مقالة منهجية

طرق جمع الحليب لالفئران وريفز 'Muntjac الغزلان

20.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51007

⸱

يوليو 19, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Prion Research Center, Colorado State University

في هذه المقالة

ملخص

يسهل جمع الحليب من النماذج الحيوانية طرق البحث المختلفة: فهم المناعة السلبية ، وتحديد مسببات الأمراض المسؤولة عن الانتقال الرأسي ، ومن خلال استخدام الفئران المعدلة وراثيا ، حتى الإنتاج التجاري للبروتينات الموجودة في حليب الثدي البشري. نوضح هنا طريقة بسيطة لجمع الحليب في الفئران وغزلان ريفز مونتجاك.

الملخص

تستخدم النماذج الحيوانية بشكل شائع في جميع أنحاء مختبرات الأبحاث لتحقيق ما يمكن اعتباره عادة غير عملي في المضيف الأصلي لمسببات الأمراض. يتيح جمع الحليب من للعلماء الفرصة لدراسة العديد من جوانب التكاثر بما في ذلك الانتقال الرأسي والمناعة السلبية وبيولوجيا الغدد الثديية والرضاعة. يعد الحصول على كميات كافية من الحليب لهذه الدراسات مهمة صعبة ، خاصة من نماذج الصغيرة. نوضح هنا طريقة غير مكلفة وسهلة لجمع الحليب في الفئران وغزلان ريفز التي لا تتطلب معدات متخصصة أو تدريبا مكثفا. تتطلب هذه الطريقة بالذات باحثين: أحدهما لشفط الحليب وتثبيت ، والآخر لجمع الحليب في وعاء مناسب من نموذج Muntjac أو الفأر. يتطلب طراز الماوس أيضا استخدام ماصة P-200 وأطراف الماصة المقابلة. في حين أن هذه الطريقة منخفضة التكلفة وسهلة التنفيذ نسبيا ، يجب إبلاغ الباحثين بأن تخدير ضروري لجمع الحليب على النحو الأمثل.

المقدمة

النماذج الحيوانية توفير نظرة ثاقبة علم الأمراض التي لا يمكن الحصول عليها في المختبر عن طريق التحليل. لتوفير النتائج الأكثر فعالية، فمن المهم استخدام نموذج الحيوان الذي يرتبط ارتباطا وثيقا لهذا المرض وأنواع من الفائدة. على سبيل المثال، muntjac في ريفز '(Muntiacus reevesi)، والغزلان الصغيرة الآسيوية 1،2، والفئران المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين بريون cervid (CerTgPrP) 3 هي نماذج حيوانية مفيدة لأنواع cervid. كلا النوعين هي متعدد الودق، مما يسمح للتربية على مدار السنة، وبالتالي مصدر ثابت للأنسجة المرتبطة بالحمل والسوائل لدراسة آليات محددة في cervid علم الأحياء. دراسات من الحليب لديها مجموعة واسعة من التطبيقات التي هي ببساطة أكثر (وغير مكلفة) أنجزت في النماذج الحيوانية من في البشر. يمكن الباحثين التحقيق الحليب واللبأ بوصفها مصدرا محتملا لل1) انتقال الأمراض المعدية، 2) المناعية المنقولة من الأم إلى الأبناء في development الحصانة السلبي 4 و 3) اللاكتوفيرين، وهو البروتين الموجود في حليب الثدي البشري المشاركة في الحصانة السلبي أن الباحثين يحاولون حاليا لإنتاج تجاريا 5.

يمكن جمع كمية كبيرة من الحليب من الحيوانات الصغيرة أن يكون مهمة صعبة. اقترح روجرز نهجا لجمع الحليب من الفئران 6، والذي تم استخدامه في وقت لاحق في الفئران. DePeters وهوفي المقترحة طريقتين لجمع الحليب، واحد باستخدام فراغ إنشاؤها يدويا التي تنتجها لمبة المطاط تعلق على ماصة ماصة باستور، والثانية تتطلب بناء وحدة الحلب، والتي يتم بعد ذلك تعلق على مصدر فراغ (مثل كما صنبور) لحصاد الحليب الماوس 7. ونحن هنا نقترح لذلك، طريقة منخفضة التكلفة بسيطة لجمع الحليب من كلا الفئران وريفز 'muntjac الغزلان، الأمر الذي يتطلب معدات المختبرات فقط متاحة بسهولة والمهارات التقنية الأساسية. أسلوبنا ينتج كميات كافية من الحليب لمختلفالتطبيقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بروتوكول حلب ماوس

تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل IACUC.

