مقالة منهجية

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

DOI:

10.3791/51005

⸱

يناير 30, 2014

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Georgetown University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مفتاح واحد لتحقيق النجاح في البيولوجيا دبقية هو الحفاظ على immunofunction دبقية فيفو السابقين خلال العزلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية وفقا لتقييم immunofunctional التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة ELISA التالية مع عديد السكاريد الشحمي المحفزات proinflammatory (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة CNS هو أداة قوية التحقيق تستخدم لدراسة البيولوجيا دبقية فيفو السابقين. تفاصيل هذا الأسلوب إجراء لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من القشور الفئران حديثي الولادة عن طريق الانفعالات الميكانيكية مع شاكر دوارة. هذه العزلة الخلايا الدبقية الصغيرة غلة طريقة الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية نقية للغاية التي تظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية يدل على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة في ظروف طبيعية nonpathological في الجسم الحي. كما يحفظ هذا الإجراء نمط ظاهري مناعي دبقية وظائف البيوكيميائية كما يتبين من استقراء التغيرات المورفولوجية، إزفاء النووية من الوحيدات P65 من NF كيلوبايت (P65)، وإفراز خلوى proinflammatory السمة المميزة، عامل نخر الورم-α (TNF-α )، بناء على عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام) التحديات. وبالتالي فإن إجراء العزل الحاضر يحافظ على نمط ظاهري مناعي من كلا هادئة وموارد الوراثية الحيوانيةالخلايا الدبقية الصغيرة vated، وتوفير المنهج التجريبي من التحقيق البيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في فيفو السابقين الظروف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا دبقية، الضامة مراقبة لحمة الجهاز العصبي المركزي، تشكل حوالي 12٪ من السكان الخلية الكلي للدماغ الثدييات الكبار. وتستمد الخلايا الدبقية الصغيرة من الكيس المحي النخاعي السلائف الخلايا وتختلف في كثافة الخلايا والتشكل في مناطق مختلفة داخل cytoarchitectural الكبار CNS 1-5. في البالغين الأصحاء الدماغ، الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا صغيرة، أو القطبية متشعبة مع العمليات الحيوية غرامة. وعلى النقيض من الطرفية التشكل بلعم، يبرهن على وجود الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة، النمط الظاهري الأضواء في أدمغة الصحية التي قد تظهر الخمول الخلوية، ولكن التظاهر في الدراسات المجراة أن عمليات التصوير دبقية تمديد حيوي وسحب لمراقبة المكروية بهم بطريقة تذكرنا " أخذ العينات والمسح "6،7.

الخلايا الدبقية الصغيرة هي غاية وبشكل مختلف تستجيب لتغيرات البيئية والفيزيولوجية المرضية في الدماغ، والتحولمن surveillant إلى الدول تعتبر يستريح وتنشيط عادة الدولة المستجيب، على التوالي. هذا التبديل في تنشيط يمكن بوساطة إشراك مستقبلات غشاء محدد والتعرف على نمط (خنازير)، مثل مستقبلات تول مثل (TLRs)، التي تستجيب لأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، وهي البروتينات الدهنية البكتيرية والفيروسية مشتقة والأحماض النووية، والكربوهيدرات 8-11. بالإضافة إلى PAMPs، وأيضا ثبت خنازير للحث على تفعيل دبقية ضد العقيمة، والجزيئات غير إمراضية المعروفة باسم أنماط الجزيئية الخطر / الضرر المصاحب (DAMPs)، والتي تمثل اضطراب في الجهاز العصبي المركزي التوازن، مثل تلف الخلايا 12-16. مرة واحدة تعمل، خنازير الشروع في داخل الخلايا مما يشير إلى أن النتائج في سلسلة تغييرات في التشكل دبقية الخلية والجينات التعبير، على وجه التحديد، الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط التكيف مع النمط الظاهري مثل أميبية، ونقل من P65 NF كيلوبايت الوحيدات (P65) إلى نواة الخلية، وupregulate و الم Ùكشن وإفراز السيتوكينات proinflammatory، مثل عامل نخر الورم-α (TNF-α)، انترلوكين 1 β (IL-1β)، جنبا إلى جنب مع أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 16-24. على الرغم من أن يتجزأ في الاستجابة المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي، كما تم العثور على هذه الجزيئات يفرز لزيادة الاكسدة العصبية، مما يحفز وتفاقم تنكس عصبي في الدول المريضة مثل الشلل الرعاش ومرض الزهايمر 25-29.

