مقالة منهجية

صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

12.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51076

⸱

أبريل 8, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Clinic of Anesthesiology, Intensive Care Medicine and Pain Therapy, Goethe-University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

موجات الصدمة في الوقت الحاضر معروفة جيدا لآثارها التجدد. لذا في المختبر التجارب هي من اهتمام متزايد. لذا طورنا نموذجا لفي المختبر صدمة موجة المحاكمات (IVSWT) التي تمكننا من تقليد في ظروف الجسم الحي وبالتالي تجنب الآثار المادية تشتيت.

الملخص

موجات الصدمة في الوقت الحاضر معروفة جيدا لآثارها التجدد. وأظهرت نتائج البحوث الأساسية التي لا تسبب موجات الصدمة حافزا البيولوجية لاستهداف الخلايا أو الأنسجة من دون أي ضرر لاحق. وبالتالي، في التجارب المختبرية ذات أهمية متزايدة. وقد وصفت وسائل مختلفة لتطبيق موجات الصدمة على الثقافات الخلية. بشكل عام، والتركيز كل النماذج القائمة على كيفية تطبيق أفضل موجات الصدمة على الخلايا.

ومع ذلك، لا يزال هذا السؤال: ماذا يحدث لموجات بعد اجتياز خلية ثقافة؟ الفرق من مقاومة الصوتية من مستنبت الخلية والهواء المحيط هو أن عالية، أن أكثر من 99٪ من موجات الصدمة ينعكس! لذا قمنا بتطوير النموذج الذي يتكون أساسا من وعاء زجاجي بنيت التي تسمح للموجات لنشر في الماء بعد اجتياز ثقافة الخلية. هذا يتجنب الآثار التجويف فضلا عن انعكاس الموجات التي من شأنها أن تعكر صفو إلا تلك القادمة. وايعشر هذا النموذج ونحن قادرون على محاكاة الظروف في الجسم الحي وبالتالي كسب المزيد والمزيد من المعرفة حول كيفية يحصل ترجمة التحفيز المادي للموجات صدمة في إشارة الخلية البيولوجية ("mechanotransduction").

المقدمة

موجات الصدمة هي موجات ضغط الصوت الناتجة عن الافراج المفاجئ للطاقة، على سبيل المثال. كما الرعد عند البرق. في الطب وقد استخدمت موجات صدمة لأكثر من 30 عاما في تفتيت الحصى لتفكك حصى الكلى. منذ الاكتشاف العرضي للالحرقفي سماكة العظام في المرضى الذين تفتيت الحصى في 1980s في وقت مبكر، وأجريت أولى الدراسات لتقييم تأثير العلاج موجة الصدمة (سبحانه وتعالى) على العظام الشفاء 1. نتائج باهرة لتحسين الشفاء من nonunions العظام الطويلة يمكن ملاحظة 2. في وقت لاحق، تم توسيع مؤشرات لجروح الأنسجة الرخوة 3. وأظهرت نتائج البحوث الأساسية التي لا تسبب موجات الصدمة حافزا البيولوجية إلى الأنسجة المستهدفة دون أي ضرر لاحق. ويتبع الافراج عن عوامل النمو عائية (مثل VEGF، PlGF، جمعية جيل المستقبل) من خلال الأوعية الدموية كبيرة. أدى هذا إلى مزيد من التوسع في المؤشرات نحو الأمراض الدماغية. أظهرت مجموعتنا وآخرون ممثل المؤسسة إيجابيةإلخ من سبحانه وتعالى على مرض القلب الإقفاري في النماذج الحيوانية، وكذلك في التجارب السريرية 4-6.

ومع ذلك، لا تزال الآلية الدقيقة لكيفية ترجمة الحافز المادي للسبحانه وتعالى في إشارة البيولوجية (mechanotransduction) مجهولة إلى حد كبير. كما الاهتمام سبحانه وتعالى من عدة مجالات الطب زيادات مستمر، والسعي لآلية يتم الحصول على أكثر وأكثر كثافة. لذلك، في المختبر التجارب صدمة الموجة تكتسب أهمية. إلى جانب الحد من التجارب على الحيوانات والفعالية من حيث التكلفة، وأكبر ميزة في المختبر صدمة الموجة العلاج (IVSWT) قد تكون إمكانية دراسة سلوك معين من نوع خلية معينة. في موجة الصدمة بوساطة تجديد الأنسجة على الأرجح وتشارك جميع الخلايا من الأنسجة المعالجة، وتناقش حتى الآثار النظامية. ومع ذلك، كل نوع من الخلايا تلعب دورا محددة ولها وظيفة جوهرية خاصة بها. IVSWT تمكننا من الكشف عن هذا خاصة على وظيفةالثانية مما يعطينا فهم أفضل للعمليات الأساسية المعقدة.