1. الفصل بين السد من النسل

  1. حدد السد أن تحلب. اختيار السد مع القمامة من 4 أو أكثر من الجراء التي هي 8-12 أيام بعد الولادة لتوفير الحليب القصوى التحصيل على الرغم من جمع من الممكن في أي وقت آخر نقطة الولادة تصل إلى 21 يوما.
  2. فصل السد من القمامة لها على الأقل 2 ساعة قبل الحلب.
    ملاحظة: يجب أن رغبة واحدة لحلب السد أكثر من واحد في فترة زمنية معينة، كان مقبولا لإيواء السدود فصل في نفس القفص مع الغذاء الكافي والمياه.

2. إدارة الأوكسيتوسين، التخدير وشحم العين

  1. 2 إدارة وحدة دولية / كجم من الأوكسيتوسين الغشاء البريتونى (IP). الأوكسيتوسين هو الهرمون الذي يعمل على الغدد الثديية من الإناث المرضعات لتحفيز الافراج عن الحليب. الأوكسيتوسين يمكن الحصول على الابام طبيب بيطري.
  2. إدارة خليط مخدر تحتوي على 80-100 ملغ / كغ الكيتامين في تركيبة مع 5-10 ملغ / كغ زيلازين IP. على سبيل المثال، يمكن إعداد 10 مل الأسهم خليط مخدر مقدما على الفئران وزنها حوالي 30 غراما، وتشمل 0.1 مل زيلازين، 8.9 مل H 2 O، و 1.0 مل الكيتامين. سوف 0.25 مخدر مجموع مل رزين ماوس من هذا الحجم لحوالي 20-30 دقيقة، والتي ينبغي أن توفر الوقت الكافي لجمع الحليب.
    ملاحظات: لتحديد أن هذا الحيوان قد تم تخدير بنجاح، ووضع لها بلطف على بطنها على سطح صلب؛ وقالت انها لا ينبغي أن يتحرك قدميها أو محاولة للارتقاء إلى قدميها إذا كانت تخدير كامل. في حالة وجود الماوس لا يتم تخدير الكامل مع الجرعة الأصلي، قد الباحثة إدارة أخرى ¼ أو ½ من الجرعة الأصلية من خليط مخدر اعتمادا على حجم من الفأرة و / أو مستوى التخدير أن الفأر قد تحققت بالفعل . ومع ذلك، وهذا يمكن ليncrease فرصة رد فعل سلبي على التخدير، وأيضا قد يؤدي إلى تخدير الماوس يجري أكثر عمقا و / أو تخدير لفترة أطول من الزمن.
    ملاحظة: إذا حلب السد أكثر من واحد، فمن الضروري لارباك الأوكسيتوسين وحقن مخدر بسبب القصير نصف عمر الأوكسيتوسين والأوقات لتخدير الكيتامين وزيلازين.
  3. تنطبق على كمية صغيرة من الشحم العين إلى الركن من كل عين وتنتشر لمنع عيون الماوس، من الجفاف بينما تحت التخدير.

3. جمع الحليب

يتم تنفيذ معظم جمع الحليب بسهولة مع اثنين من الباحثين: الباحث واحد لعقد الماوس تخدير أثناء التعبير عن الحليب (المشار إليها باسم R1)، وأحد الباحثين لجمع الحليب (R2) يدويا. ويمكن أيضا أن هذا الأسلوب أن يؤديها مع شخص واحد، إذا تم تأمين الماوس على سطح مستو لتجنب الضرر.

