مقالة منهجية

تحليل موت الخلايا المبرمج في أجنة أسماك الزرد عن طريق التألق المناعي الكامل للكشف عن الكاسباز المنشط 3

21.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51060

⸱

ديسمبر 20, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Oncological Sciences, University of Utah

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن تؤدي بعض الاضطرابات الجينية أو التعرض للسموم إلى تعطيل عمليات النمو الطبيعية مما يؤدي إلى موت أنواع معينة من الخلايا. يكشف تحليل Caspase 3 المنشط عن طريق التألق المناعي الكامل في أجنة أسماك الزرد عن توطين خاص بالمرحلة والأنسجة للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج على وجه التحديد.

الملخص

التألق المناعي الكامل للكشف عن Caspase 3 المنشط (اختبار Casp3) مفيد لتحديد الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج الداخلي أو الخارجي في أجنة الزرد. يوفر التحليل الكامل معلومات مكانية فيما يتعلق بخصوصية الأنسجة لخلايا apoptosing ، على الرغم من أن التقسيم و / أو وضع العلامات المشتركة مطلوب في النهاية لتحديد أنواع الخلايا الدقيقة التي تخضع لموت الخلايا المبرمج. تم تحسين اختبار Casp3 الكامل لتحليل الأجنة الثابتة بين المرحلة المكونة من 4 خلايا و 32 ساعة بعد الإخصاب وهو مفيد لعدد من التطبيقات ، بما في ذلك تحليل طفرات وأشكال أسماك الزرد ، والإفراط في التعبير عن mRNAs الطافرة والنوع البري ، والتعرض للمواد الكيميائية. بالمقارنة مع تلطيخ البرتقال الأكريدين ، والذي يمكنه تحديد الخلايا المبرمج في الأجنة الحية في غضون ساعات ، تستغرق فحوصات Casp3 و TUNEL وقتا أطول بكثير لإكمالها (2-4 أيام). ومع ذلك ، نظرا للطبيعة الديناميكية لتكوين الخلايا المبرمجة وإزالتها ، فإن تحليل الأجنة الثابتة يضمن مقارنة دقيقة لخلايا موت الخلايا المبرمج عبر عينات متعددة في نقاط زمنية محددة. لقد وجدنا أيضا أن اختبار Casp3 يتفوق على تحليل الخلايا موت الخلايا المبرمج بواسطة مقايسة TUNEL كاملة التركيب فيما يتعلق بالتكلفة والموثوقية. بشكل عام ، يمثل اختبار Casp3 اختبارا قويا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة لتحليل الخلايا المبرمجة في أجنة أسماك الزرد المبكرة.

المقدمة

< p class = "jove_content"> نصف هنا كيفية إجراء التألق المناعي الكامل في أجنة أسماك الزرد المبكرة للكشف عن الخلايا ذات Caspase 3 المنشط (يشار إليها فيما يلي باسم اختبار Casp3). الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد الوفرة النسبية وموقع الخلايا المبرمج في أسماك الزرد من المرحلة المكونة من 4 خلايا إلى 32 ساعة بعد الإخصاب (HPF).

< p class = "jove_content" > كل من المسارات المبرمج الجوهرية (بوساطة الميتوكوندريا) والخارجية (بوساطة مستقبلات الموت) تتوسط موت الخلايا من خلال تنشيط سلسلة الكاسباز1-2. عادة ما توجد الكاسباسات البادئة كمونومرات داخل الخلية ، وبمجرد تجنيدها في منصات خاصة بالمسار استجابة لإشارة مؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، فإنها تصبح ثنائيات نشطة. ثم تستهدف caspases البادئ المنشط (Caspase 9 ؛ المسار الجوهري ، و Caspase 8 ؛ المسار الخارجي) caspases المستجيب غير النشط المسبق (Caspase 3 ، 6 ، 7) للانقسام لتشكيل heterotetramers نشطة. ثم تشق الكاسباسات المستجيب النشطة الأهداف الخلوية ببقايا رباعي الببتيد المحددة لبدء التدمير المحلل للبروتين المحدد الذي يبلغ ذروته في السمات المميزة للبنية التحتية لموت الخلايا المبرمج ، مثل تكثيف الكروماتين وفقاع الغشاء ، وإشارات سطح الخلية التي تتوسط في تغليف الخلية للابتلاع بواسطة الخلايا البلعمية بطريقة صامتة مناعية. في خلايا الثدييات ، يعتقد أن الكاسباسات المستجيبة النشطة تؤدي غالبية أحداث الانقسام الخلوي التي تتوسط موت الخلايا المبرمج من خلال كل من المسارات الداخلية والخارجية1-2. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا جسما مضادا يربط على وجه التحديد الشكل المشقوق غير المتجانس من Caspase 3 ، ولكن ليس ثنائي Caspase 3 غير النشط.

