصل بمتحكم دقيق، والذي يتم تشغيله بدوره بواسطة لوحة تحكم. يمكن استهداف الغدد الفردية المرئية تحت المجهر باستخدام الملقط الذي يمسك بنسيج الغدة ويزيله ميكانيكياً (الشكل 4A).

نُقلت الأنسجة الغدية مباشرة إلى أنبوب PCR لإجراء التحليل اللاحق (الشكل 4B). ويمكن ملاحظة نجاح عملية إزالة الغدد لأنها كشفت عن الجهاز الوعائي للنب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لفترة طويلة ، تم إجراء دراسات الهياكل الإفرازية النباتية ، ولا سيما ثلاثية الأبعاد بشكل أساسي على علم التشريح وكانت وصفية بحتة. هناك مجموعة كبيرة من المنشورات من هذا النوع كما هو موضح في المراجعات التي أجرتها9-11. لا تزال معرفتنا الكيميائية الحيوية والجزيئية بالهياكل الإفرازية النباتية محدودة على الرغم من بعض الأعمال الرائعة المبكرة ، على سبيل المثال على ثلاثية الثلاثيات الغدية بالنعناع ، مما يدل على أن ثلاثي الطبقات الغدية هو موقع التخليق الحيوي للأحاديات التي تفرز في الفضاء تحت الجلد12. و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

نشكر فريق الدفيئة في MPI-CE في الحديقة النباتية بجامعة فريدريش شيلر ، جينا ، لزراعة النباتات وفيلهلم بولاند وجمعية ماكس بلانك على الدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
RNAqueous-Micro KitLife Technologies GmbH ، ألمانياAM1931عزل الحمض النووي الريبي الكلي ، 50 عينة
Dynabeads mRNA DIRECT Micro KitLife Technologies GmbH ، ألمانيا610115 مل Dynabeads Oligo (dT) 25< / sub>
DynaMag-2 magnetLife Technologies GmbH ، ألمانيا12321D
SuperScript Cellsنظام تخليق(كدنا) المباشرLife Technologies GmbH ، ألمانيا18080-20025 تفاعلا
RNaseOUTLife Technologies GmbH ، ألمانيا10777-019مثبط Rnase ، 5,000 وحدة
Hexamers عشوائي (0.4 & mu ؛ ز /&مو; ل)QIAGEN GmbH ، ألمانيا79236100 & mu ؛ ل
10 ملي مولار dNTP Mix ، درجة البيولوجيا الجزيئيةFermentas GmbH ، ألمانياR01921 مل
Taq < / em> بوليميراز DNA ، (مؤتلف)Fermentas GmbH ، ألمانياEP0402مزود بمخزن مؤقت 10x Taq< / em> (مع KCl أو (NH4< / sub>) 2< / sub>SO4< / sub>) و 25 ملي مولار MgCl2< / sub>
TURBO DNaseLife Technologies GmbH ، ألمانياAM22381,000 وحدة
AgaroseCarl Roth GmbH Co. ألمانياT846.3
GeneRuler سلم الحمض النووي منخفض المدى ، جاهز للاستخدامFermentas GmbH ، ألمانياSM119350 & mu ؛ ز
بريليانت II SYBR Green QPCR Master MixAgilent Technologies، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية600828مجموعة واحدة
RNaseZAPSigma-Aldrich ، Taufkirchen ، ألمانياR2020
شفرة الحلاقةCarl Roth GmbH Co. ، ألمانياCK08.1
ملاقطCarl Roth GmbH Co. ، ألمانيا2801.1 / 2855.1
GE NanoVue الطيفGE Healthcare Europe GmbH ، ألمانيا28-9569-62
Mastercycler التدرجEppendorf AG ، هامبورغ ، ألمانيا5331 000.010
Mx3000P نظام PCR في الوقت الحقيقيستراتاجين ، الولايات المتحدة الأمريكية401403
Agagel القياسي الأفقي هلام الرحلان الكهربائي غرفةBiometraتوقف
Micromanipulatoraura optik gmbhaurekaمجهزة بملقط مجهر
مجهرمجهر كارل زايس المجهري ، جينا ، ألمانياSteREO Lumar.V12مجهزة بمجموعة مرشحات AxioCam
Lumar 01Carl Zeiss ، المجهر ، جينا ، ألمانيا485001-0000-000مرشح الأشعة فوق البنفسجية
مجموعة مرشح Lumar 09Carl Zeiss ، المجهر ، جينا ، ألمانيا485009-0000-000مرشح غير للأشعة فوق البنفسجية
الضوئي

المراجع

  1. Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research. Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).
  2. Darwin, C. Insectivorous plants. , John Murray. London. (1875).
  3. Mithöfer, A. Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic. Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).
  4. Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant. Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).
  5. Brandt, S. P. Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels. J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).
  6. Hölscher, D., Schneider, B. Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites. Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).
  7. Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes. Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).
  8. Liu, W. H., Saint, D. H. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).
  9. Werker, E. Trichome diversity and development. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).
  10. Fahn, A. Structure and function of secretory cells. Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).
  11. Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. The carnivorous plants. , Academic Press. London. (1989).
  12. Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products. Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).
  13. Rontein, D., Onillon, S., et al. CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane. J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).
  14. Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants. Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).
  15. Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. Chemical ecology of plant-insect interactions. Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).
  16. Kennedy, G. G. Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon. Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).
  17. Mithöfer, A., Boland, W. Plant defense against herbivores: Chemical aspects. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).
  18. Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes. J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA

مقالات ذات صلة