المعرفة اليوم حول آثار موجة صدمة على الثقافات الخلية يتضمن زيادة الانتشار، تغيير مستقبلات غشاء الخلية، وزيادة وتسريع تمايز الخلايا، وإطلاق سراح من عوامل النمو والكيماوي جاذبة فضلا عن زيادة الهجرة الخلية 7-9.

وقد وصفت الآثار المادية تشتيت في معظم نماذج في المختبر طرق مختلفة لتطبيق موجات الصدمة على الثقافات الخلية. هذه الحقيقة يؤدي إلى المشكلة أنه من الصعب للغاية لمقارنة النتائج، والظروف المادية من التحفيز الخلية هي مختلفة تماما بين هذه النماذج. بشكل عام، والتركيز كل النماذج القائمة على كيفية تطبيق أفضل موجات الصدمة على الخلايا.

ومع ذلك، لا يزال هذا السؤال: ماذا يحدث لموجات بعد اجتياز خلية ثقافة؟ المشكلة الرئيسية هي أن اختلاف الصوتيةمقاومة من مستنبت الخلية والهواء المحيط هو أن عالية، أن أكثر من 99٪ من موجات الصدمة ينعكس الشكل 1.

بسبب الاختلاف في مقاومة الصوتية من وسائل الإعلام اثنين تنعكس ليس فقط على موجات ولكن يحدث انتهاء مرحلة التحول من 180 درجة مما أدى إلى القوات الشد القوي للخلايا الشكل 2.

يتم تعريف مقاومة الصوتية بوصفها نتاجا لكثافة مادة ولها Z سرعة الصوت = ρ خ ج. للمياه مقاومة الصوتية هو ZWater = 1،440،000 نانوثانية / م 3، لأنها ليست سوى الهواء 420 نانوثانية / م 3. الفرق كبير من هذه القيمتين النتائج في التأمل ومرحلة التحول من موجات الصدمة. مرحلة التحول يتحول نبض الضغط الايجابي إلى موجة الشد.

حتى لو كان هذا قوة الشد ليست ضارة للخلايا، كونها تتعارض مع فكرة محاكاة آثار موجة الصدمة في الجسم الحي في المختبر. في الجسم الحي هذهقوات الشد بالكاد تحدث نتيجة لهياكل الجسم كبيرة.

وعلاوة على ذلك، والجزء الخلفي تشغيل موجات يمكن حتى تعكر صفو تلك الواردة. قد يسبب هذا التدخل. ومن المعروف نوعين من التدخل. تدخل بناءة يعني أن يتم إضافة كل من موجات مما يؤدي إلى تضاعف السعة الشكل 3. يحدث التدخل المدمرة إذا تلبية موجات على طرفي نقيض. أنه يسبب الغاء موجات (الشكل 3). وبالتالي، IVSWT يحتاج إلى النموذج الذي تمكن موجات صدمة للنشر بعد اجتياز ثقافة الخلية.

IVSWT حمام مائي

الاعتبارات التالية المخاوف المذكورة أعلاه تقودنا إلى تصميم حمام مائي لتفادي المشاكل المذكورة الشكل 4. في الأساس، فإنه يتكون من زجاجي بني الحاويات مع غشاء لتوصيل كل نوع من موجة الصدمة قضيب. للاقتران بين هذا الغشاء ونقل قضيب الموجات فوق الصوتية جنرال الكتريكل لابد من استخدامها. يتم تعبئة حمام الماء بالماء degassed لتجنب التجويف يمكن أن تحدث إذا كان soluted الغاز داخل الماء. ألف سخان في أسفل مع جهاز استشعار درجة الحرارة مرتبطة إلى وحدة تحكم تمكن لتنظيم درجة الحرارة لتقليد في الجسم الحي والظروف لتجنب مزارع الخلايا ليبرد أثناء العملية. ويمكن عقد درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال عليه في حاضنة. حامل لعينات الخلايا يسمح لتخبط أي نوع من قارورة الثقافة أو أنبوب. وبالتالي، يتعين على السفينة العينة المراد شغلها تماما مع الثقافة المتوسطة، وفقاعات الهواء ستمنع موجات الصدمة! اسفين على شكل امتصاص في الجدار الخلفي للحمام يدمر موجات لكي لا ينعكس وتشغيل مرة أخرى لتفادي أي تشويش.