تتمثل إحدى مزايا اختبار Casp3 في القدرة على تصور التوزيع المكاني للخلايا موت الخلايا المبرمج في سياق الجنين بأكمله. لذلك ، يمكن فحص الأنسجة ذات الأهمية بحثا عن وجود خلايا موت الخلايا المبرمج ، وإذا كانت الأجسام المضادة أو السلالات الفلورية المعدلة وراثيا تصنف أنواعا معينة من الخلايا ، فمن الممكن تحديد الهوية الدقيقة للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج من خلال تجارب وضع العلامات المشتركة. نجحت عدة مجموعات في استخدام Caspase 3 المنشط كعلامة لموت الخلايا المبرمج في أجنة أسماك الزرد (على سبيل المثال 3-7). تشمل التقنيات الإضافية الكاملة لتحديد الخلايا المبرمج في أجنة أسماك الزرد اختبار TUNEL8 وتلوين برتقالي أكريدين (AO)9. لقد استخدمنا جميع الطرق الثلاث لتحديد الخلايا المبرمجة في أجنة أسماكالزرد 4،6،10.

< p class = "jove_content" > TUNEL (ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفية dUTP نهاية الملصق) يستفيد تلطيخ إنزيم ديوكسي نيوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي (TdT) الذي يستخدم لإضافة النيوكليوتيدات إلى 3 'نهايات هيدروكسيل من الحمض النووي أثناء إعادة تركيب VDJ في الخلايا الليمفاوية11. يضيف TdT dUTP-biotin لتحرير مجموعات هيدروكسيل 3 بوصات في الحمض النووي ، والتي توجد بكثرة بشكل أساسي في الخلايا المبرمجة. ثم تتعرض الأنسجة لأفيدين بيروكسيداز ، ويتم تلطيخ الخلايا المبرمجة عند إضافة الركيزة 3-أمينو-9-إيثيل كاربازول. تم استخدام مقايسة TUNEL لإجراء تحليل مكثف للخلايا المبرمجة أثناء التطور الجنيني في أنسجة سمكة الزرد من النوع البري12. على غرار اختبار Casp3 ، يتم إجراء اختبار TUNEL فقط على الأجنة الثابتة. لقد وجدنا أن اختبار Casp3 أكثر اتساقا وأقل تكلفة من مقايسة TUNEL.

تم وصف تلطيخ AO لأول مرة كآلية لتحديد الخلايا المبرمجة على وجه التحديد في ذبابة الفاكهة13. يلطخ AO كلا من السيتوبلازم ونواة الخلايا المبرمجة ، ولكن ليس النخرية. من المعروف أن AO يربط الأحماض النووية14 ، ويعتقد أن هذا يفسر التلوين النووي. ومع ذلك ، فإن AO لا يلطخ كروماتين الخلايا الحية. بدلا من ذلك ، يبدو أن التغييرات المحددة التي تحدث أثناء موت الخلايا المبرمج تسمح بإقحام وتلوين نوى موت الخلايا المبرمج المكثفة15. يتميز تلطيخ AO بميزة التحليل المبرمج السريع للأجنة الحية. ومع ذلك ، يجب إجراء توثيق العينات بسرعة بسبب الطبيعة الديناميكية لتكوين الخلايا المبرمجة وإزالتها. من ناحية أخرى ، يوفر التثبيت المتزامن لجميع العينات لمحة سريعة عن موت الخلايا المبرمج في وقت معين عبر جميع العينات ولا يخضع لهذا المتغير الزمني. وبالتالي ، نظرا لأن تحليل الخلايا المبرمجة بواسطة تلطيخ AO غير متوافق مع الأجنة الثابتة ، فإن اختبار Casp3 هو الأفضل للتجارب التي يكون فيها التوثيق الفوتوغرافي و / أو القياس الكمي مطلوبا عبر عينات متعددة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

  1. قم بإعداد 500 مل من 1x PBST (1x PBS ، 0.1٪ Tween-20) ، وقم بتعقيم التصفية. يمكن الاحتفاظ ب 1x PBST في درجة حرارة الغرفة (RT) إلى أجل غير مسمى طالما لا توجد علامات على نمو البكتيريا.
  2. تنبيه: قم بإعداد 50 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في غطاء كيميائي عن طريق إذابة مسحوق PFA في 1x PBS عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة وتغطيتها بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد ، أو عند -20 درجة مئوية لمدة عامين.
  3. قم بإعداد 500 مل من 1x PDT الطازج (1x PBST ، 0.3٪ Triton-X ، 1٪ DMSO). يمكن تخزين 1x PDT عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  4. تحضير 50 مل من المخزن المؤقت المانع (1x PBST ، 10٪ مصل بقري للجنين معطل بالحرارة ، 2٪ زلاليم مصل البقري). قم بإنشاء 10 مل من الحصص ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة. بمجرد إذابته ، يمكن تخزين المخزن المؤقت للحجب عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
  5. تحضير 100 مل من ميثيل السليلوز 4٪ عن طريق تسخين 30 مل من الماء إلى 80 درجة مئوية. أضف 4 جم من ميثيل السليلوز إلى الماء الساخن ، واخلطه باستخدام شريط تقليب على طبق تقليب بدرجة حرارة الغرفة. عادة ما يستغرق الخلط الشامل ما بين 4 ساعات إلى ليلة كاملة. أضيفي ما تبقى من الماء (غير المسخن) واخلطيهم على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعة. تخزين في RT.
  6. في حالة استخدام الأجنة بين مرحلة البراعم الخلفية و 32 حصان ، قم بإعداد 50 مل من 10 مجم / مل بروناز ، وتخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية. خلاف ذلك ، قم بتخزينها في 10 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
  7. ضع 50 مل من الميثانول 100٪ عند -20 درجة مئوية.
  8. تحضير 60 ضعفا من ماء البيض عن طريق إذابة 280 جم من ملح البحر الفوري في 2 لتر من الماء المقطر (كما هو الحال في ويسترفيلد16). تحضير 1x من ماء البيض عن طريق تخفيف 60x المرق في ماء منزوع الأيونات.