  1. يجب أن تكون مجهزة R2 مع العقيمة منصات الإعدادية الكحول، والنقطة P-200عتمان، وهي غيض ماصة نظيفة لكل الماوس، وحاوية لعقد الحليب، مثل أنبوب 1.5 مل إيبندورف أو 1.2 مل cryovial (انظر جدول المواد).
  2. كما يبدأ الأوكسيتوسين نافذة المفعول، والحليب خيبة أمل تصبح مرئية في منطقة الثديية الماوس (انظر الشكل 1A). R1: بسط العقيمة وحة الإعدادية الكحول وبلطف مسح منطقة الثديية من الماوس لتنظيف المنطقة قبل الحلب. التعبير يدويا الحليب من حلمة باستخدام الإبهام والسبابة لتدليك بلطف والضغط على الأنسجة الثديية في حركة تصاعدية حتى يبدأ حبة مرئية من الحليب لتشكيل في قاعدة الحلمة.
  3. اضغط على المكبس pipetman P-200 لأول محطة لإطلاق سراح الهواء من طرف ماصة والاستعداد لتجميع الحليب.
  4. موقف الطرف ماصة في الجزء العلوي من قطرة من الحليب، وسحب بلطف الحليب في تلميح ماصة عن طريق الإفراج عن ببطء الضغط على المكبس. الحرص على عدم وضع غيض قريبة جدا من حلمة أو الجلد (انظرالشكل 1B). فإنه ليس من الضروري لاطلاق سراح تماما المكبس حيث سيؤدي ذلك إلى سحب الحليب على طول الطريق إلى الأعلى من غيض ماصة وسوف تجعل من الصعب طرد الحليب في كثير من الأحيان لزج في وعاء القابضة.
  5. طرد الحليب في وعاء باستخدام الإبهام للضغط على المكبس الماضي المحطة الأولى (انظر الشكل 1C). لتسهيل طرد كميات صغيرة، اضغط على تلميح ماصة ضد الجانب من الأنبوب بحيث لا يضيع السائل.
  6. الاستمرار في التعبير عن الحليب يدويا من كل حلمة، وتتحرك في اتجاه عقارب الساعة أو إما بعكس اتجاه عقارب الساعة حتى لا تخطي أي الحلمات. إلا أنه من غير المقبول والمفيد أن نعود إلى والتعبير عن الحليب باستمرار من نفس حلمة يجب أن تنتج المزيد من الحليب من الآخر.

4. عكس التخدير في السد

  1. في معظم الحالات، فإنه من الشائع للالسد للبدء في البدء أن تستيقظ أثناء عملية الحلب. إذا لم تكن هذه هي الحالة، وضع السد في CAGالبريد غير مباشرة تحت مصدر الحرارة، مثل بطانية تعميم ساخنة، حتى انها تبدأ في الاستيقاظ.
    ملاحظة: كما يبدأ السد أن يستيقظ، والحفاظ على مراقبة وثيقة من نشاطها حتى انها قادرة على المشي حول القفص لها على بلدها.
  2. مرة واحدة السد تتحرك حول القفص دون صراع، ووضع ظهرها الى بلدها الأصلي قفص مع القمامة لها. وقد لوحظ عدم وجود آثار سوء فيما يتعلق بقدرة الجراء 'لإطعام بعد جمع الحليب.

2. البروتوكول حلب Muntjac

تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل IACUC.

1. الفصل بين الفلاني من النسل

  1. حدد ظبية أن تحلب. الغزلان muntjac ريفز 'تعطي عموما ادة واحدة تزلف 2. الألبان وظبية اليوم بعد الولادة للسماح للتزلف فرصة للوصول إلى المواد الغذائية الأساسية في اللبأ 8.
    ملاحظة: عادة ما يخفي وتزلف لا تعود الى الظهور خلال بروكedure؛ فصل الزوج من الأم ذرية ليست ضرورية.

2. إدارة الأوكسيتوسين، التخدير وشحم العين

  1. إدارة 10 وحدة دولية / كجم من العضل أوكسيتوسين (IM). الأوكسيتوسين هو الهرمون الذي يعمل على الغدد الثديية من الإناث المرضعات لتحفيز أسفل السماح للحليب. الأوكسيتوسين يمكن الحصول عليها من طبيب بيطري.
  2. إدارة مخدر BAM IM تحتوي على 11 بوتورفانول 0.45 مغ / كغ، azaperone 0.25 مغ / كغ، medetomadine 0.07 ملغم / كغم. وجرعة واحدة من الخليط مخدر BAM رزين وmuntjac لحوالي 20-30 دقيقة، والتي توفر وقتا كافيا لجمع الحليب كاملة. خيار آخر هو لمخدر ميدازولام في 1-2 مغ / كغ، والتي سوف رزين وmuntjac لحوالي 10-15 دقيقة. في حين أن هذا يوفر الوقت الكافي لجمع الحليب، ويتم استقلاب هذا مخدر بسرعة أكثر من BAM والحيوان قد يحاول الهروب في نهاية فترة زمنية أقصر.
    ملاحظة: الحد الأدنى استجابة للألم، وردود الفعل طفيفة عند لمس الأذنين، تليها قدرة R1 لعقد MJ دون النضال يشير إلى أن الحيوانات قد تم تخدير بنجاح.
    ملاحظة: في حالة وجود muntjac لا يتم تخدير الكامل مع الجرعة الأصلي، قد الباحثة إدارة أخرى ¼ أو ½ من الجرعة الأصلية من خليط مخدر تبعا لحجم الحيوان و / أو مستوى التخدير التي كانت بالفعل تحققت. ومع ذلك، وهذا يمكن أن يزيد من فرصة حدوث رد فعل سلبي على التخدير، وأيضا قد يؤدي إلى muntjac كونها أكثر تخدير عميق و / أو تخدير لفترة أطول من الزمن.
  3. تنطبق على كمية صغيرة من الشحم إلى زاوية كل عين وانتشار لمنع عيون muntjac من الجفاف بينما تحت التخدير.

