مقالة منهجية

إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

DOI:

10.3791/51010

⸱

أغسطس 28, 2014

 ,  , 
1Laboratoire Interfaces et Fluides Complexes, Université de Mons

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بولكرلميد هيدروجيل جديد يسمى هيدروكسي PAAm، التي تسمح ملزم مباشرة من البروتينات ECM مع الحد الأدنى من التكلفة أو الخبرة. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تسهل مراقبة مستقلة للعديد من العظة من المكروية الخلية الطبيعية لدراسة mechanostransduction الخلوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والآن راسخة بأن العديد من الوظائف الخلوية وينظم تفاعلات الخلايا مع العظة الفيزيائية والميكانيكية للمن المصفوفة خارج الخلية (ECM) البيئة. الخلايا حقيقية النواة الشعور باستمرار المكروية المحلية من خلال mechanosensors السطح لتنبيغ التغيرات الجسدية من ECM إلى إشارات البيوكيميائية، ودمج هذه الإشارات إلى تحقيق تغييرات معينة في التعبير الجيني. ومن المثير للاهتمام، والبارامترات الفيزيائية والميكانيكية للزوجين يمكن ECM مع بعضها البعض لتنظيم مصير الخلية. ولذلك، فإن المفتاح لفهم mechanotransduction هو فصل المساهمة النسبية إشارات ECM على الوظائف الخلوية.

هنا نقدم بروتوكول تجريبي مفصل بسرعة وبسهولة لتوليد الهلاميات المائية ذات الصلة بيولوجيا لضبط مستقل من العظة mechanotransduction في المختبر. نحن معدلة كيميائيا الهلاميات المائية بولي أكريلاميد (PAAm) إلى التغلب على جوهرها غير ADHES-إيف الخصائص من خلال دمج مونومرات الأكريلاميد، بين functionalized الهيدروكسيل خلال البلمرة. حصلنا على رواية PAAm هيدروجيل، ودعا هيدروكسي PAAm، الذي يسمح تجميد المرجوة من أي نوع من البروتينات ECM. مزيج من هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية مع microcontact الطباعة تتيح للسيطرة بشكل مستقل مورفولوجيا الخلايا واحدة، وصلابة مصفوفة، وطبيعة وكثافة البروتينات ECM. نحن نقدم طريقة بسيطة والسريع الذي يمكن أن يقام في كل مختبر علم الأحياء للدراسة في العمليات mechanotransduction خلية المختبر. نحن تحقق من صحة هذه الرواية منصة ثنائية الأبعاد عن طريق إجراء التجارب على الخلايا البطانية أن يبرهن على وجود اقتران الميكانيكية بين صلابة ECM والنواة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من المكروية الخلوية المحلية الجوانب (على سبيل المثال، وصلابة، حجم المسام، وطبيعة البروتينات، أو الكثافة خلية يجند) توفر الإحداثيات مجموعة من الإشارات التنظيمية التي تتحكم في العمليات الخلوية مثل الحركة، تكاثر الخلايا، التمايز، والتعبير الجيني. التعديلات من الخصائص الفيزيائية للبيئة خارج الخلية يمكن أن ينظر إليها من قبل الخلايا وتتسبب في عواقب فيزيولوجية مختلفة، بما في ذلك تشويه الاستقطاب الخلوي، والهجرة، والتمايز. يبقى من غير الواضح، مع ذلك، كيف خلايا تترجم إلى إشارات ECM التعديلات البيوكيميائية الخلوية. بالتالي من أهمية كبرى للمهندس رقابة في microenvironments المختبر التي يمكن أن تتكاثر التفاعلات بين الخلايا والمكروية من أجل دراسة مسارات mechanotransduction هو عليه. لمعالجة هذه المشكلة، أدخلنا مؤخرا طريقة رواية 1، ودعا الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي، لتوليد بسهولة يومين الدايممصفوفات nsional الناعمة التي تسمح للسيطرة بشكل مستقل العظة mechanotransduction مهمة: مصفوفة الصلابة، هندسة الخلايا والحبس، طبيعة البروتين وكثافة خلية يجند.

