نقدم بولكرلميد هيدروجيل جديد يسمى هيدروكسي PAAm، التي تسمح ملزم مباشرة من البروتينات ECM مع الحد الأدنى من التكلفة أو الخبرة. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تسهل مراقبة مستقلة للعديد من العظة من المكروية الخلية الطبيعية لدراسة mechanostransduction الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
والآن راسخة بأن العديد من الوظائف الخلوية وينظم تفاعلات الخلايا مع العظة الفيزيائية والميكانيكية للمن المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة. الخلايا حقيقية النواة الشعور باستمرار المكروية المحلية من خلال mechanosensors السطح لتنبيغ التغيرات الجسدية من ECM إلى إشارات البيوكيميائية، ودمج هذه الإشارات إلى تحقيق تغييرات معينة في التعبير الجيني. ومن المثير للاهتمام، والبارامترات الفيزيائية والميكانيكية للزوجين يمكن ECM مع بعضها البعض لتنظيم مصير الخلية. ولذلك، فإن المفتاح لفهم mechanotransduction هو فصل المساهمة النسبية إشارات ECM على الوظائف الخلوية.
هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل بسرعة وبسهولة لتوليد الهلاميات المائية ذات الصلة بيولوجيا لضبط مستقل من العظة mechanotransduction في المختبر. نحن معدلة كيميائيا الهلاميات المائية بولي أكريلاميد (PAAm) إلى التغلب على جوهرها غير ADHES-إيف الخصائص من خلال دمج مونومرات الأكريلاميد، بين functionalized الهيدروكسيل خلال البلمرة. حصلنا على رواية PAAm هيدروجيل، ودعا هيدروكسي PAAm، الذي يسمح تجميد المرجوة من أي نوع من البروتينات ECM. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تتيح للسيطرة بشكل مستقل مورفولوجيا الخلايا واحدة، وصلابة مصفوفة، وطبيعة وكثافة البروتينات ECM. نحن نقدم طريقة بسيطة والسريع الذي يمكن أن يقام في كل مختبر علم الأحياء للدراسة في العمليات mechanotransduction خلية المختبر. نحن تحقق من صحة هذه الرواية منصة ثنائية الأبعاد عن طريق إجراء التجارب على الخلايا البطانية أن يبرهن على وجود اقتران الميكانيكية بين صلابة ECM والنواة.
المقدمة
العديد من المكروية الخلوية المحلية الجوانب (على سبيل المثال، وصلابة، حجم المسام، وطبيعة البروتينات، أو الكثافة خلية يجند) توفر الإحداثيات مجموعة من الإشارات التنظيمية التي تتحكم في العمليات الخلوية مثل الحركة، تكاثر الخلايا، التمايز، والتعبير الجيني. التعديلات من الخصائص الفيزيائية للبيئة خارج الخلية يمكن أن ينظر إليها من قبل الخلايا وتتسبب في عواقب فيزيولوجية مختلفة، بما في ذلك تشويه الاستقطاب الخلوي، والهجرة، والتمايز. يبقى من غير الواضح، مع ذلك، كيف خلايا تترجم إلى إشارات ECM التعديلات البيوكيميائية الخلوية. بالتالي من أهمية كبرى للمهندس رقابة في microenvironments المختبر التي يمكن أن تتكاثر التفاع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تفعيل سطح coverslips الزجاج
- coverslips مكان الزجاج الدائرية (25 مم) في طبق بتري والتشويه 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم حل عليه لمدة 5 دقائق (الدخان الكيميائية غطاء مستحسن).
- إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وتزج تماما coverslips مع DDH العقيمة 2 O لمدة 20 دقيقة في حين هزاز بلطف على طبق هزاز في غطاء الثقافة العقيمة.
- استنزاف العقيمة DDH 2 O وكرر الخطوة 1.2.