2. تحضير الأجنة

  1. اجمع أجنة الزرد في طبق بتري في 1x ماء بيضة بين المرحلة المكونة من 4 خلايا و 32 HPF.
    1. بالنسبة للأجنة بين المراحل المكونة من 4 خلايا والمرحلة الخلفية ، انتقل إلى الخطوة 2.2.
    2. بالنسبة للأجنة بين مرحلة الذيل و 32 hpf ، قم بإزالة المشيمات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 10 مجم / مل بروناز إلى الأجنة في 10 مل من ماء البيض 1x.
    3. ملاحظة: يمكن أن يكون نشاط Pronase متغيرا بين الدفعات. وبالتالي ، يجب تحسين تركيز البروناز النهائي للتخلص عند الحصول على دفعات جديدة.
      1. اتركيه يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
      2. اسكب ماء البيض / محلول بروناز في النفايات ، وأضف ببطء 1x ماء بيضة طازجة.
      3. اشطف 2x عن طريق سكب ماء البيض الموجود (والمغارات العائمة) ، وأضف ماء البيض الجديد برفق.
      4. ملاحظة: يجب إزالة معظم المشيمات في هذه المرحلة. باستخدام ماصة النقل ، امتصاص الأجنة برفق لأعلى ولأسفل حتى تتم إزالة الحميمة المتبقية.
  2. انقل ما يصل إلى 40 جنينا إلى أنبوب سعة 1.5 مل. اشطف 2 مرات مع 1 مل من 1x PBST.  
  3. قم بإزالة PBST ، مع ترك السائل فوق الأجنة مباشرة (يجب أن يبقى حجم 100 ميكرولتر تقريبا في الأنبوب). أضف 1 مل من 4٪ PFA. ضع الأنابيب على جانبها (بحيث تنتشر الأجنة على طول الأنبوب) في وعاء بحجم مناسب لسهولة النقل (مثل طبق بتري أو أعلى صندوق ماصة) ، وضعه على هزاز لطيف عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو حتى أسبوع.  
    1. بالنسبة للأجنة بين المراحل المكونة من 4 خلايا وبراعم الذيل ، قم بفك الأجنة الثابتة يدويا باستخدام الملقط.
< p class = "jove_title" >3. إجراء التألق المناعي

  1. ضع الأنابيب في رف أنبوبي بحيث تغرق جميع الأجنة في قاع الأنبوب. قم بإزالة PFA (إلى حاوية النفايات المناسبة) تاركا سائلا أعلى بقليل من مستوى الأجنة. بعد التثبيت (الخطوة 2.3) ، يجب عدم تعريض الأجنة للهواء من أجل منع تلطيخ الأجسام المضادة في الخلفية.
  2. أضف 1 مل من الميثانول المثلج 100٪ (للنفاذية) حسب القطرة. أصبحت الأجنة الآن هشة بعد التثبيت ، ويجب توخي مزيد من الحذر لمنعها من الهبوط داخل الأنبوب أثناء جميع عمليات الإزالة / الإضافة اللاحقة للسوائل. ضع الأنابيب على جانبيها ، وضعها عند -20 درجة مئوية لمدة ساعتين. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الأجنة عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
  3. ضع الأنابيب في رف لجمع الأجنة في قاع الأنبوب. قم بإزالة الميثانول ، وترك السائل أعلى بقليل من مستوى الأجنة.
  4. أضف بعناية 1 مل 1x PDT. قم بإزالة PDT وأضف 1 مل من 1x PDT الطازج. ضع الأنابيب على جوانبها وقم بالصخور برفق في RT لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة PDT ، وكرر 30 دقيقة غسلها باستخدام PDT الطازج.
  5. قم بإزالة PDT حتى يصبح السائل أعلى بقليل من مستوى الأجنة ، وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر.
    1. ضع الأجنة على جانبها في حاوية نقل ، وتأكد من أن الأجنة لا تنتقل أكثر من 2/3 طول الأنبوب. خلاف ذلك ، يتم القبض على الأجنة في غطاء الأنبوب وخارج السائل.  
    2. ضع حاوية النقل بعناية مع الأنابيب على هزاز لطيف جدا في RT لمدة 1 ساعة.
  6. ضع الأنابيب في وضع مستقيم في رف أنبوبي ، وافتح جميع الأنابيب للتحقق من وجود أجنة عالقة على الغطاء. بالنسبة لأي أنابيب بها أجنة على الغطاء ، أغلق الجزء العلوي ، وهز الأنبوب برفق يدويا لإعادة جميع الأجنة إلى السائل.
  7. أضف 1 ميكرولتر من الأرانب المضادة للجسم المضاد Caspase 3 (تخفيف 1: 500).
    1. في حالة إجراء تجربة وضع العلامات المشتركة ، ما عليك سوى إضافة التخفيف المناسب للجسم المضاد الثاني غير المشتق من الأرانب بالإضافة إلى الجسم المضاد Caspase 3 المضاد للتنشيطه.
  8. ضع الأجنة بعناية على جانبها ، وقم بتحضينها برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  9. ضع الأنابيب في رف أنبوبي. إزالة محلول الكتلة / الأجسام المضادة. أضف 1 مل من 1x PDT. تأكد من قلب الأنبوب يدويا لجمع أي أجنة عالقة على غطاء الأنبوب. بعد ذلك ، افتح جميع الأنابيب للتأكد من إزالة جميع الأجنة من الغطاء.
  10. كرر الخطوة 3.4.
  11. كرر الخطوات 3.5-3.10 ، ولكن استبدل الجسم المضاد Caspase 3 المضاد للتنشيط بالتخفيف المناسب لجسم مضاد بالفلوروفور للأرانب يمتص الضوء الأزرق وينبعث منه الضوء الأخضر. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي جسم مضاد مترافق بالفلوروفور مع أطياف امتصاص / انبعاث مفضلة للمستخدم هنا. بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي ، من المهم إبقاء الأجنة في الظلام لبقية الفحص. قم بتغطية حاوية النقل بورق الألمنيوم أثناء خطوات الحضانة ، لكن لا تقلق بشأن التعرض للضوء عند تغيير المخازن المؤقتة.
    1. في حالة إجراء تجربة وضع العلامات المشتركة ، ما عليك سوى إضافة التخفيف المناسب لجسم مضاد ثانوي تكميلي مترافق بالفلوروفور في هذه الخطوة.
    2. ملاحظة: إذا كان المستخدم يرغب في تسمية كاسباز 3 النشط بالخلايا التي تعبر عن GFP ، فيجب أن يتبع الجسم المضاد للأرانب المضاد للنشاط Caspase 3 هنا جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب غير الفلوري ، ويجب أن يتبع الجسم المضاد المضاد ل GFP جسم مضاد ثانوي غير فلوري أخضر. سيؤدي ذلك إلى القضاء على الارتباك إذا ظل بعض مضان Gfp مرئيا بعد تثبيت الأجنة.
فئة