ومع ذلك، لا يفهم تماما آليات تفعيل دبقية في الحالات المرضية. لذلك، عزل الخلايا الدبقية الصغيرة هو أداة قوية التحقيق في هذه العمليات البيولوجية، والعديد من الميزات في الجسم الحي من تفعيل دبقية يمكن تلخيصها في الثقافة. العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك العزلة عن طريق التدرج Percoll التالية الهضم الأنزيمي من الأنسجة CNS 30،31. ومع ذلك، يمكن تغيير الهضم الأنزيميعلى نمط ظاهري مناعي للخلايا عن طريق الحد من سطح الخلية مستضد التعبير 32، والنتائج في انخفاض العائد خلية لكل حيوان من الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة. على وجه التحديد، ونحن التقرير متوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة في القشرة الجرو من 7.5 × 10 5 خلايا، في حين ذكرت سابقا أساليب بمعزل عن كامل الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدرج العائد Percoll 3-5 × 10 5 خلايا 30،33،34. تلتف الإجراء الحاضر استخدام إنزيمات الهضم من خلال عزل الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى خصائص المنخفض تمسكهم، وبالتالي الحفاظ على نمط ظاهري مناعي دبقية وظيفة.

في هذه الدراسة، ونحن تصف عزل خلايا دبقية من ثقافات مختلطة الدبقية مشتقة من حديثي الولادة متخالف CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -)، وC57BL / 6 قشرات الفئران عن طريق التحريض على شاكر الميكانيكية الدوارة، امتدادا من السابق طريقة نشر 24،35. نحن الاستفادة من سلالة الماوس السابق لتصور سهل من الخلايا الدبقية الصغيرة، وهذه الفئران التعبير عن GFP تحت سيطرة CX3CR1 موضع الذاتية - مروج الوحيدات محددة 36-38. وتنتج هذه الطريقة الثقافات دبقية نقية للغاية مع الحفاظ على نمط ظاهري مناعي فيفو السابقين كما يتضح من تغيرات شكلية، إزفاء النووية من P65، وإفراز TNF-α عندما تحدى مع عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) أو بام 3 CSK 4، TLR4 وTLR1 / 2 منبهات ، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قبل البدء في هذا البروتوكول، وجمع الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-3 (P1-3) في وعاء معقم متداخلة مع الفراش القفص الأصلي للحماية والدفء. من المهم أن تعمل بسرعة وكفاءة من خلال هذا البروتوكول لتحسين العائد دبقية. يرجى الاطلاع على الجدول 1 لائحة كاشف كاملة.

