مقالة منهجية

فحص علم الوراثة الأمامي بوساطة VIGS لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف

DOI:

10.3791/51033

⸱

أغسطس 23, 2013

 ,  , 
1Plant Biology Division, The Samuel Roberts Noble Foundation

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد إسكات الجينات الناجم عن الفيروس أداة مفيدة لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة النباتات غير المضيفة. نوضح استخدام مسببات الأمراض البكتيرية التي تعبر عن GFPuv في تحديد النباتات الصامتة الجينية المعرضة لمسببات الأمراض غير المضيفة. هذا النهج سهل وسريع ويسهل الفحص على نطاق واسع ويمكن تطبيق بروتوكول مماثل لدراسة مختلف التفاعلات الأخرى بين النبات والميكروبات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التحكم في مقاومة الأمراض غير المضيفة للنباتات ضد مسببات الأمراض البكتيرية من خلال مسارات دفاعية معقدة. يعد فهم هذه الآلية أمرا مهما لتطوير نباتات متينة مقاومة للأمراض ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض. يعد فحص علم الوراثة الأمامي المستند إلى إسكات الجينات الناجم عن الفيروس (VIGS) نهجا مفيدا لتحديد جينات الدفاع عن النبات التي تنقل مقاومة غير المضيفة. ويعد ناقل VIGS القائم على فيروس خشخش التبغ (TRV) أكثر ناقلات VIGS كفاءة حتى الآن وقد استخدم بكفاءة لإسكات الجينات المستهدفة الذاتية في Nicotiana benthamiana.

في هذه المخطوطة ، نوضح نهجا لفحص علم الوراثة الأمامي لإسكات المستنسخة الفردية من مكتبة (كدنا) في N. benthamiana وتقييم استجابة النباتات الصامتة الجينات لمقاومة غير المضيف المعرضة للخطر ضد مسببات الأمراض غير المضيفة ، Pseudomonas syringae pv. طماطم T1, P. syringae الكهروضوئية. Glycinea و X. campestris pv. المثانة. تم تصميم مسببات الأمراض البكتيرية هذه للتعبير عن بروتين GFPuv ويمكن رؤية مستعمراتها الفلورية الخضراء بالعين المجردة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في النباتات الملقحة لمسببات الأمراض غير المضيفة إذا كان الجين المستهدف الصامت متورطا في نقل مقاومة غير المضيفة. هذا يسهل التعرف الموثوق والأسرع على النباتات الصامتة الجينات المعرضة لمسببات الأمراض غير المضيفة. علاوة على ذلك ، يمكن معرفة معلومات الجينات المرشحة الواعدة عن طريق تسلسل إدخال الجين النباتي في ناقل TRV. نوضح هنا قدرة الإنتاجية العالية لعلم الوراثة الأمامي بوساطة VIGS لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف. تقريبا ، يمكن إسكات 100 cDNA بشكل فردي في حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ويمكن دراسة أهميتها في مقاومة غير المضيف ضد العديد من مسببات الأمراض البكتيرية غير المضيفة في غضون أسبوع بعد ذلك. في هذه المخطوطة ، نعدد الخطوات التفصيلية التي ينطوي عليها هذا الفحص. يمكن توسيع نهج فحص علم الوراثة الأمامي بوساطة VIGS ليس فقط لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف ولكن أيضا لدراسة الجينات التي تنقل العديد من تحمل الإجهاد الحيوي وغير الحيوي في أنواع نباتية مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقاومة غير المضيف هي مقاومة جميع الأنواع النباتية ضد أجناس مسببات الأمراضالمعينة 1،2. هذا يضفي طيفا واسعا ومقاومة دائمة للأمراض في النباتات2،3. ومع ذلك ، فإن آليتها ، خاصة ضد مسببات الأمراض البكتيرية ، ليست مفهومة جيدا4. يعد فحص الطفرات أو النباتات الصامتة التي تضر بمقاومة غير المضيف ، وتوصيف النسخ عالي الإنتاجية لتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا أثناء مقاومة غير المضيف5-9 نهجين رئيسيين استخدمتا سابقا لتشريح المقاومة البكتيرية غير المضيفة. نظرا لأن المقاومة غير المضيفة يتم التحكم فيها بواسطة آلية (آليات) معقدة4 مع إشراك العديد من الجينات ، فإن النهج الجيني الوظيفي عالي الإنتاجية لتحديد الجينات أمر بالغ الأهمية لفهم آلية (آليات) المقاومة غير المضيفة بشكل أفضل.