4. تحليل الخلايا المبرمجة عن طريق المجهر الفلوري

  1. قم بتحليل الأجنة في 1x PDT في طبق بتري صغير أو صفيحة بقعة زجاجية تحت مجهر فلوري باستخدام مرشح الضوء المناسب. إذا كانت عناصر التحكم الإيجابية تحتوي على مضان ساطع مع الحد الأدنى من الخلفية ، فانتقل إلى الخطوة 4.2. (إذا لم يكن الأمر كذلك ، فراجع قسم استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المناقشة ، وكرر البروتوكول مع أجنة جديدة.) يمكن تخزين الأجنة عند 4 درجات مئوية في 1x PDT لمدة تصل إلى 48 ساعة.
  2. صب 4٪ ميثيل سلولوز في طبق بتري مقاس 3.5 سم ، يكفي فقط لتغطية قاع الطبق. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام صفيحة موضعية زجاجية أو شريحة اكتئاب مع قطرة كبيرة من ميثيل السليلوز في الاكتئاب. امتصاص الأجنة بعناية من قاع الأنبوب إلى ماصة نقل نظيفة وانقلها إلى لوحة بتري للتصور.
  3. قم بتوجيه جنين محل اهتمام للتوثيق باستخدام مسبار بزاوية. من المحتمل أن يكون هناك بعض التباين بين الأجنة من نفس العينة ، لذلك من المهم التقاط صور تمثل شدة التألق والنمط الذي لوحظ في غالبية الأجنة من تلك العينة. يجب إجراء التوثيق في غضون 48 ساعة من إكمال الفحص لمنع تراكم مضان الخلفية غير المحدد. لن يتداخل ميثيل السليلوز المتبقي بنسبة 4٪ مع تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل اللاحقة المطلوبة للتنميط الجيني للأجنة.
  4. ملحوظة: للمساعدة في تثبيت الجنين بزاوية معينة ، من المفيد دفع الجنين برفق إلى قاع الطبق بحيث يستقر صفار البيض أو جزء آخر من الجنين (حسب العرض المطلوب) في قاع الطبق. بعد ذلك ، استخدم المسبار لتحريك الجنين أو ميثيل السليلوز المحيط مباشرة (أثناء التصور في نفس الوقت تحت المجهر) للحصول على الزاوية المطلوبة للتوثيق.

النتائج

يقدم مقايسة Casp3 دليلاً واضحاً على الخلايا الموت المبرمج من مرحلة 4 خلايا وحتى 32 hpf. يوضح الشكل 2A أن حقن الأجنة بتركيزات عالية من mRNA المشفر لبروتينات bh3-only القوية المحفزة للموت المبرمج، مثل Bim أو Noxa، يؤدي بسرعة إلى ظهور Caspase 3 النشط بحلول مرحلة 4 خلايا من النمو. ويحدث موت الأجنة لاحقاً في غضون 1 hr4. يلاحظ أن شدة الفلورة متوسطة، ولكن النتائج حاسمة. وفي المراحل الأكبر سناً، تكون شدة الفلورة أكثر قوة. على سبيل المثال، يظهر الشكل 2B خلايا ساطعة موجبة لـ Caspase 3 النشط في أجنة في مرحلة الكرة (sphere-stage) تم حقنها بمستويات سامة متوسطة4 من mRNA المشفر لجين puma من نوع bh3-only المحفز للموت المبرمج. وقد تم حقن mRNA المشفر لجين bcl-2 المضاد للموت المبرمج بشكل مشترك لإثبات أن حقن mRNA الخاص بـ puma يحفز الموت المبرمج من خلال المسار الجوهري المعتمد على الميتوكوندريا.