ECM يوجه العمليات الخلوية عبر التدرجات في morphogens (الكيميائي)، والبروتينات لاصقة (haptotaxis)، وتصلب (durotaxis). على مدى العقود القليلة الماضية، تقدما في منصات المختبر وضعت لعزل هذه الاشارات خارج الخلية من أجل استخلاص خلايا كيف هي قادرة على ترجمة ميزات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية في العمليات الفسيولوجية 2-5. وقد وضعت الإلكترون شعاع 6، 7 ضوئيه، تجميد الضوئي 8، أو بمساعدة تقنيات البلازما 9 لتوجيه نمو الخلايا الحية على ركائز micropatterned. على الرغم من أن هذه التقنيات قد أسفرت عن نتائج مهمة، ومعظمهم لا تسمح بالتمييز بين النفوذ الفردي للمنبهات مختلفة على سلوك الخليةوأنها تتطلب مرافق تقنية المختبرات القليلة التي لا تستطيع تحمله. ومن بين هذه التقنيات، microcontact الطباعة (μCP)، برزت كوسيلة قوية والوصول إلى إنشاء خلية لاصقة الصغيرة الجزر 10. وفي الآونة الأخيرة، بذلت جهود واسعة 11-14 لتطوير μCP على الهلاميات المائية مع الجمود الانضباطي من أجل إنتاج مجموعة واسعة من الجمود الملحوظ في الأنسجة الحية. ومن بين هذه الأعمال، أصبح بولي أكريلاميد (PAAm) شعبية 15 و هو بالفعل واحدة من المصفوفات البوليمر المستندة الأكثر استخداما لالميكانيكا الحيوية الخلية المقايسات.

وبين functionalized السطوح PAAm عادة مع heterobifunctional عبر رابط ترتبط N-sulfosuccinimidyl-6- [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (سلفو-SANPAH) والبروتينات ECM إلى السطح عن طريق تفعيل الأشعة فوق البنفسجية من nitrophenyl سلفو-SANPAH مجموعات أزيد 16. يتكون أسلوب آخر في اقتران الهيدرازين للبروتينات التي تتأكسد بشدةمع بريودات 17. قدم Hynd وزملاء العمل للتقنية الزخرفة الأسطح هيدروجيل بيوميمتيك مع البروتينات والببتيدات التي تتطلب في بلمرة ضوئية المنشأ جود مونومر-acroyl streptavidin 18. وفي الآونة الأخيرة، تسنغ آخرون. وأفادت طريقة جديدة micropatterning 19 على أساس التعرض للأشعة فوق البنفسجية العميقة من PAAm من خلال قناع الكوارتز البصرية التي تتطلب لاحتضان المواد الهلامية PA تفعيلها مع 1 إيثيل-3- [3 dimethylaminopropyl] carbodiimide هيدروكلوريد (EDC) وN-hydroxysuccinimide (NHS) قبل حلول المياه لإضافة البروتين. على الرغم من قدرة هذه التقنيات لخلق متجانسة وقابلة للتكرار البروتينات micropatterns، معظمهم يعانون القيود الرئيسية: عمليات التوليف طويلة (مثل غسيل الكلى، تجفيد، الخ)، ومركبات كيميائية باهظة الثمن (مثل حمض الهيالورونيك، سلفو-SANPAH) أو الأشعة فوق البنفسجية العميقة التشعيع. بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات لا تسمح التشكيل مستقلة عن صلابة الركيزة، micropatternهندسة، ECM طبيعة البروتين، وكثافة الخلايا يجند.

أخذ هذه القيود في الاعتبار، قمنا بتطوير نهج قائم على مادة الأكريلاميد الرواية وبسيط يسمح تجميد مجموعة متنوعة من البروتينات والجزيئات الحيوية على الهلاميات المائية لينة ويسمح ضبط مستقلة عن العظة mechanotransduction من أجل فك دورها على الوظائف الخلوية. بدلا من التعامل مع الهلاميات المائية PAAm المركبات الكيميائية القاسية، ونحن نقدم مونومر الأكريلاميد التجاري مع مجموعات الهيدروكسيل PAAm خلال البلمرة. هذه العملية بسيطة تتغلب على الملكية المضادة لللاصقة الجوهرية للالهلاميات المائية PAAm دون أي شروط فنية أخرى.

وجود مجموعات الهيدروكسيل يؤدي إلى تقارب عالية من الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي عن البروتينات والجزيئات الحيوية التي تشكل التفاعلات الهيدروجين الترابط. في تركيبة مع μCP، الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي تمكن جيل السريع للثقافة منصة ثنائية الأبعاد مع مراقبة مستقلةعلى صلابة مصفوفة، نوع من البروتينات ECM، الكثافة خلية يجند والإلتصاق المحصورة، والتي تصور أن يكون منصة قوية لدراسة mechanotransduction.