تم استخدام إسكات الجينات الناجم عن الفيروس (VIGS) بنجاح لإسكات الجينات النباتية الذاتية في العديد من الأنواع النباتية10،11. Nicotiana benthamiana هي واحدة من أفضل النباتات المناسبة ل VIGS10،12 وتسلسل الجينوم الخاص بها متاح الآن13. تم استخدام VIGS المستند إلى فيروس خشخخة التبغ (TRV) على نطاق واسع كأداة لعلم الوراثة العكسية لتوصيف الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف2،4،14. نواقل ومشتقات VIGS متاحة الآن من خلال مركز الموارد البيولوجية لأرابيدوبسيس (ABRC ، http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html). تم استخدام VIGS أيضا كأداة وراثية أمامية لتحديد الجينات المشاركة في مناعة النبات15-17 ، وخاصة مقاومة غير المضيف6،18. يعد تقييم موت الخلايا بوساطة الاستجابة المفرطة الحساسية (HR) الذي تسببه النباتات ضد مسببات الأمراض غير المضيفة وتقييم موت الخلايا الناجم عن المرض فحصين رئيسيين يستخدمان بشكل أساسي لتحديد النباتات الصامتة الجينات الحساسة. ومع ذلك ، فإن موت خلايا الموارد البشرية يحدث فقط ضد مسببات الأمراض غير المضيفة من النوع الثاني وليس ضد مسببات الأمراض غير المضيفة من النوعالأول 2. ومن ثم ، لا يمكن استخدام فحوصات الموارد البشرية عالميا لتحديد استراتيجيات المقاومة غير المضيفة التي تستخدمها النباتات ، خاصة ضد مجموعة واسعة من مسببات الأمراض غير المضيفة من النوع الأول. أيضا ، لا يؤدي الفقدان الجزئي لمقاومة غير المضيف في نبات صامتة الجينات دائما إلى أعراض المرض6 ، وبالتالي لا يمكن استخدام تسجيل المرض لتحديد النباتات التي تعرض مقاومة غير المضيف للخطر. على العكس من ذلك ، يعد تقييم نمو مسببات الأمراض غير المضيفة في النباتات الصامتة الجينات طريقة أفضل لدراسة فقدان مقاومة غير المضيف في النباتات الصامتة الجيناتية.

بالمقارنة مع اختبار النمو التقليدي6،19 ، يمكن لطريقة أسرع لتقييم نمو البكتيريا غير المضيفة على النباتات الصامتة للجينات أن تقصر الوقت اللازم لفحص علم الوراثة الأمامي. أبلغنا سابقا عن طريقة لمراقبة نمو مسببات الأمراض البكتيرية على الأوراق بالعين المجردة تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) باستخدام البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) 19. في هذه المخطوطة نوضح فائدة GFPuv التي تعبر عن مسببات الأمراض البكتيرية غير المضيفة لسهولة التعرف على النباتات الصامتة الجينية التي تتعرض للخطر بسبب مقاومة غير المضيف. هذه المنهجية دقيقة لتحديد النباتات المعرضة للفحص عالي الإنتاجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" > 1. نمو النبات وإسكات الجينات المستهدفة