1. إعداد الصكوك والثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. تحضير 10 مل / الجرو الخلايا الدبقية الصغيرة وسائل الإعلام كاملة (MCM؛ 1X الحد الأدنى الضروري متوسط ​​ايرل [MEM] تستكمل مع: 1 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ V / V-D (+) الجلوكوز، 100 ميكروجرام / مل البنسلين / الستربتوميسين (P / S)، و 4٪ ت / ت مصل بقري جنيني (FBS)، و 6٪ ت / ت الحصان مصل)، وإضافة إلى كل T-75 قارورة (1 قارورة / الجرو)؛ كأب والمكان أفقيا إلى حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لكي تتوازن لمدة 1 ساعة. ومن الضروري أن تتوازن هذه الوسائط في قارورة (ق) قبل البدء في تشريح.
  2. استعداداتإعادة، قسامة، ودافئة في 37 ° C حمام الماء MCM للتشريح (6 مل / الجرو) وMCM في أنبوب مخروطي منفصل لخلية إعادة تعليق (2 مل / الجرو). إعداد وقسامة، والبرد على الجليد الثرم وسائل الإعلام (MM؛ تستكمل مع HBSS: 100 ميكروغرام / لتر P / S، M 0.01 HEPES؛ 3 مل / الجرو)، وتشريح وسائل الاعلام (DM؛ MEM تستكمل مع 100 ميكروغرام / لتر P / S؛ 2 مل / الجرو).
  3. تعقيم الأدوات الجراحية التالية الانغمار في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة: مقص # 1 (1؛ لقطع رأس)، forcep رقم 1 (2؛ لتأمين الأنف وإزالة القشور)، مقص # 2 (1؛ nonangled؛ لفتح فروة الرأس )، forcep رقم 2 (1؛ لإزالة فروة الرأس)، forcep التصنيف رقم 3 (1؛ لإزالة الجمجمة)، forcep رقم 4 (2؛ لإزالة السحايا)، مقص التصنيف رقم 3 (1؛ لتخطر على أنسجة المخ). السماح للهواء الجاف على وسادة العقيمة.
  4. مسح أسفل الأفقي، تدفق الهواء محطة وتشريح المجهر مع الايثانول 70٪.
  5. الاستغناء DM إلى 2 العقيمة، و 100 ملم أطباق بتري لالتقاط الرأس (3 مل، 1 طبق / 3 الجراء) وتشريح (1 مل؛1 صحن / الجرو؛ المبردة على الجليد قبل تشريح). الاستغناء MM إلى 1 معقمة، 100 مم طبق بتري لتنميق أنسجة المخ (1 مل، 1 طبق / الجرو).

2. الدماغ الأنسجة تشريح

  1. قبل القتل الرحيم، تطهير بلطف الرقبة والرأس من الجرو مع الايثانول 70٪ باستخدام الأنسجة المختبر. مع مقص # 1، الموت ببطء بسرعة الجرو عن طريق إزالة الرأس؛ القبض على الرأس في معدة مسبقا طبق بيتري. الموت ببطء واستكمال تشريح الجرو واحدة قبل الشروع في الحيوان المقبل.
  2. نقل الرأس إلى طبق تشريح المبردة؛ تحت المجهر تشريح تأمين رأسه معسر الأنف باستخدام forcep رقم 1 (بدلا من ذلك، يمكن تأمينها عن طريق ثقب الرأس ملقط من خلال محجر العين)؛ فروة الرأس المفتوحة باستخدام مقص رقم 2 عن طريق إنشاء Y قطع: تبدأ من قاعدة الرأس وعند زاوية نحو العينين. استخدام forcep # 3 لإزالة بلطف فروة الرأس عن طريق تقشير أفقيا، وفضح الجمجمة.
  3. باستخدام forcep # 3، وإزالة بلطف النسيج الضام في قاعدةالرأس. عندما يتعرض قاعدة الجمجمة الجمجمة، وفتح بعناية من قبل خيوط ذراع واحدة من forcep في ما بين الدماغ والجمجمة (بعد الشق بين نصفي المخ)؛ قبضة؛ برفق الجمجمة صعودا لتمزيق مفتوحة.
  4. تعطيل النسيج الضام تحت الجانب البطنية من الدماغ باستخدام forcep رقم 1، وبعد إزالة الدماغ باستخدام نفس الأداة. رفع الدماغ من الجمجمة باستخدام القوة التصاعدي تحت الجانب البطني من الدماغ.
  5. إبقاء المخ في موقفها التشريحية: الجانب الظهري متجهة لأعلى لتصور القشور تحت المجهر تشريح؛ تأمين الدماغ في المكان عن طريق إدراج نصائح من الملقط في تقاطع الدماغ المتوسط ​​والقشرة، وإزالة السحايا القشرية تماما مع forcep رقم 4، ثم الشروع في إزالة السحايا بطني. مرة واحدة وقد تم السحايا إزالتها تماما، فصل القشور عن بقية الدماغ باستخدام forcep رقم 4. ومن الضروري إزالة الأنسجة السحائي لتعظيم نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة وyielد.