يتطلب الموت الخلوي المبرمج الناجم عن الإشعاع المؤين في سمكة الزيبروفيش نسخ جينات bh3-only، مثل، بوساطة p53. بوما5-6التأخر في الموت الخلوي المبرمج الناجم عن الإشعاع المؤين في الشكل 3 يتسق مع متطلبات النسخ الذي يتوسطه p53.

ينبغي أن يؤدي بروتوكول Casp3 إلى الحصول على نسبة إشارة إلى ضجيج قوية. يقارن الشكل 4 نتيجة مقايسة Casp3 المثالية بنتيجتين شائعتين دون المستوى تحدثان عندما يتم الإخلال بخطوات حرجة (انظر المناقشة): نسبة إشارة إلى ضجيج ضعيفة ناتجة عن التألق الخلفي في أنسجة الحيوان وتألق المح، مما يشتت الانتباه عن الإشارة المراد قياسها.

تقوم تجارب الوسم المشترك باستخدام سلالات معدلة وراثياً تعبر عن GFP بتقريب صورة الأنسجة التي تمر بعملية الموت الخلوي المبرمج (الشكل 5).

مخطط انسيابي لصبغ الأجنة مناعياً: النفاذية بالميثانول، المعالجة بالأجسام المضادة، وعملية التصوير.
الشكل 1. مخطط مبسط لبروتوكول Casp3.

تطور أجنة سمك الزيبرا، مرحلتا 4 خلايا والكرة، مجهر المجال المضيء مع تحليل التعبير الجيني.
الشكل 2. (A) تحليل موت الخلايا المبرمج في أجنة في مرحلة 4 خلايا. حُقنت الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة من التطور بـ 50 pg من mRNA المشفر لـ egfp (كمجموعة ضابطة) أو جينات bh3-only المحفزة لموت الخلايا المبرمج bim و noxa. في مرحلة 4 خلايا (بعد حوالي ساعة واحدة من الحقن، hpi)، حُللت الأجنة عن طريق التألق المناعي للكشف عن Caspase 3 المنشط. يؤدي mRNA الخاص بـ Bim و noxa إلى تحفيز موت خلايا مبرمج سريع في أجنة سمك الزيبرا مباشرة بعد الحقن، والذي يؤدي إلى الوفاة بحلول 2 hpi إذا تُركت الأجنة لتتطور. تظهر صورة بالمجال المضيء لجنين بري (wild-type) في مرحلة 4 خلايا للمقارنة. (B) تحليل موت الخلايا المبرمج في أجنة سمك الزيبرا في مرحلة الكرة. حُقنت الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة من التطور بـ mRNA المشفر إما لـ 50 pg من egfp (كمجموعة ضابطة)، أو 5 pg من puma بالإضافة إلى 45 pg من egfp (puma)، أو 5 pg من puma بالإضافة إلى 45 pg من bcl-2 (bcl-2). في مرحلة الكرة (حوالي 4 hpi)، حُللت الأجنة باستخدام مقايسة Casp3. تظهر كل من المناظر الجانبية ومناظر القطب الحيواني لتصوير الخلايا التي تمر بموت مبرمج. يشير إنقاذ موت الخلايا المبرمج الناجم عن puma بواسطة bcl-2 إلى أن حقن mRNA الخاص بـ puma يحفز موت الخلايا المبرمج تحديداً من خلال المسار الجوهري المعتمد على الميتوكوندريا. تظهر صورة بالمجال المضيء لجنين بري (wild-type) في مرحلة الكرة للمقارنة.

التطور الجنيني المتسلسل، التصوير الفلوري؛ مراحل نمو الجنين من 0-3 ساعات بعد الإشعاع المؤين (hpfIR)، و17-20 ساعة بعد الإخصاب (hpf).
الشكل 3. المخطط الزمني لموت الخلايا المبرمج الناجم عن الإشعاع المؤين (IR) بين 17-20 hpf. تم تعريض أجنة سمك الزيبرفيش لإشعاع مؤين بجرعة 8 Gy عند 17 hpf وتحليلها عند 0 و1.5 و2 و3 ساعات بعد الإشعاع المؤين (hpIR) باستخدام مقايسة Casp3. تظهر الأسهم عند 20 hpf تراكم الخلايا المبرمجة في النخاع الشوكي عند 3 hpIR. تظهر صورة بالمجال المضيء لجنين عمره 17 hpf للمقارنة.

تحليل تألق الأجنة؛ صور مجهرية مقارنة للعينات الضابطة والمعالجة.
الشكل 4. نتائج التألق المناعي لـ Casp3 المثالية وغير المثالية في أجنة عمرها 27 hpf. تم تعريض أجنة أسماك الزيبرا للإشعاع (أو لم يتم تعريضها) عند 24 hpf بجرعة 15 Gy وتم تحليلها بواسطة مقايسة Casp3. تظهر المجموعة "المثالية" نتائج نموذجية حيث تتألق الخلايا المبرمج موتها إشعاعياً بوضوح، بينما تظهر الخلايا غير المبرمج موتها والمحّ أقل قدر من التألق الخلفي. تشير الأسهم في مجموعة "التألق الخلفي في العينة الضابطة" إلى تألق خلفي مفرط في أنسجة أجنة العينة الضابطة. وتوضح النجوم في مجموعة "تألق المحّ" تألقاً غير محدد مفرطاً في المحّ.

تحليل المجهر الفلوري؛ تعبير α-Gfp و α-Casp3؛ الكشف عن موت الخلايا المبرمج؛ مخطط تراكبي.
الشكل 5. تجارب الوسم المزدوج لتقدير خصوصية الأنسجة في موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإشعاع المؤين (IR). يقوم الخط المعدل وراثياً Tg(olig2:egfp)vu12 بوسم الخلايا العصبية الحركية والخلايا الدبقية قليلة التغصن17، بينما يقوم الخط Tg(elavl3:egfp) بوسم جميع الخلايا العصبية المتمايزة18. تم تعريض كل خط معدل وراثياً للإشعاع بجرعة 15 Gy عند 24 hpf وتحليله بعد 3 ساعات باستخدام أجسام مضادة أولية من الفأر مضادة لـ GFP ومن الأرنب مضادة لـ active-Caspase 3، متبوعة بأجسام مضادة ثانوية فلورية خضراء وحمراء على التوالي. يظهر تكبير للنخاع الشوكي (يقع ظهرياً بالنسبة لنهاية امتداد المح الكيس في أجنة بعمر 27-hpf و 3-hpIR). يبدو أن الخلايا التي تمر بموت مبرمج متمركزة جزئياً في كل من مجموعات Tg(elavl3:egfp) و Tg(olig2:egfp)vu12 (انظر رؤوس الأسهم في التراكب)، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية والخلايا الدبقية قليلة التغصن حساسة لموت الخلايا المبرمج الناجم عن الإشعاع المؤين.

المناقشة

من المفترض أن يكون اختبار Casp3 كما هو معروض في هذا البروتوكول واضحا ، وإذا تم إجراؤه وفقا للتعليمات الواردة هنا ، فيجب أن يؤدي إلى نسبة إشارة إلى ضوضاء قوية. تشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول استخدام مخزن مؤقت PDT جديد 1x لجميع عمليات الغسيل ، وطول خطوات الغسيل الكافي في المخزن المؤقت PDT بعد حضانة الأجنة في الجسم المضاد الأساسي ، والتعامل اللطيف مع الأجنة ، والمحاسبة الدقيقة لجميع الأجنة داخل الأنابيب أو نقل الماصات خلال جميع خطوات البروتوكول.

في تجربتنا ، فيما يلي الأسباب الأكثر شيوعا لعدم وجود إشارة على الضوابط الإيجابية: 1) يتم استبدال 1x PBST ب 1x PDT أثناء خطوات الغسيل ، 2) 1x مخزن PDT أقدم من شهر واحد ، 3) تم استخدام الجسم المضاد الثانوي الخاطئ ، 4) الأجنة أقدم من 32 hpf و / أو 5) تم تحليل أكثر من 40 جنينا في أنبوب واحد. عندما تنشأ نتائج أو تباين غير متسق داخل العينات ، فإن هذا عادة بسبب 1) لم يتم توخي الحذر لضمان بقاء جميع الأجنة داخل السائل في جميع الأوقات أثناء الإجراء ، و / أو 2) لم يتم تحضين الأجنة تحت هزاز كاف. غالبا ما يتم تصور المستويات العالية من ضوضاء الخلفية على أنها ضباب فلوري عام ينشأ في جميع أنحاء الأنسجة الحيوانية للجنين (انظر الشكل 4 ، "مضان الخلفية"). يمكن أن تنشأ نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة عندما 1) لم يتم غسل الأجنة لفترة كافية بعد الجسم المضاد الأولي ، و / أو 2) تركت الأجنة في PFA أو الميثانول لفترة أطول من الوقت الموصى به. إذا فشلت الأجنة في البقاء سليمة بنهاية الفحص: 1) لم تتم إضافة المحاليل بالقطرة بعد التثبيت باستخدام PFA ، و / أو 2) تم ضبط سرعة الروك أثناء خطوات الحضانة عالية جدا.