  1. ظروف نمو النبات:
    1. زرع بذور N. benthamiana على خليط تأصيص خال من التربة ، Metro-Mix 350 وأنبت البذور في غرفة النمو. يمكن أيضا استخدام أي تربة أخرى أو وسط خال من التربة بدلا من Metro-Mix.
    2. زرع الشتلات التي يبلغ عمرها ثلاثة أسابيع في أواني فردية وزراعتها في دفيئة يتم الحفاظ عليها عند 21±2 درجة مئوية جنبا إلى جنب مع ظروف النمو الأخرى كما هو مفصل في الأدبيات السابقة12. بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الزرع ، يمكن استخدام النباتات لتلقيح TRV.
  2. تزايد استنساخ TRV2:
    TRV هو فيروس ثنائي الأجزاء ويتكون جينومه من RNA1 و RNA2. يقوم RNA1 بتشفير بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي وبروتين الحركة20،21. يقوم RNA2 بتشفير بروتين معطف (CP) واثنين من البروتينات غير البنيوية من الحمض النووي الريبي الفرعي21. كل من RNA1 و RNA2 مطلوبان لتكوين جزيئات الفيروس الناضجة وانتشارها20،21. تم وصف بناء مكتبة (كدنا) في متجه TRV2 في الأدبيات السابقة22،23. باختصار ، تم إنشاء مكتبة VIGS المستخدمة في هذه الدراسة من الحمض النووي الريبي المستخرج من أنسجة الأوراق المعرضة لمختلف المحفزات الحيوية وغير الحيوية.
    1. أخرج Agrobacterium (سلالة GV2260) التي تحتوي على استنساخ (كدنا) في ناقل TRV2 (صفيحة 96 بئرا) من الفريزر. قم بإذابة الثلج تدريجيا وبعد أن تصل المزارع إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بتلقيح ثقافة Agrobacterium الفردية على صفيحة أجار Luria-Bertani (LB) مع rifampicin (10 ميكروغرام / مل) وكاناميسين (50 ميكروغرام / مل) باستخدام مكرر مكون من 96 سنا.
    2. احتضان الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. عادة ما نزرع أربع مستعمرات مكررة لكل استنساخ بحيث يتوفر لقاح Agrobacterium كاف للتلقيح بوخز نباتين. قم بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة.
  3. فيجس:
    1. تنمو Agrobacterium (GV2260) تحمل TRV1 عند 28 درجة مئوية في وسط سائل LB مع المضادات الحيوية المذكورة أعلاه. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي من المزارع المزروعة بين عشية وضحاها ، وإعادة تعليقها في مخزن التلقيح (10 ملي مولار MES ، درجة الحموضة 5.5 ؛ 200 ميكرومتر أسيتوسيرينجون) ، واحتضانها لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة على شاكر عند 50 دورة في الدقيقة.
    2. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليقها في مخزن مؤقت MES سعة 5 ملي مولار (درجة الحموضة 5.5) وتلقيح (OD600 = 0.3) في الجانب المحوري من 3-4 N. أوراق بنثاميانا باستخدام حقنة بدون إبر. تم توضيح إجراء التلقيح التفصيلي في الأدبيات السابقة24. في وقت لاحق ، في موقع تلقيح TRV1 ، قم بتلقيح مستعمرات TRV2 الخاصة بها عن طريق وخز الأوراق بعود أسنان.
    3. حافظ على النباتات بالتغذية الكافية لأن النمو القوي مهم لكفاءة VIGS12. بعد حوالي أسبوعين من التلقيح ، ستبدأ نسخ الجينات المستهدفة في الانخفاض وتكون النباتات جاهزة للتلقيح لمسببات الأمراض بعد ثلاثة أسابيع من تلقيح TRV.
< p class = "jove_title" > 2. تحضير مزارع مسببات الأمراض غير المضيفة وتلقيح النبات