- إزالة لل coverslips....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويعرض الشكل 1A المشارك البلمرة الأكريلاميد (علاء) وbisacrylamide (مكرر AAM) مع N-hydroxyethylacrylamide (HEA) أحادية تحتوي على الهيدروكسيل الأساسي التي شكلتها بلمرة جذرية العشوائية شبكة ماء من بولي أكريلاميد مع مجموعات الهيدروكسيل جزءا لا يتجزأ من (هيدروكسي PAAm) . في هذا البروتوكول، يجب أن تضعف وزنها 65 ملغ من هيئة التعليم العالي في حجم 1 مل من HEPES. مع العلم أن كثافة HEA تساوي تقريبا واحد، ونحن نفترض أن نحصل على حجم العمل من 1،065 ميكرولتر (HEA + HEPES). على ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أجريت العديد من الملاحظات المختبر في بيولوجيا الخلايا الحديثة على coverslips الزجاج جامدة، وغالبا المغلفة بطبقة رقيقة من البروتينات ECM أو الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على تسلسل RGD. ومع ذلك، هذه ركائز الثقافة الأساسية لا ألخص تعقيد الفيزيائية كله من ECM وبالتالي لا تقدم نموذجا دقيقا لدراسة العمليات mechanotransduction الخلوية. لمعالجة هذه المشكلة، نقترح بديلا بسيطا لfunctionalize الهلاميات المائية ثنائية الأبعاد مع أي المبلغ المطلوب وطبيعة البروتينات ECM........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية البلجيكية للبحث العلمي (F.R.S.-FNRS) من خلال "الفحص المجهري متحد البؤر MIS" ومنح "Crédit aux Chercheurs" و "مشروع Nanomotility FRFC" (رقم 2.4622.11). يتم دعم زمالة الدكتوراه TG من قبل مؤسسة التدريب في البحوث الصناعية والزراعية (FRIA). يعترف المؤلفون بامتنان بسيلفان ديسبريز للتوصيف الميكانيكي وجيرالدين سيرشيلي للتصوير متحد البؤر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون المفاعل | منتجات الأشعة فوق البنفسجية | نموذج PR-100 | |
| لوحة هزاز | IKAcWerke | نموذج KS 130 نموذج الصناعات العلمية | |
| الأساسية | دوامة Genie2 | ||
| غرفة تفريغ الغاز الفراغ | هندسة الفراغ التطبيقية | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| ملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ مع طرف ناعم | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| ملقط أنسجة خلع | الملابس Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| أطباق بتري في البوليسترين | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| رقائق الألومنيوم ، سمك 0.5 > مم | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| مرشح غشاء Isopore (0.2 & micro; حجم المسام م) | Millipore | GTTP رمز | |
| غطاء زجاجي دائري (قطر 22 مم) | Neuvitro | GG-22 | |
| غطاء زجاجي دائري (قطر 25 مم) | Neuvitro | GG-25 | |
| ماصة دقيقة متغيرة الحجم | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للبروتين | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| مقابض مشرط | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| شفرات مشرط | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| قوارير ثقافة الخلايا (75 سم 2< / sup>) صينية | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| ، صلبة (الفولاذ المقاوم للصدأ) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Polydimethylsiloxane ؛ | داو كورنينج | سيلجارد 184 مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني | |
| أمونيوم بيركبريتات (APS) | سيجما ألدريتش | A3678 | |
| 3- (تريميتوكسي سيليل) بروبيل أكريليت | سيجما ألدريتش | 1805 | |
| فيبرونيكتين البلازما البشرية | ميليبور | FC010 | |
| لامينين من EHS | سيجما ألدريتش | L2020 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما ألدريتش | 221465-25 جم | |
| الماء المقطر المزدوج (ddH 2 < / sub >O) وسط | |||
| نمو الخلايا | البطانية تطبيقات | الخلايا 211K-500 | |
| الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) | مختبرات Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| محلول عازلة HEPES 1 M في H2< / sub>O | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| المضادات الحيوية ومضادات الفطريات | مختبرات PAA | P11-002 | |
| محلول ملحي عازل للفوسفات | مختبرات PAA | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 | مجسات جزيئية | A12379 | |
| جسم مضاد مضاد للفينكولين يتم إنتاجه في الفأر | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| الماعز المضاد للفأر مجسات جزيئية للأجسام المضادة-رباعي ميثيل رودامين | T-2762 | ||
| مضاد للفيبرونيكتين (أرنب) | سيجما ألدريتش | F3648 | |
| ستربتافيدين ؛ | سيجما ألدريتش | 41469 | |
| الأجسام المضادة المضادة لللامينين (أرنب) | سيجما ألدريتش | L9393 | |
| المضادة للأرانب IgG-FITC | سيجما-ألدريتش | F7512 | |
| محلول التربسين-EDTA | سيجما ألدريتش | T3924-100 مل | |
| الإيثانول المطلق | سيجما ألدريتش | 459844-2.5 لتر |
المراجع
- Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
- Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