والغرض من هذا البروتوكول هو توفير المعلومات اللازمة لاتخاذ بسهولة الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي دون أي خبرة في العلوم المادية. الهدف النهائي هو توفير وسيلة للباحثين لطرح الأسئلة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في مستويات الخلايا والأنسجة التي قد تؤدي إلى فهم أفضل لمسارات mechanotransduction تشارك في آليات المرضية في جسم المريض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تفعيل سطح coverslips الزجاج

  1. coverslips مكان الزجاج الدائرية (25 مم) في طبق بتري والتشويه 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم حل عليه لمدة 5 دقائق (الدخان الكيميائية غطاء مستحسن).
  2. إزالة محلول هيدروكسيد الصوديوم وتزج تماما coverslips مع DDH العقيمة 2 O لمدة 20 دقيقة في حين هزاز بلطف على طبق هزاز في غطاء الثقافة العقيمة.
  3. استنزاف العقيمة DDH 2 O وكرر الخطوة 1.2.
  4. إزالة لل coverslips مع ملاقط معقمة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى.
  5. coverslips الجافة في ظل تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين.
  6. في غطاء الثقافة العقيمة، تشويه طبقة رقيقة من 3- (trimethoxysilyl) بروبيل أكريليت (92٪) على الجانب تنشيط ساترة لمدة 1 ساعة.
  7. غسل coverslips الزجاج على نطاق واسع مع 3 يغسل من DDH العقيمة 2 O وتزج بهم في DDH العقيمة 2 O في طبق بتري جديد.
  8. الاستفادة من طبق بتريمع parafilm ووضعه على لوحة الروك تحت الإثارة لطيف لمدة 10 دقيقة.
  9. إزالة لل coverslips من DDH 2 O مع ملاقط معقمة مع نصائح الجميلة ووضعها في طبق بيتري جديدة مع تنشيط الوجه لأعلى.
  10. تخزين في RT في مكان جاف مع رقائق الألومنيوم لتجنب الغبار من الالتصاق لل coverslips.

2. إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. إعداد والوزن من 65 ملغ من مادة الأكريلاميد N-هيدروكسي إيثيل (HEA) في 1.5 مل إيبندورف أنبوب. من المهم إعداد حل HEA الطازجة.
  2. إضافة 1 مل من 50 ملي HEPES عازلة لHEA وتخلط باستخدام vortexer حتى HEA حل كامل.
  3. إضافة 400 ميكرولتر من 40٪ ث / ث في HEPES حل الأكريلاميد وحجم المطلوب من 2٪ ث / ث في HEPES مكرر الأكريلاميد حل (انظر الجدول 1) للوصول إلى تصلب هيدروجيل المطلوب. ضبط مع 50 ملي HEPES إلى الحجم النهائي من 5 مل.
  4. مزيج الحل باستخدام vortexer وديغا ذلكفي فراغ الغرفة لمدة 20 دقيقة من أجل الحد من تركيز الأكسجين في الحل، والذي يمنع هيدروكسي PAAm البلمرة.
  5. تحت غطاء العقيمة، تصفية حل degased مع 0.2 ميكرومتر حجم المسام مرشح من أجل تعقيمها.
  6. تفعيل coverslips الزجاج الدائرية (22 مم) في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون خلال 7 دقائق.
  7. إعداد 100 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS) حل، وهذا هو APS 10 ملغ في 100 ميكرولتر DDH 2 O. من المهم إعداد حل APS الطازجة.
  8. إضافة 2.5 ميكرولتر من رباعي ميثيلين ثنائي الأمين (TEMED) و 25 ميكرولتر من الحل APS إلى تعقيم هيدروكسي PAAm الحل (الخطوة 2.5) لبدء البلمرة. مزيج الحل بواسطة 3 pipettings التوالي دون إدخال فقاعات، تحت ظروف معقمة.
  9. تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 25 ميكرولتر من الحل هيدروكسي PAAm على 25 مم ساترة (متوفر من الخطوة 1.9) وعلى الفور وضع 22 ملم GLالحمار ساترة (أعدت في الخطوة 2.5) على رأس الحبرية للضغط الحل هيدروكسي PAAm. توسيط زجاج 22 مم ساترة مع ملاقط معقمة وتذليل أي فقاعات.
  10. تسمح الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي إلى تتبلمر في RT لمدة 15 دقيقة. عكس يدويا المتبقية حل هيدروكسي PAAm في أنبوب إيبندورف لمتابعة استكمال عملية البلمرة.
  11. تزج تماما coverslips مع العقيمة DDH 2 O وفصل بعناية coverslips 22 ملم الزجاج عن طريق إدخال حافة شفرة حلاقة بين coverslips 22 ملم الزجاج وطبقة هيدروجيل هيدروكسي PAAm.
  12. غسل الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مع برنامج تلفزيوني العقيمة (3 تبادل PBS) والسماح المواد الهلامية مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني العقيمة للحفاظ على الماء.
  13. تخزين الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي في برنامج تلفزيوني العقيمة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.