  1. تفاصيل مسببات الأمراض المستخدمة في هذه الدراسة:
    Pseudomonas syringae الكهروضوئية. tabaci ، P. syringae الكهروضوئية. طماطم T1, P. syringae الكهروضوئية. جلايسينيا و زانثوموناس كامبيستریس الكهروضوئية. تستخدم المثانة في هذه الدراسة. تنمو P. syringae سلالات في وسط سائل King's B (KB) مكمل بريفامبيسين (10 ميكروغرام / مل) ، كاناميسين (50 ميكروغرام / مل) عند 28 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. المثانة في وسط سائل LB لمدة 16 ساعة. تحتوي جميع مسببات الأمراض على بلازميد يمكنه التعبير عن GFPuv كما هو موضح في الأدبيات السابقة19.
  2. تحضير مزارع مسببات الأمراض لتلقيح النبات:
    1. حصاد الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي وتأكيد وجود مضان أخضر باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي في الظلام. اغسل الخلايا مرتين بالماء المعقم وأعد تعليقها إلى التركيز المطلوب باستخدام الماء المعقم.
    2. تلقيح العامل الممرض (المسببات) المعني على الجانب المحوري للجين المستهدف الأوراق الصامتة (من 5إلى 8) كبقع (حوالي 1.5 سم من الأقطار). يمكن اختبار العديد من مسببات الأمراض غير المضيفة في وقت واحد لنموها في النباتات الصامتة للجينات المستهدفة. قم بتلقيح العامل الممرض المضيف في نفس الوقت حيث يمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي للعرض في نمو بكتيريا اللانتا. أيضا تلقيح نباتات مكافحة النواقل (TRV::00).
< p class = "jove_title" > 3. مراقبة نمو مسببات الأمراض البكتيرية في النبات

  1. قم بتعريض الأوراق الملقحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي طويل في الظلام. يمكن النظر إلى المستعمرات البكتيرية على أنها نقاط فلورية خضراء في الجانب المحوري من الورقة في خلفية التألق الأحمر المنبعث من سطح الورقة.
  2. مراقبة نمو مسببات الأمراض من يومين بعد التلقيح (نقطة في البوصة) إلى 5 نقطة في البوصة. الملاحظة اليومية خلال هذه الفترة الزمنية ضرورية.
  3. بعد الشاشة الأولى ، ضع قائمة مختصرة بالحيوانات المستنسخة التي يؤدي إسكاتها إلى نمو واحد أو أكثر من مسببات الأمراض غير المضيفة.
  4. كرر VIGS للنسخ المختارة واختبر مرة أخرى استجابة النباتات الصامتة للجينات لمسببات الأمراض غير المضيفة. يتم إجراء هذا المستوى الثاني من الفحص لإزالة الإيجابيات الخاطئة التي تم الحصول عليها خلال الشاشة الأولى.
< p class = "jove_title" > 4. تأكيد المصانع المدرجة في القائمة المختصرة لمقاومة غير المضيفين المعرضة للخطر

  1. قم بكتم استنساخ (كدنا) المحددة من الشاشة كما هو موضح أعلاه. قم بتلقيح النبات بأكمله بمسببات الأمراض غير المضيفة عن طريق غمر النباتات بمزارع مسببات الأمراض ذات الصلة بنسبة 0.01٪ (حجم / حجم) Silwet L-77 وإخضاع النباتات المغمورة بالمكنسة الكهربائية لمدة 3-5 دقائق. حدد نمو البكتيريا عن طريق مقايسة النمو التقليدي6،18،19 كما هو موضح أدناه.
  2. في 0 ساعة بعد التلقيح (hpi) ، 3 نقاط في البوصة و 5 نقاط في البوصة ، اجمع عينتين من الأوراق من خمسة مكررات بيولوجية لكل أوراق (أس) ممرضة غير مضيفة ملقحة باستخدام ثقب ورقة (0.5 سم2). طحن عينات الأوراق ، وتخفيف المسلسل ولوحة النسغ على وسط KB أجار مكمل بالمضادات الحيوية المناسبة واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. عد المستعمرات البكتيرية باستخدام عداد المستعمرات واحسب نمو البكتيريا في الأوراق كما هو موضح في الأدبيات السابقة6.
  3. يجب أن تظهر النباتات المعرضة لمسببات الأمراض غير المضيفة عددا أكبر من نمو مسببات الأمراض مقارنة بمكافحة النواقل.
< p class = "jove_title" > 5. تسلسل إدخال وتحديد الجين المستهدف