3. نسيج الدماغ الثرم

  1. القشور نقل إلى معدة مسبقا تنميق الطبق، ومواصلة تنميق خطوة باستخدام تقنية معقمة في الدرجة الثانية السلامة البيولوجية مجلس الوزراء.
  2. اللحم المفروم أنسجة المخ باستخدام مقص # 3، ونقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي؛ شطف مقص وتنميق الطبق مع 1 مل من كل MM، وجمع والاستغناء يشطف في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على الأنسجة المفروم وهذه الخطوة شطف تعظيم العائد من الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق ضمان أن يتم نقل جميع الأنسجة المتبقية لأنبوب مخروطي. ترك التعليق الأنسجة دون عائق لمدة 1-2 دقيقة، مما يسمح الأنسجة المفروم ليغلق على مستوى الجزء السفلي من الأنبوب. لا تتجاوز 2 دقيقة كما MM لا يحتوي على العناصر الغذائية الأساسية.
  3. إزالة بعناية وتجاهل 2 مل من طاف مع عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية، والتأكد من عدم تعطيل استقر الأنسجة المفروم.
  4. إضافة 3 مل من MCM إلى الأنسجة المفروم؛ يسحن الأنسجة بكل قوة باستخدام عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية لا ملحوظ الأنسجة الصلبة ينبغي أن يظل عند سحن كاملة. إضافة 3 مل أخرى من MCM مع نفس ماصة، وجمع عينة المسحوقة المتبقية من غيض ماصة.

4. تزايد الخلايا القشرية

  1. الطرد المركزي الأنسجة المفروم لتكوير الخلايا (215 x ج؛ 5 دقائق؛ RT؛ الطرد المركزي السريرية مع يتأرجح دلو الدوار). العودة الخلايا مكعبات لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وإزالة وتجاهل طاف؛ resuspend بلطف بيليه الخلية (2 مل / أنبوب؛ MCM)؛ إضافة إعادة تعليق الخلية إلى معدة مسبقا T-75 قارورة؛ قبعة القارورة ووضعه أفقيا إلى ترطيب، ومعيار نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). تسمح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة.
  2. بعد 24 ساعة، اضغط برفق القارورة ضد كف اليد لتعطيلالحطام الأنسجة. تحقق الخلايا قبل وبعد التنصت لضمان إزالة كاملة من الحطام. مجموعة قارورة العمودي، وإزالة وتجاهل وسائل الإعلام، إضافة MCM جديدة إلى الجزء السفلي من القارورة (12 مل و 37 درجة مئوية)؛ قبعة ووضع مرة أخرى في الحاضنة، أفقيا.
  3. تحقق الخلايا اليومية للتلوث ورصد النمو.
  4. في حوالي 17-21 أيام في المختبر (DIV)، وخلايا دبقية تكون جاهزة للحصاد من ثقافة الدبقية مختلطة. لتحديد ما إذا الخلايا جاهزة، ودراسة الخلايا تحت المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة هي جاهزة للحصاد عندما في ~ 40٪ confluency. كما تظهر خلايا كروية صغيرة، ومشرق، وتزايد كما أحادي الطبقة على رأس الدبقية الأخرى.

5. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلطة من الدبقية الثقافة

  1. لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، اضغط بقوة ضد قارورة مقاعد البدلاء المختبر. هذا التحريض يساعد الخلايا الدبقية الصغيرة منفصلة من الخلايا الدبقية الأخرى ويرجع ذلك إلى خصائص منخفضة تمسك الخلايا الدبقية الصغيرة.
  2. ختم T-75 مباراة دولية قارورة مع parafilm وتدوير الثقافات الدبقية المختلطة (200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، 5 ساعة). باستخدام التحكم في درجة حرارته، شاكر دوارة nonhumidified لا تسمح للخلايا أن يهز لمدة أطول من 5 ساعة تفقد البصر. رفعت أن الخلايا الدبقية الصغيرة قبالة سطح القارورة بعد 5 ساعة، وذلك باستخدام المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة مشرقة، كروية، التعويم الحر الخلايا. وسوف يكون هناك طبقة من الخلايا النجمية المتبقية و oligodendrocytes التمسك السفلي من القارورة.
  3. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة طاف في أنبوب الطرد المركزي المخروطية العقيمة؛ بيليه الخلايا الدبقية الصغيرة (215 x ج؛ 5 دقائق؛ يتأرجح دلو الدوار).
  4. resuspend الكرية دبقية في الحارة دبقية متوسطة النمو (MGM؛ MEM تستكمل مع: 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ ت / vglucose، 1 ملم L-الجلوتامين، و 100 ميكروغرام / مل P / S، 5٪ ت / ت FBS؛ ~ 2 مل / قارورة)، تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات، وطبق 1 × 10 5 خلية / جيدا في شكل 24 لوحة جيدا علىالبلاستيك أو العقيمة زلات غطاء زجاجي (500 ميكرولتر / جيد؛ MGM). عن طريق هذا الإجراء ومتوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة هو 7.5 × 10 5 خلية / الجرو القشرة.
  5. 24 ساعة بعد الطلاء، وإزالة كافة وسائل الإعلام والخلايا refeed مع MGM الطازجة (37 درجة مئوية) لإزالة الخلايا العائمة والحطام. هذه الخطوة حاسمة لبقاء الخلايا والحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة. يمكن استخدام الخلايا لإجراء التجارب فورا بعد إعادة التغذية.

6. العلاجات سبيل المثال

  1. تعرض الخلايا إلى 10 نانوغرام / مل من بام 3 CSK 4 (بام)، و 10 نانوغرام / مل عديد السكاريد الشحمي (LPS) أو السيطرة على السيارة؛ احتضان لمدة 2 أو 24 ساعة في حاضنة ترطيب (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2).

7. تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة لوظائف خارج الحي عبر مناعي التصوير وكيمياء سيتولوجية مناعية