3. Polydimethylsiloxane (PDMS) Microstamp تلفيق

ملاحظة: تلفيق الماجستير السيليكون مطلوب قبل ستاRT في تلفيق PDMS microstamp. ويمكن أن يتم هذا التصنيع الدقيق للسيد السيليكون بواسطة تقنيات الطباعة الحجرية، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة والتدريب. ويتم تشجيع التعاون مع مرفق nanofabrication الى افتعال سيد السيليكون. بدلا من ذلك، اتصل على الشركة التي بتصنيع السيليكون microstructured سادة مصنوعة خصيصا حسب الطلب. من المهم أن نلاحظ أن تلفيق سيد السيليكون يحتاج فقط إلى أن يتم مرة واحدة. في الواقع، وسادة السيليكون microstructured يمكن استخدامها لأجل غير مسمى لإنتاج الطوابع المرنة.

  1. مزيج PDMS وكيل المعالجة في 10: 1 نسبة في كوب من البلاستيك وتخلط جيدا باستخدام ماصة لمدة 10 دقيقة.
  2. ديغا الخليط PDMS تحت فراغ لإزالة فقاعات الهواء التي تشكلت خلال الخطوة 3.1.
  3. وضع سيد السيليكون microstructured في طبق بتري ويلقي طبقة سميكة 10 ملم من نزع الغاز PDMS الخليط على ذلك دون تشكيل فقاعات.
  4. اسمحوا علاج PDMS لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية فيالفرن.
  5. في بيئة خالية من الغبار، وطبقة PDMS-تقشر والمكوس 1 سم 2 microstamps مع مشرط.
  6. باستخدام ملقط، ومكان PDMS microstamps نمط المتابعة في طبق بيتري.

4. Micropatterning هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. مكان PDMS microstamps في الإيثانول / الماء (50/50) الحل ويصوتن لمدة 15 دقيقة.
  2. تجفيف الطوابع مع تدفق تيار من النيتروجين ووضعها نمط المتابعة في نظافة الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون (λ <200 نانومتر) لمدة 7 دقائق.
  3. تحت غطاء العقيمة، ضع قطرة 150 ميكرولتر من الحل المنشود البروتين (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل laminin في برنامج تلفزيوني أو 25 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في PBS) على سطح microstructured من 1 سم 2 PDMS الطوابع.
  4. اختياري: تعديل تركيز المحلول البروتين لتعديل كثافة خلية يجند.
  5. نشر حل البروتين على سطح ختم بنقلها مع طرف العقيمة ماصة تجاه كل ركن منالطابع.
  6. ترك الحل البروتين على كثف على الطوابع PDMS لمدة 60 دقيقة تحت غطاء العقيمة. إيقاف تشغيل المصابيح لتجنب الضرر البروتين.
  7. تحت غطاء العقيمة، ونقل هيدروكسي PAAm coverslips المغلفة (متاح من الخطوة 2.13) في طبق بتري.
  8. إزالة PBS الزائدة من سطح ركائز هيدروكسي PAAm مع تيار النيتروجين المنخفض تحت ظروف معقمة. وقف الإجراءات في أقرب وقت لوحظ أي دليل على المياه الراكدة على سطح هلام. لا ينبغي أن تجفف هلام تماما في هذه المرحلة.
  9. الجافة بعناية سطح منظم من PDMS ختم مع تدفق مستمر من عالية النقاء غاز النيتروجين.
  10. فهم الطابع المغلفة البروتين مع خلع الملابس ملقط الأنسجة ووضع سطح منظم في اتصال مع سطح هيدروجيل المجففة. تطبيق نقاط الضغط وجيزة مع غيض من ملاقط على رأس الطابع PDMS لضمان اتصال جيد بين microfeatures الطوابع وسطح هيدروجيل.
  11. ترك الطابع PDMS على الالبريد سطح مائي لمدة 1 ساعة على RT.
  12. بلطف إزالة PDMS الطوابع من الهلاميات المائية هيدروكسي PAAm خلع الملابس مع ملقط الأنسجة واتبع الخطوة 4.1 لتنظيف الطوابع.
  13. غسل نطاق واسع في الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي مختومة من 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف.
  14. اختياري: micropatterns إضافية من البروتينات ECM أخرى يمكن أن تضاف إلى هيدروكسي PAAm سطح باتباع الخطوات 4،5-4،11.
  15. إيقاف فاعلية مناطق غير مطبوعة مع محلول معقم من BSA بمعدل 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني خلال ليلة واحدة في 4 درجات مئوية تحت الإثارة لطيف على طبق هزاز.
  16. غسل نطاق واسع بنسبة 3 تبادل PBS (درجة الحموضة = 7.4) في ظروف معقمة لمدة 10 دقيقة في الصرف. في هذه المرحلة، وختمها الهلاميات المائية-PAAm هيدروكسي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تصل إلى أسبوع واحد.