وثمة ميزة أخرى لنماذج IVSWT الآخر هو إمكانية متفاوتة المسافة بين قضيب وقوارير الثقافة. نتائج مجموعتنا والآخرين الذين يستخدمون ليالي هذا النموذج بوضوحكيف أن كل نوع من الخلايا يتفاعل على وجه التحديد جدا لمعلمات معاملة مختلفة. وعلاوة على ذلك، وتحديد المسافة بين مصدر موجات وعينة أمر بالغ الأهمية، لأنها تتيح لنا السيطرة على الخلايا لتكون في موضع معين في ما يتعلق محور قضيب موجة الصدمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

إذن الأخلاقية

بعد الحصول على الموافقة المسبقة الخطية من المرضى، تم الحصول على الحبل السري من العملية القيصرية في قسم أمراض النساء لعزل الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVECs). أعطيت إذن من لجنة الأخلاق في جامعة انسبروك الطبية (رقم UN4435).

1. إعداد حمام الماء IVSWT

  1. إعداد 3.5 لتر من ماء الصنبور في دبابة المناسبة. يحتاج الماء إلى أن يسخن إلى 37 درجة مئوية (انظر البروتوكول 6).
  2. ملء الماء في حمام مائي حتى مستوى المياه ما يقرب من 3 سم تحت الحافة. مانع لتغطية كامل الغشاء بالماء. وسوف يتطلب ذلك ما يقرب من 3.5 استعداد L.
  3. توصيل جهاز استشعار درجة الحرارة لإمدادات الطاقة.
  4. وضع أجهزة الاستشعار في تركيب المقصود على الجدار الخلفي من حمام الماء.
  5. ربط التدفئة لإمدادات الطاقة من أجهزة الاستشعار درجة الحرارة. لا تفعل هذا دونأن المياه في الحمام كما سخان إذابة زجاجي.
  6. انتظر حتى وصلت درجة حرارة الماء ثابتة من 37 درجة مئوية. حرك الماء بانتظام مع بعض نوع من عصا لضمان درجة حرارة ثابتة طوال حمام الماء.

2. إعداد خلايا وقوارير الثقافة

  1. خلايا البذور أكثر من ليلة في الكثافة المطلوبة في قوارير T25 الثقافة أو ثقافة الخلايا في قوارير مباشرة حتى وصلت إلى نقطة التقاء المطلوب.
  2. قبل التجربة، محاذاة عموديا القوارير.
  3. ملء قوارير الثقافة مع ثقافة متوسطة حتى الحق دون أعناقهم. لا تملأ كثيرا المتوسطة في قوارير كوسط على اتصال في الرقبة أو إغلاق الغطاء سوف تحصل الملوثة.
  4. المسمار القوارير مع قبعات صلبة دون مرشحات لمنع التلوث من المياه. مانع أن المياه في الحمام والحمام نفسه ليست عقيمة.
  5. ختم قبعات مع parafilm قبل الإدراج في حمام مائي.
    6. <لى> إصلاح قوارير الثقافة مختومة في موقف المقدمة.
  6. إدراج قارورة ثابتة في حمام مائي. الحرص على أن منتصف القارورة ثقافة الخلية هو على نفس الارتفاع كمركز للغشاء صدمة موجة قضيب لل. خط على جانب حمام يرشدك.

3. تحديد العلاج معلمات

  1. تحديد المسافة بين مصدر موجة الصدمة والعينة. تحديد المعلمات العلاج المثالي من خلال إجراء التجربة الرائدة لتقصي معلمة كما هو موضح في الشكل (6).
  2. اختيار العلاج المناسب المعلمات (كثافة تدفق الطاقة، والتردد) على الجهاز موجة الصدمة. مرة أخرى، راجع الشكل 6.

4. تطبيق صدمة الموجة

  1. وضع الكثير من المبالغ المتاحة تجاريا هلام الموجات فوق الصوتية على انتقال الصدمة موجة قضيب وكذلك على الغشاء من حمام الماء. هذا هو لضمان اقتران. ينبغي أن يكون هناك هواء أو فقاعات الهواء بين قضيب والغشاء كماانها تمتص موجات الصدمة.
  2. ربط قضيب لغشاء والاحتفاظ بها مستقرة في وسط الغشاء. الحرص على أن يتم محاذاة أفقيا.
  3. تأكد من أن الوضع الرأسي الصحيح من التحقيق داخل حمام ماء يتماشى مع وضع علامات وأشار في جانب من الحمام.
  4. عقد المراكز من قضيب ومستقرة قارورة في خط أفقي.
  5. تنشيط الجهاز موجة الصدمة وتطبيق نبضات مع الحفاظ على قارورة الثقافة فضلا عن قضيب في وضع مستقر خلال الإجراء بأكمله.