  1. قم بإجراء مستعمرة PCR للاستنساخ المحدد باستخدام بادئات attB1 و attB2 أو باستخدام الاشعال التي تحيط بموقع الاستنساخ في متجه TRV2. قم بتشغيل منتج PCR على الجل وتحقق من تضخيم النطاق الفردي.
  2. يمكن تسلسل إدخال الجينات النباتية في ناقل TRV2 باستخدام بادئات attB أو بادئات تحيط بموقع الاستنساخ.
  3. قم بإجراء BLAST باستخدام التسلسل وتحديد تفاصيل الجينات.
  4. الحصول على تسلسل جيني كامل الطول جنبا إلى جنب مع المناطق غير المترجمة (UTRs).
  5. حدد شظايا 300-400 نقطة أساس من ثلاث مناطق مختلفة من التسلسل واستنساخها في متجه TRV2. قم بإجراء VIGS بشكل مستقل باستخدام جميع تركيبات VIGS الثلاثة وتأكيد اختراق مقاومة غير المضيف في جميع النباتات الثلاثة الصامتة بالجينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو توضيح طريقة سهلة ودقيقة لتحديد نباتات N. benthamiana التي تم إسكات جيناتها، والتي تفتقر إلى المقاومة غير المضيفة. تتكون هذه المنهجية من أربع خطوات رئيسية. الخطوة الأولى هي إسكات عدد كبير من الجينات بشكل فردي باستخدام تقنية TRV-VIGS. لقد قمنا بإسكات حوالي 5,000 جين6,18 على مدى فترة زمنية بلغت حوالي 1.5 سنة باستخدام البروتوكول الموضح في الشكل 1. أظهرت بعض النباتات التي تم إسكات جيناتها تغيرات مظهرية مختلفة، بما في ذلك تقزم النمو، والاصفرار، ومظاهر التبي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحد مناعة النبات من نمو مسببات الأمراض غير المضيفة ، وبالتالي ، ينبعث القليل من التألق الأخضر أو لا ينبعث على الإطلاق من أوراق نبات التحكم في ناقلات النواقل الملقحة بمسببات الأمراض غير المضيفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية ذات الطول الموجي الطويل (الشكل 3D). ومع ذلك ، عندما يتم إسكات الجين المتورط في المقاومة غير المضيفة ، فإن النباتات الصامتة للجين تفضل نمو مسببات الأمراض غير المضيفة ويظهر التألق الأخضر (الشكل 3E). هذا هو المبدأ الأساسي المتضمن في الطريقة الموصوفة في هذه المخطوطة. هذه ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة صموئيل روبرتس نوبل. يشكر المؤلفون السيدة جاني غالاواي وكولين إليس على العناية الممتازة بالنبات. والسيدة كاتي براون للأعمال الفنية. كما نود أن نشكر السيدة ترينا كوتريل، وبوجا أوبالاباتي، وموميتا ساها، وسويثا فينوكوندا، والسيد إسحاق غرينهوت على المساعدة الفنية أثناء وضع هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 بئر U-أسفل لوحاتBecton Dickinson Labware (فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)35-3077
96-pin مكرر الفولاذ المقاوم للصدأNalge Nunc International (نابرفيل ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية)250520
مصابيح فحص الأشعة فوق البنفسجية عالية الكثافة ، نموذج B-100apThomas العلمية (سويدسبورو ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)6283K50معرف الشركة المصنعة 95-0127-01
عدادمستعمرة ستيوارت SC6بيبي ساينتفيك ليمتد ، ستافوردشاير ، المملكة المتحدةSC6PLUS
خليط تأصيص بدون تربة ، Metro-Mix 350SUNGRO Horticulture Distribution، Inc. ، (بلفيو ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية)
الاشعال:
attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)
attB2 (GGGGACCACTTTGTTACAGAAAGCTGGGT)		Integrated DNA Technologies، Inc (كورالفيل ، IA ، الولايات المتحدة الأمريكية)مركب
، مونوهيدرات VWR الدولية (رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)رقم CAS 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone) Sigma Aldrich (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)Lehle Seeds (Round Rock ، TX ، الولايات المتحدة الأمريكية)VIS-30
MES حسب الطلب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heath, M. C. Nonhost resistance and nonspecific plant defenses. Currrent Opinion in Plant Biology. 3, 315-319 (2000).
  2. Mysore, K. S., Ryu, C. -M. Nonhost resistance: how much do we know. Trends in Plant Science. 9, 97-104 (2004).
  3. Ellis, J. Insights into nonhost disease resistance: can they assist disease control in agriculture. The Plant Cell. 18, 523-528 (2006).
  4. Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Nonhost resistance against bacterial pathogens: retrospects and prospects. Annual Review of Phytopathology. 51, (2013).
  5. Lu, M., Tang, X., Zhou, J. -M. Arabidopsis NHO1 is required for general resistance against Pseudomonas bacteria. The Plant Cell. 13, 437-447 (2001).