5. ترسب الخلايا على Micropatterned هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية

  1. احتضان coverslips الخلية في وسائل الإعلام لمدة 30-45 دقيقة قبل الطلاء جملتعلمي.
  2. غسل الخلايا الملتصقة مثقف في 75 سم 2 قارورة الثقافة مع برنامج تلفزيوني العقيمة عند 37 درجة مئوية وسلخه مع 3 مل من التربسين-EDTA أو accutase لمدة 10 دقيقة.
  3. تحويل المبلغ المطلوب من قبل تحسنت كاملة النمو المتوسطة مناسبا لخط الخلوي في قارورة تحتوي على خلايا منفصلة وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في ز × 650.
  4. إزالة طاف مع micropipette وresuspend الخلايا في كامل مستنبت في 15-20،000 خلية / مل.
  5. إضافة 4 مل من محلول الخلية إلى ساترة micropatterned (تم الحصول عليها من الخطوة 5.1) ووضع ساترة المغطاة خلية في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية والرطوبة 5٪ لمدة 1-2 ساعة.
  6. نضح بلطف الخلايا غير مرتبط واستبدال الثقافة المتوسطة. العودة الخلايا تعلق على الحاضنة والسماح لهم انتشرت بالكامل (3-6 ساعة، اعتمادا على نوع من الخلايا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض الشكل 1A المشارك البلمرة الأكريلاميد (علاء) وbisacrylamide (مكرر AAM) مع N-hydroxyethylacrylamide (HEA) أحادية تحتوي على الهيدروكسيل الأساسي التي شكلتها بلمرة جذرية العشوائية شبكة ماء من بولي أكريلاميد مع مجموعات الهيدروكسيل جزءا لا يتجزأ من (هيدروكسي PAAm) . في هذا البروتوكول، يجب أن تضعف وزنها 65 ملغ من هيئة التعليم العالي في حجم 1 مل من HEPES. مع العلم أن كثافة HEA تساوي تقريبا واحد، ونحن نفترض أن نحصل على حجم العمل من 1،065 ميكرولتر (HEA + HEPES). على ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت العديد من الملاحظات المختبر في بيولوجيا الخلايا الحديثة على coverslips الزجاج جامدة، وغالبا المغلفة بطبقة رقيقة من البروتينات ECM أو الببتيدات الاصطناعية التي تحتوي على تسلسل RGD. ومع ذلك، هذه ركائز الثقافة الأساسية لا ألخص تعقيد الفيزيائية كله من ECM وبالتالي لا تقدم نموذجا دقيقا لدراسة العمليات mechanotransduction الخلوية. لمعالجة هذه المشكلة، نقترح بديلا بسيطا لfunctionalize الهلاميات المائية ثنائية الأبعاد مع أي المبلغ المطلوب وطبيعة البروتينات ECM....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية البلجيكية للبحث العلمي (F.R.S.-FNRS) من خلال "الفحص المجهري متحد البؤر MIS" ومنح "Crédit aux Chercheurs" و "مشروع Nanomotility FRFC" (رقم 2.4622.11). يتم دعم زمالة الدكتوراه TG من قبل مؤسسة التدريب في البحوث الصناعية والزراعية (FRIA). يعترف المؤلفون بامتنان بسيلفان ديسبريز للتوصيف الميكانيكي وجيرالدين سيرشيلي للتصوير متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأشعة فوق البنفسجية / الأوزون المفاعلمنتجات الأشعة فوق البنفسجيةنموذج PR-100
لوحة هزازIKAcWerkeنموذج KS 130 نموذج الصناعات العلمية
الأساسيةدوامة Genie2
غرفة تفريغ الغاز الفراغهندسة الفراغ التطبيقيةDP- 8-KIT
ParafilmSigma-AldrichP7793-1EA
ملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ مع طرف ناعمSigma-AldrichZ225304-1EA
ملقط أنسجة خلعالملابس Sigma-AldrichF4392-1EA
أطباق بتري في البوليسترينSigma-AldrichP5731-500EA
رقائق الألومنيوم ، سمك 0.5 > ممSigma-Aldrich266574-3.4G
مرشح غشاء Isopore (0.2 & micro; حجم المسام م)MilliporeGTTP رمز
غطاء زجاجي دائري (قطر 22 مم)NeuvitroGG-22
غطاء زجاجي دائري (قطر 25 مم)NeuvitroGG-25
ماصة دقيقة متغيرة الحجمSigma-AldrichZ114820
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة للبروتينSigma-AldrichZ666505-100EA
مقابض مشرطSigma-AldrichS2896-1EA
شفرات مشرطSigma-AldrichS2771-100EA
قوارير ثقافة الخلايا (75 سم 2< / sup>) صينيةSigma-AldrichCLS430641
، صلبة (الفولاذ المقاوم للصدأ)Sigma-AldrichZ613983-1EA
Polydimethylsiloxane   ؛داو كورنينجسيلجارد 184 مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني
أمونيوم بيركبريتات (APS)سيجما ألدريتشA3678
3- (تريميتوكسي سيليل) بروبيل أكريليتسيجما ألدريتش1805
فيبرونيكتين البلازما البشريةميليبورFC010
لامينين من EHSسيجما ألدريتشL2020
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش221465-25 جم