3. جمع الحليب

يتم تنفيذ معظم جمع الحليب بسهولة مع اثنين من الباحثين؛ باحث واحد لعقد muntjac تخدير فياللفة بينما معربا عن الحليب (يشار إلى R1)، والباحث الثاني للحفاظ على رأس muntjac في وضع مريح وآمن وجمع الحليب (R2) يدويا.

  1. تبعا للمخدر يستخدم، يجب أن يتم تنفيذ الحلب إما 1) في أقلامهم لتوفير مكان آمن لهم يجب أن تستيقظ أثناء إجراء (أو من صنع ميدازولام) 2) في حجرة الانتظار خالية من الفراش للحفاظ على نظافة (BAM- الناجم).
  2. يجب أن تكون مجهزة R1 و R2 بشاش غارقة الإيثانول وعدة أنابيب البولي بروبلين 15 مل المخروطية لعقد الحليب.
  3. كما يبدأ الأوكسيتوسين نافذة المفعول، والحليب خيبة أمل تصبح مرئية في منطقة الثدي وmuntjac ل. R1: تعقيم اليدين والأصابع القفاز، وكذلك الضرع كامل ولكل فرد من حلمة الحيوان مع الشاش غارقة في الايثانول. R2: عقد رأس muntjac في وضع آمن ومريح للسماح سهولة التنفس وتساعد على منع الكرش قلس. عقد البنود أنبوب جمع بيئة نظام التشغيل إلى حلمة يجري تحلب دون لمسها لمنع التلوث المحتملة.
  4. شفط الحليب من حلمة واحدة باستخدام الإبهام والسبابة للضغط بلطف الأنسجة الثديية في حركة تصاعدية حتى يتم محتقن حلمة مع الحليب، ولفة بلطف الحليب من حلمة والى الانبوب الذي R2 تحتجز (انظر الشكل 2 ).
  5. ملاحظة: الحليب يخرج في تيار، لذلك من المهم أن يكون لR2 أنبوب جمع وضعه بحيث قليل من دون حليب سوف يضيع.
  6. وينقسم الضرع وmuntjac حيز الأرباع. R1: الاستمرار في شفط الحليب من كل رباعي حتى الحليب لم يعد يتدفق بسهولة. إذا الحليب لا يمكن التعبير عنها من حلمة واحدة، والتعبير عن كل من الحلمات أخرى قبل أن تعود إلى الأول. إلا أنه من غير المقبول والمفيد أن نعود إلى والتعبير عن الحليب باستمرار من نفس حلمة يجب أن تنتج المزيد من الحليب من الآخر.

4. عكس التخدير في الفلاني

ر "> ومن الشائع لالناجم عن ميدازولام ظبية أن تبدأ في الاستيقاظ أثناء عملية الحلب، وفي معظم الحالات، سوف ظبية محاولة للهروب قبل وقد أعرب كل الحليب. يستخدم ضبط النفس الصغرى في محاولة لزيادة الحليب العائد، إلا أن سلامة وراحة كل من الباحثين وظبية لا تقل أهمية.