  6. Rojas, C. M., et al. Glycolate oxidase plays a major role during nonhost resistance responses by modulating reactive oxygen species mediated signal transduction pathways. The Plant Cell. 24, 336-352 (2012).
  7. Daurelio, L. D., et al. Transcriptome analysis reveals novel genes involved in nonhost response to bacterial infection in tobacco. Journal of Plant Physiology. 168, 382-391 (2011).
  8. Moreau, M., et al. EDS1 contributes to nonhost resistance of Arabidopsis thaliana against Erwinia amylovora. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 421-430 (2012).
  9. Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Ornithine-delta-aminotransferase and proline dehydrogenase genes play a role in non-host disease resistance by regulating pyrroline-5-carboxylate metabolism-induced hypersensitive response. Plant, Cell & Environment. 35, 1329-1343 (2012).
  10. Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants. The Plant Journal. 39, 734-746 (2004).
  11. Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. New dimensions for VIGS in plant functional genomics. Trends in Plant Science. 16, 656-665 (2011).
  12. Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Virus-induced gene silencing can persist for more than 2 years and also be transmitted to progeny seedlings in Nicotiana benthamiana and tomato. Plant Biotechnology Journal. 9, 797-806 (2011).
  13. Bombarely, A., et al. A draft genome sequence of Nicotiana benthamiana to enhance molecular plant-microbe biology research. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 1523-1530 (2012).
  14. Sharma, P. C., et al. Virus-induced silencing of WIPK and SIPK genes reduces resistance to a bacterial pathogen, but has no effect on the INF1-induced hypersensitive response (HR) in Nicotiana benthamiana. Mol Gen Genomics. 269, 583-591 (2003).
  15. Baulcombe, D. C. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Current Opinion in Plant Biology. 2, 109-113 (1999).
  16. Lu, R., et al. High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance. EMBO Journal. 22, 5690-5699 (2003).
  17. Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKK[alpha] is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO Journal. 23, 3072-3082 (2004).
  18. Wang, K., Senthil-Kumar, M., Ryu, C. -M., Kang, L., Mysore, K. S. Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast. Plant Physiology. 158, 1789-1802 (2012).
  19. Wang, K., Kang, L., Anand, A., Lazarovits, G., Mysore, K. S. Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole-plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv. New Phytologist. 174, 212-223 (2007).
  20. Ratcliff, F., Martin-Hernandez, A. M., Baulcombe, D. C. Technical Advance: Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. The Plant Journal. 25, 237-245 (2001).
  21. MacFarlane, S. A. Molecular biology of the tobraviruses. Journal of General Virology. 80, 2799-2807 (1999).
  22. Anand, A., et al. Identification and characterization of plant genes involved in Agrobacterium-mediated plant transformation by virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 41-52 (2007).
  23. Liu, E., Page, J. Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus. Plant Methods. 4, 5(2008).
  24. Velásquez, A. C., Chakravarthy, S., Martin, G. B. Virus-induced gene silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and tomato. J. Vis. Exp. (28), e1292(2009).
  25. Peart, J. R., et al. Ubiquitin ligase-associated protein SGT1 is required for host and nonhost disease resistance in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99. , 99-10869 (2002).
  26. Oh, S. -K., et al. Insight into Types I and II nonhost resistance using expression patterns of defense-related genes in tobacco. Planta. 223, 1101-1107 (2006).
  27. Senthil-Kumar, M., Mysore, K. RNAi and Plant Gene Function Analysis. Methods in Molecular Biology. Kodama, H., Komamine, A. 744, Humana Press. 13-25 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VIGS GFP Pseudomonas Syringae cDNA

مقالات ذات صلة