الماء المقطر المزدوج (ddH 2 < / sub >O) وسط
نمو الخلاياالبطانية تطبيقاتالخلايا 211K-500
الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVEC)مختبرات InvitrogenC-003-5C
AccutasePAAL11-007
محلول عازلة HEPES 1 M في H2< / sub>OSigma-Aldrich83264-500ML-F
المضادات الحيوية ومضادات الفطرياتمختبرات PAAP11-002
محلول ملحي عازل للفوسفاتمختبرات PAAH15-002
Alexa Fluor 488مجسات جزيئيةA12379
جسم مضاد مضاد للفينكولين يتم إنتاجه في الفأرSigma-AldrichV9131
الماعز المضاد للفأر مجسات جزيئية للأجسام المضادة-رباعي ميثيل رودامينT-2762
مضاد للفيبرونيكتين (أرنب)سيجما ألدريتشF3648
ستربتافيدين   ؛سيجما ألدريتش41469
الأجسام المضادة المضادة لللامينين (أرنب)سيجما ألدريتشL9393
المضادة للأرانب IgG-FITCسيجما-ألدريتشF7512
محلول التربسين-EDTAسيجما ألدريتشT3924-100 مل
الإيثانول المطلقسيجما ألدريتش459844-2.5 لتر
الضوئي الفلتر حمام بالموجات فوق الصوتية أكريلاميد (مسحوق) سيجما ألدريتش A3553 N ، N'-Methylenebis (أكريلاميد) سيجما ألدريتش 146072 N-هيدروكسي إيثيل أكريلاميد سيجما ألدريتش 697931 N ، N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE SIGMA-Aldrich T9281 للفالويد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues. Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).
  2. Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking. Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).
  3. Atmanli, A., Domian, I. J. Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing. J. Vis. Exp. (73), e50288(2013).
  4. Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays. Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).
  5. Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes. Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).
  6. Rundqvist, J., et al. High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation. J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).
  7. Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications. Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).
  8. Holden, M. A., Cremer, P. S. Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces. J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).
  9. Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture. Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).
  10. Kumar, A., Whitesides, G. M. Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching. Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).
  11. Tseng, Q., et al. New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).
  12. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve. PLoS ONE. 7, e51499(2012).
  13. Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).
  14. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli. Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).
  15. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  16. Hemphill, M. A., et al. A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury. PLoS ONE. 6 (7), e22899(2011).
  17. Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays. BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
  18. Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces. Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).
  19. Tseng, Q., et al. new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells. Nat. Commun. 3, 671(2012).
  21. Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus. Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).
  22. Trappman, B., Chen, C. S. How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective. Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hydroxy PAAm HydrogelsMechanotransduction CuesPolyacrylamide HydrogelsMicrocontact PrintingECM Protein ImmobilizationCell Morphology ControlMatrix Stiffness TuningFluorescence MicroscopyEndothelial Cell AnalysisMechanical Coupling

مقالات ذات صلة