يعد التصور الكامل المتأصل في مقايسة Casp3 مفيدا في التوطين المكاني للخلايا المبرمج. ومع ذلك ، فإن خصوصية الأنسجة تقريبية ومن المحتمل أن تعتمد على تقنيات وضع العلامات المشتركة (انظر الشكل 5) و / أو تقسيم الأجنة لتحديد الهوية الدقيقة للخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج. في البروتوكول الموضح هنا ، يقتصر التسمية المشتركة على متطلبات الجسم المضاد المحدد المشتق من الأرانب المستخدم في فحصنا. لم نحدد جسما مضادا مضادا غير مشتق من الأرانب متاحا تجاريا من Caspase 3 يصنف على وجه التحديد الخلايا المبرمج عن طريق التألق المناعي الكامل في أجنة الزرد. وبالتالي ، فإن الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية التي يتم تربيتها في الأرانب لن تكون متوافقة مع مقايسة Casp3 لتجارب وضع العلامات المشتركة. أحد البدائل هو إجراء فحص TUNEL الذي يتطلب جسما مضادا مشتقا من الفأر لتسمية الخلايا المبرمج 6. ومع ذلك ، فقد وجدنا أن مقايسة TUNEL الكاملة التي يتم إجراؤها على أجنة الزرد حساسة للغاية لعدد من المتغيرات في التفاعل ، بما في ذلك تركيز إنزيم TdT ، ومدة حضانة الجنين في إنزيم TdT ، وعدد الأجنة الموجودة لكل أنبوب (ملاحظاتنا غير المنشورة). وبالتالي ، من الصعب إيجاد توازن للإنزيم يعطي تفسيرا متسقا للنتائج. لذلك ، فإن البديل المفضل هو تحليل الخلايا المبرمج في أجنة الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن الفلوروفور (مع الأجسام المضادة القوية المتوفرة تجاريا) مثل GFP في نوع معين من الخلايا. بعد ذلك ، يمكن إجراء تجارب وضع العلامات المشتركة باستخدام جسم مضاد أساسي للفأر مضاد ل GFP متبوعا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر مضاد للفأر أخضر. انظر الشكل 5 للحصول على مثال.

في حين أن بروتوكول Casp3 يعطي تلطيخا قويا وموثوقا للخلايا المبرمج في الأجنة من المرحلة المكونة من 4 خلايا حتى 32 حصانا ، إلا أن تطبيقه محدود يتجاوز 32 حصانا بسبب عدم قدرة الأجسام المضادة على اختراق جلد الأجنة الأكبر سنا. يمكن تحسين التقنيات الإضافية لاختراق الأجنة ، بما في ذلك العلاج بالكولاجيناز أو التربسين أو الأسيتون أو الإيثانول ، لتكييف هذا الاختبار مع تحليل الأجنة الأكبر سنا. ومع ذلك ، يمكن إجراء التلوين باستخدام AO على سمك الزرد الحي حتى عمر 5 أيام على الأقل9. وبالتالي ، فإن مقايسة AO تتحايل على تقييد المرحلة الجنينية ويمثل فحصا سريعا لتحليل الخلايا المبرمج (1-2 ساعة). على النقيض من ذلك ، يتطلب اختبار Casp3 تثبيتا بين عشية وضحاها للأجنة ويستغرق 2-4 أيام حتى يكتمل. تشمل عيوب مقايسة AO أن التوثيق الفوتوغرافي الفعال للأجنة يمكن أن يمثل تحديا مع عينات متعددة نظرا لأن الأجنة حية والخلايا المبرمج تتشكل وتمسح بسرعة. يمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة إذا كانت الأجنة بحاجة إلى تركيبها للحصول على اتجاه محدد للتوثيق. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن تلطيخ AO يتضاءل بعد التثبيت باستخدام PFA ، لذلك فهو غير متوافق مع تجارب وضع العلامات المشتركة التي تنطوي على التألق المناعي.

يمكن إجراء التحليل الكمي ل Caspase 3 المنشط باستخدام البرامج التي تقيس شدة التألق للصور الموثقة. لقد قمنا بتحديد موت الخلايا المبرمج الناجم عن الأشعة تحت الحمراء في الأنسجة العصبية ، وهي طريقة وصفناها بالتفصيل في مكان آخر10. اعتمادا على التجربة ، قد يتطلب التحليل الكمي ل Caspase 3 المنشط مزيدا من التلاعب بالأجنة ، مثل التركيب المسطح ، للحصول على التوجيه المناسب لتحليل الأنسجة الأمثل. بالإضافة إلى ذلك ، ستعتمد خطية التحليل على سمك الأنسجة التي يتم تحليلها. على سبيل المثال ، قمنا بتحليل موت الخلايا المبرمج الناجم عن الأشعة تحت الحمراء في الأنسجة العصبية عن طريق قياس التألق المناعي النشط Caspase 3 في الأنسجة العصبية الضحلة للحبل الشوكي بدلا من الأنسجة الكثيفة للخلايا العصبية في الدماغ4،10.

من واقع خبرتنا ، فإن مقايسة Casp3 هي الاختبار الأكثر قوة وموثوقية المتاح لتحليل موت الخلايا المبرمج في أجنة أسماك الزرد بين المرحلة المكونة من 4 خلايا و 32 حصانا عندما يتطلب التحليل متسعا من الوقت للتوثيق. عندما تتوفر الأجسام المضادة المناسبة أو الخطوط المعدلة وراثيا لتحديد خلايا معينة ، فإن هذا الاختبار يكون أيضا قابلا للوضع المشترك لتحديد أنواع الخلايا المحددة التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