  1. بعد العلاج، وسائل الإعلام والثقافة الخلية الحصاد في أنابيب microfuge (1.5 مل) والمركifuge باستخدام ميكروسنتريفوج الطاولة (2 دقيقة؛ 900 x ج) لمسح وسائل الإعلام. نقل طاف لأنبوب microfuge النظيفة؛ مقايسة على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. تحليل تركيز TNF-α في خلية ثقافة طاف عبر المتاحة تجاريا الماوس α TNF ELISA عدة.
  2. غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وإصلاح الخلايا مع 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد / 4٪ (ث / ت) السكروز / PBS درجة الحموضة 7.4 (4٪ PFA؛ 15 دقيقة؛ RT). بعد التثبيت، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع طيف والهز على شاكر المداري.
    1. المناعي / كيمياء سيتولوجية مناعية. بعد التثبيت وPBS يغسل، عملية الخلايا الدبقية الصغيرة للكيمياء سيتولوجية مناعية. جميع الخطوات التي أجريت مع الهز لطيف. Permeabilize الخلايا في PBS/0.1٪ تريتون X-100؛ خلايا كتلة في PBS/10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعة واحدة. احتضان الخلايا O / N عند 4 درجة مئوية مع أرنب المضادة للNF كيلوبايت الأجسام المضادة (P65 الوحيدات؛ 1/1، 250) أو أرنب المضادة للإيبا-1 الأضداد (1/750) في عرقلة العازلة. مرئيإيزي مستضد: مجمع الأضداد التالية الحضانة مع الماعز مترافق fluorescently المضادة للأرنب مفتش الأضداد الثانوية (1 ساعة؛ 1/1، 000). إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم عن طريق الغسيل مع PBS/0.1٪ تريتون X-100 (3X 5 دقائق).
    2. خلايا مكافحة وصمة عار مع 4 '،6-Diamidino-2-Phenylindole / برنامج تلفزيوني (دابي؛ 0.1 ميكروغرام / مل). لتصور كل نواة الخلية المستمدة من الخلايا الدبقية الصغيرة CX3CR1-GFP + / - الفئران التعبير عن GFP. الاستفادة من الطول الموجي 350 نانومتر مرشح لتصور دابي؛ 488 نانومتر مرشح الطول الموجي لتصور GFP؛ و594 نانومتر الطول الموجي مرشح لتصور وP65-1 إيبا immunocomplexes.
  3. جبل غطاء ينزلق باستخدام محلول مائي التركيب وتصور الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المجهر الفلورسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإبقاء على نمط ظاهري مناعي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة فيفو السابقين خلال العزلة أمر بالغ الأهمية لتكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لتكون نموذجا للبيولوجيا دبقية التحقيق. من أجل إظهار المحافظة الناجح الخلايا الدبقية الصغيرة immunofunctionality باستخدام طريقة الحاضر، ونحن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من حديثي الولادة P3 (CX3CR1-GFP + / - وC57BL / 6) وتعامل مع الثقافات إما LPS أو بام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الإجراء الحالي وسيلة فعالة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من الفئران حديثي الولادة. هذا الإجراء له فائدة شقين من 1) الحفاظ على نمط ظاهري مناعي الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة، على النحو الذي يحدده التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وإليسا، و، 2) السماح الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أن تنضج في وجود خلايا الدبقية الأخرى (الخلايا النجمية وoligodentrocytes) قبل العزلة، التي قد تسهل مهمة التفاعلات خلية خلية أثناء فترة نضوج الثقافة الدبقية. الأهم من ذلك، أظهرت الخلايا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب الذي أجري البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر على أنه تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل معهد علوم الصحة البيئية R01ES014470 (KMZ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجلوكوزسيجماG8270اصنع محلول مخزون بنسبة 20٪ بماء MilliQ ؛ تعقيم المرشح ؛ تخزينه في درجة حرارة 4 درجات ؛ C; مدة الصلاحية: 3-6 أشهر. تستخدم لصنع MCM و MGM.
بيروفات الصوديوم 100 ملي مولار (100x)HycloneSH30239.01يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم لصنع MCM و MGM.
البنسلين / الستربتومايسين 10,000 وحدة / مل (100x)Gibco15140-122يخزن في -20 درجة مئوية. يستخدم لصنع MCM و MGM و MM و DM.
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081يخزن في -20 درجة مئوية يستخدم لصنع MCM و MGM.
مصل الأبقار الجنينية (محدد)HycloneSH30070.03تعقيم المرشح ؛ يخزن في -20 درجة مئوية. يستخدم لصنع MCM و MGM.
الحد الأدنى من إيرل المتوسط الأساسي (MEM)Cellgro15-010-CVبدون L-glutamine. يحتوي على أملاح إيرل. تستخدم لصنع MCM و MGM و DM.
مصل الحصانGibco16050تعقيم الفلتر ؛ يخزن في -20 درجة مئوية يستخدم لصنع MCM و MGM.
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)Cellgro21-021-CVبدون الكالسيوم والمغنيسيوم. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية تستخدم لصنع MM.
HEPES 1 MGibco15630-031يخزن في 4 درجات مئوية يستخدم لصنع MM.
T-75 قارورةكورنينج430641
4 '، 6-Diamidino-2-phenylindole ، dilactate (DAPI)InvitrogenD3571تستخدم لتلطيخ نواة الخلية.
أرنب مضاد ل Iba1واكو019-19741يستخدم عند تخفيف 1/750 لتلوين ICC ل Iba1. 
أرنب مكافحة NF & كابا. B (p65)Abcam7970يستخدم عند تخفيف 1 / 1،250 لتلوين ICC ل p65.
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)InvitrogenA11012يستخدم عند تخفيف 1 / 1,000 لتصور مركب المستضد: الأجسام المضادة في ICC.
القابل للتصرففيشر Scientific13-678-11E
50 مل أنبوب الطرد المركزي القابل للتصرففيشر Scientific05-539-8
15 مل أنبوب الطرد المركزي المتاحفيشر Scientific05-539-12
بتري معقم من البوليسترينفيشر 875713علمي 100 مم × 15 مم
مقص: مستقيم Metzembaum (مقص # 1)Roboz SurgicalRS-60101 ؛ 5 بوصة ؛ تستخدم لإزالة
مقص الرأس: Vannas
(مقص # 2)		العلوم الدقيقة15000-081 ؛ غير بزاوية ؛ حافة قطع 2.5 مم ؛ تستخدم لفتح مقص فروة الرأس
: Student Vannas (مقص # 3)أدوات العلوم الدقيقة91501-091 ؛ منحني ؛ تستخدم لفرم أنسجة المخ
ملقط: Dumont # 7
(ملقط # 1) أدوات		العلوم الدقيقة91197-002; تستخدم لتأمين الأنف وإزالة القشرية 
ملقط: Dumont # 2
(ملقط # 2) أدوات		العلومالدقيقة 11223-201 ؛ تستخدم لإزالة فروة الرأس
الملقط: Dumont # 3
(ملقط # 3) أدوات		العلومالدقيقة 11231-301 ؛ تستخدم لإزالة الجمجمة
ملقط: Dumont #5a
(ملقط # 4) أدوات		العلوم الدقيقة11253-211 ؛ تستخدم لإزالة السحايا
<قوي>جدول المعدات المحددة< / قوي>
تكبير مجهر تشريح ستيريو أوليمبوسSZ4060داخل خزانة التدفق الأفقي الأفقي
الصفحي خزانة التدفق الأفقيNuaireNU-201-330
خزانة السلامة البيولوجيةLabconco3440001الفئة الثانية
CO2< / sub> حاضنةVWR97025-836ضبط على 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO2< / sub>
دلاء التأرجح للخارج75006441 فيشر Scientificلاستخدامها مع الدوار المتأرجح للخارج
المتأرجحفيشر Scientific75006445أقصى نصف قطر: 19.2 (سم)
Sorvall Legend RT + جهاز طرد مركزي
(جهاز طرد مركزي سريري)		فيشر Scientific75-004-377مع دوار متأرجح
AccuSpin Micro 17 جهاز طرد مركزي دقيق
( جهاز طرد مركزي صغير منضدي)		فيشر ScientificS98645مع دوار ميكرولتر (24 × 1.5 / 2.0 مل ؛ القط #: 75003524)   
10 مل أنبوب الطرد المركزي المصلي طبق أدوات يتم وضع مجهر الدوار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39, 151-170 (1990).
  3. Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
  4. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
  5. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
  6. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
  7. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  8. Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
  9. Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
  10. Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
  11. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
  12. Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
  13. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  14. Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
  15. Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
  16. Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
  17. Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia. Glia. 7, 111-118 (1993).
  18. Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
  19. Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
  20. Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
  21. Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
  22. Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
  23. Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
  24. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
  25. Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
  26. Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson's disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
  27. Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
  28. Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
  29. Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
  30. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  31. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
  32. Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
  33. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
  34. Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
  35. Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
  36. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
  37. Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
  38. Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
  39. Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
  40. Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cortical Microglia IsolationMicroglia ImmunophenotypeMurine NeonatesMechanical AgitationMixed Glial CulturesImmunofluorescence MicroscopyELISAMeningeal Tissue RemovalRotary ShakerCell Culture Plates

مقالات ذات صلة