  1. إدارة atipamezole في 2.5 ملغ / ملغ medetomadine تحت الجلد لعكس السريع للBAM تخدير ظبية.
    ملاحظة: مع كلا النوعين من مخدر، فمن الضروري للحفاظ على مراقبة وثيقة من وزارة الطاقة حتى انها قادرة على السير بمفردها دون عثرة أو السقوط، وغير قادرة على تناول الطعام والشراب دون خوف من الطموح أو الاختناق. وقد لوحظ عدم وجود آثار سوء فيما يتعلق بقدرة تزلف لممرضة بعد جمع الحليب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

فأر

من تجاربنا، فقد قررنا أنه من الممكن لجمع ما يقرب من 100-400 ميكرولتر من الحليب من الماوس مختبر واحد، تعتمد على العديد من المتغيرات. وتشمل هذه المتغيرات 1) كمية من الوقت المخصص لجمع، 2) جرعة من الأوكسيتوسين تدار، 3) كم عدد الجراء السد حاليا التمريض و4) مقدار الوقت آخر الولادة. وقد أظهرت دراساتنا أن أعلى محصول تم الحصول عليها عندما يتم فصل السدود من ذريتهم لا يقل عن 2 ساعة، ويتم تعيين 45 دقيقة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فأر

هناك العديد من العوامل التي تأخذ بعين الاعتبار عند جمع الحليب من ماوس، بما في ذلك 1) كمية من الوقت المخصص لجمع، 2) جرعة من الأوكسيتوسين تدار، 3) كم عدد الجراء السد حاليا التمريض و4) مبلغ الفترة الزمنية التي مرت منذ الولادة في وقت جمع. استخدام الدراسات السابقة كمبادئ توجيهية، شرعنا في تحسين الظروف لإنتاج الحليب.

الأبحاث الساب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه التجارب من قبل #RAI093634A منحة المعاهد الوطنية للصحة. نعرب عن امتناننا البالغ لجيني باورز ، DVM ، دكتوراه ، لمساعدتها في الحلب السريع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المواد &# 8212 ؛
كيتامين الفأر (KetaVed 100 مجم / مل) (الجرعة: 80-100 مجم / كجم)MWI / Vedco011075
زيلازين (TranquiVed 100 مجم / مل) (الجرعة: 5-10 مجم / كجم) MWI/ VedcoNADA 139236
زيوت تشحيم العينMWI / Apexa701013
أوكسيتوسين (2 وحدة دولية / كجم)Vet One501013
Materials&# 8212; مونتجاك
ميدازولام (1-2 مجم / كجم)Amerisource Bergen Drug Corp924326اختياري: يمكن للباحث إما استخدام الميدازولام بمفرده أو تركيبة BAM كمخدر
لطرطرات بوتورفانول (توربوجيزيك) (0.45 مجم / كجم)فورت دودج لصحةNADA 135-780
طرطرات أزابيرون (0.25 مجم / كجم)ZooPharm
Medetomadine HCl (0.07 مجم / كجم)ZooPharm
أنتيبامزول هيدروكلوريد (أنتيسيدان) (الجرعة: 0.25 مجم / كجم)أوريون كوربوريشنNADA 141-033
أوكسيتوسين (10 وحدة دولية / كجم)Vet One501013
Equipment&# 8212; ماوس
P-200 PipetmanGilsonF123601
200 & ل نصائح الماصةمختبرات الضوءB-2004-SH
1 مل محاقنMWI005427
27 G إبرMWI002031
المعدات & # 8212 ؛ Muntjac
15 مل أنابيب مخروطيةVWR21008-918
22 جرام إبرMWI873
3 مل محاقن قفل لورMWI001377

المراجع

  1. Dueling, S. Muntiacus reevesi. Animal Diversity Web. , Available from: http://animaldiversity.ummz.umich.edu/accounts/Muntiacus_reevesi (2004).
  2. Pei, K., Taber, R., O'Gara, B., Wang, Y. Breeding cycle of the Formosan Reeves muntjac (Muntiacus reevesi micrurus) in northern Taiwan, Republic of China. Mammalia. 59 (2), 223-228 (1995).
  3. Browning, S. R. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J. Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  4. Van de perre, P. Transfer of antibody via mother's milk. Vaccine. 21 (24), 3374-3376 (2003).
  5. Maden, C. Genetically modified mice produce human milk protein. BioNews. , (2009).
  6. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
  7. Depeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  8. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: effects of litter size and lactation. 84 (1), 127-133 (1986).
  9. Hedrich, H. J., Bullock, G. R. The laboratory mouse. , 735-736 (2004).
  10. Nishimori, K., Young, L. J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T. R., Matzuk, M. M. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (21), 11699-11704 (1996).
  11. Miller, B. F., Osborn, D. A., Lance, W. R., Howze, M. M., Warren, R. J., Miller, K. V. Butorphanol-azaperone-medetomidine for immobilization of captive white-tailed deer. 45 (2), 457-467 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

P 200

مقالات ذات صلة