< p class = "jove_content" >تم توفير التمويل من قبل مؤسسة هانتسمان للسرطان (CJ ، CT) ، ومنحة جمعية السرطان الأمريكية #RSG-13-025-01-CSM (RS) و NIH T32 GM007464-36 (SS).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب 1.5 مل   ؛دينفيل العلميc2170غير خطرة. أي أنابيب بلاستيكية مماثلة بطول 1.5 متر كافية.
10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشP5493غير خطير.
يكون الجسم المضاد A-activated-human-Caspase-3Fisher ScientificBDB559565ضارا إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه.
الجسم المضاد أحادي النسيلة a-GFP (الفأر)قد تكون Life Technologies33-2600ضارة إذا تم استنشاقها أو ابتلاعها.
a-HuC / HuD البروتين العصبي البشري ، الفأر IgG2b ، أحادي النسيلة 16A11 - UNCONJLife TechnologiesA21271قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه.
الألبومين ، عزل الصدمات الحرارية البقري BSA AmrescoCAS 9048-46-8غير خطرة. يمكن شراؤها أيضا من خلال Bioexpress: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Donkey المضاد للفأر IgGLife TechnologiesA11029استخدم عند التخفيف 1:200. قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه.
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA21206استخدم عند 1:200 تخفيف.  قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA10042استخدم عند تخفيف 1: 200. قد يكون ضارا إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418قابل للاشتعال.
Dumont # 5 ملقط Inox (أطراف قياسية / مستقيمة)أدوات العلوم الدقيقة11251-20حاد!
FBS HyClone مصل الأبقار الجنينية ثيرموفيشر SH3091003غير خطرة.
فيشر العلمي Ocelot الدوارفيشر Scientific05-450-21أي دوار مع التحكم اليدوي في السرعة مناسب.
حوض أسماك المحيط الفوري بيتكو1373684غير خطرة.
الميثانول (خالي من الأسيتون)سيجما ألدريتشM1775قابل للاشتعال: سام عن طريق الاستنشاق والابتلاع والاتصال.
ميثيل السليلوزسيجما ألدريتشM0387-1006غير خطر.
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتشP6148قابل للاشتعال: سام عن طريق الاستنشاق والابتلاع والاتصال.
مسبار (بزاوية 80 قصيرة / 15.5 سم / 0.15 مم قطر الطرف)أدوات العلوم الدقيقة10140-02حاد!
PronaseRoche11459643001غير خطرة.
بقعة بيركسفيشر العلمية13-748Bغير خطرة.
نقل الماصات ، سامكو للأغراض العامةThermo-Scientific204غير خطرة.
Triton X-100Sigma AldrichT8787مهيج: ضار عن طريق الابتلاع أو التلامس.
توين -20سيجما ألدريتشP7949غير خطرة. تشمل العلامات التجارية الأخرى VWR # 97063-872.
قد ملح لوحة

المراجع

  1. Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621-632 (2010).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 231-241 (2008).
  3. Eimon, P. M., et al. Delineation of the cell-extrinsic apoptosis pathway in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1619-1630 (2006).
  4. Jette, C. A., et al. BIM and other BCL-2 family proteins exhibit cross-species conservation of function between zebrafish and mammals. Cell Death Differ. 15, 1063-1072 (2008).
  5. Kratz, E., et al. Functional characterization of the Bcl-2 gene family in the zebrafish. Cell Death Differ. 13, 1631-1640 (2006).
  6. Sidi, S., et al. Chk1 suppresses a caspase-2 apoptotic response to DNA damage that bypasses p53, Bcl-2, and caspase-3. Cell. 133, 864-877 (2008).
  7. Zhao, X., et al. Interruption of cenph causes mitotic failure and embryonic death, and its haploinsufficiency suppresses cancer in zebrafish. J. Biol. Chem. 285, 27924-27934 (2010).
  8. Yager, T. D., Ikegami, R., Rivera-Bennetts, A. K., Zhao, C., Brooker, D. High-resolution imaging at the cellular and subcellular levels in flattened whole mounts of early zebrafish embryos. Biochem. Cell Biol. 75, 535-550 (1997).
  9. Furutani-Seiki, M., et al. Neural degeneration mutants in the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 229-239 (1996).
  10. Sorrells, S., et al. Ccdc94 Protects Cells from Ionizing Radiation by Inhibiting the Expression of p53. PLoS Genet. 8, (2012).
  11. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
  12. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the developing zebrafish embryo. Dev. Biol. 240, 123-142 (2001).
  13. Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. Programmed cell death during Drosophila embryogenesis. Development. 117, 29-43 (1993).
  14. Beers Jr, R. F., Hendley, D. D., Steiner, R. F. Inhibition and activation of polynucleotide phosphorylase through the formation of complexes between acridine orange and polynucleotides. Nature. 182, 242-244 (1958).
  15. Delic, J., Coppey, J., Magdelenat, H., Coppey-Moisan, M. Impossibility of acridine orange intercalation in nuclear DNA of the living cell. Exp. Cell Res. 194, 147-153 (1991).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).
  17. Shin, J., Park, H. C., Topczewska, J. M., Mawdsley, D. J., Appel, B. Neural cell fate analysis in zebrafish using olig2 BAC transgenics. Methods Cell Sci. 25, 7-14 (2003).
  18. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev. Biol. 227, 279-293 (2000).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

3
تحليل موت الخلايا المبرمج في أجنة أسماك الزرد عن طريق التألق المناعي الكامل للكشف عن الكاسباز المنشط 3
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.