5. بعد العلاج

  1. أخذ قارورة الثقافة للخروج من حمام الماء.
  2. جففه مع المناشف الورقية المشتركة.
  3. مسح القارورة بدقة مع وكلاء تطهير.
  4. إزالة Parafilm ختم وغطاء.
  5. ماصة متوسطة داخل القوارير في أنابيب الطرد المركزي.
  6. أجهزة الطرد المركزي بشكل مناسب. المعلمات الطرد المركزي تعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة، على سبيل المثال. لHUVECs، استخدم 290 غرام عند درجة حرارة الغرفة.
  7. إضافة 5ml من خلية ثقافة المتوسط ​​إلى القارورة. resuspend الكرية خلية طرد مع 2 مل من مستنبت الخلية. ماصة تعليق في القارورة. وبالتالي، شظايا الخلية أو الخلايا التي قد تكون منفصلة أثناء العلاج لا تضيع.

المزالق

  1. ينبغي أن يتم التحضير وكذلك العلاج تحت ظروف معقمة داخل تدفق الصفحي لتجنب التلوث من ثقافة الخلية.
  2. ينصح جيدة ممارسة زراعة الخلايا لتجنب التلوث من تحقيقات. على وجه الخصوص فمن المستحسن تعقيم خارج القوارير بشدة قبل وضعها مرة أخرى إلى الحاضنة. الحمام المائي، وكذلك داخل المياه، ليست عقيمة!
  3. لا تقم بتوصيل سخان لإمدادات الطاقة ما لم يتم تعبئة حمام ماء مع الماء لتجنب الأضرار التي لحقت زجاجي بني الحمام.
  4. استخدام كميات سخية من هلام الموجات فوق الصوتية على تطبيق ورقة موجة الصدمةicator لضمان اقتران السليم وانتشار الموجات في الحمام. فقاعات الهواء الجوي، وحتى الصغيرة تفعل استيعاب موجات الصدمة!
  5. التحقق من موقف من تحقيقات داخل حمام ماء فيما يتعلق قضيب لضمان معاملة منطقة النمو بأكملها.
  6. لا دونك تحقيقات عميقة جدا في الماء لتجنب التلوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام الطريقة الموصوفة طبقنا موجات الصدمة إلى الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVECs) أننا المذكورة معزولة من الحبل السري. تم الحصول على الحبل السري من العمليات القيصرية الاختيارية.

وعولج HUVECs في التقاء 90٪ في ثقافة خلية قارورة T25 مع نظام العلاج موجة الصدمة الكهربائية و. وكانت المعلمات العلاج كثافة تدفق الطاقة من 0.1 ميغا جول / مم 2 وتردد 5 هرتز. تم تطبيق 300 نبضات من مسافة 5 سم من مصدر مو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أهمية النموذج المقترح لفي المختبر صدمة الموجة العلاج هو حقيقة أن موجات يمكن نشر بعد اجتياز ثقافة الخلية على النقيض من النماذج الحالية. وبالتالي، والآثار المادية المزعجة مثل القوات الشد يمكن تجنبها. نموذج أكثر شبها في ظروف الجسم الحي من ذلك من قبل الآخرين لتطبيق موجات قوارير زراعة الخلايا بشكل مباشر.

ميزة إضافية وهي إمكانية متفاوتة المسافة بين مصدر موجة الصدمة والخلايا. وهذا لن يكون ممكن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

المؤلفين أشكر راينر Schultheiss وولفغانغ شادن لإلهامهم لهذا النموذج. كما نشكر المسيحية Dorfmüller لله كل الجهود الجبارة الوقت لدعم البحوث لدينا.

شكرا جزيلا لروبرت Göschl وهانز Hohenegger لتحقيق التقنية حذرا من أفكارنا!

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جهاز موجة الصدمة OrthogoldTissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA & ndash; المصنعة من قبل MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany
IVSWT Water Bath V2.0Johann Hohenegger - المنتجات
EBM-2 Basal Medium 500 m + EGM-2 SingleQuot Suppl. & عوامل النموLonzaCC-3156 & CC-4176تم استخدام هذه الوسيلة للتجارب المعروضة مع HUVECs لملء قارورة زراعة الخلية. بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى، استخدم الوسيط الموصى به.
Pechiney  Parafilm M PM996< / a>Pechiney تغليف بلاستيكPH-LF-PM996-EA في labplanet.comلختم قوارير Falcon
الماصات المصلية 25 ملBecton Dickinson Labware357525
CellMate II Serological Pipette  Matrix Technologies
Skintact Gel بالموجات فوق الصوتيةSkintactUL-01 250 مل
T25 قوارير ثقافة الخلاياCOSTAR3056
مطهر MikrozidSch ü. lke
3.5 لتر ماء
مناشف
التقنيةمنزوع الغاز ورقية

المراجع

  1. Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
  2. Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
  3. Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
  4. Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
  5. Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
  6. Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
  7. Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
  8. Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
  9. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
  10. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة