مقالة منهجية

الفصل الآلي لل C. ايليجانس المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

DOI:

10.3791/51090

⸱

مارس 21, 2014

 ,  , 
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وwormsorter يسهل شاشات الوراثية في انواع معينة ايليجانس عن طريق الفرز الديدان وفقا لتعبير عن صحفيين الفلورسنت. هنا، نحن تصف استخدام جديدة: الفرز وفقا لاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP، ونحن نوظف ذلك لدراسة دور غير مفهومة الاعتراف الممرض في الشروع في الاستجابات المناعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وwormsorter أداة مماثلة لآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية التي يتم استخدامها في دراسات ايليجانس انواع معينة، وعادة لفرز الديدان على أساس التعبير عن مراسل الفلورسنت. هنا، نسلط الضوء على استخدام بديل من هذا الصك، لفرز الديدان وفقا لدرجة الاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP. يسمح لنا هذا الاستخدام الجديد لمعالجة العلاقة بين الاستعمار من الأمعاء دودة وتحريض الاستجابات المناعية. في حين C. وقد تم توثيق ايليجانس الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض المختلفة، فإنه لا يزال غير معروف ما يبدأ بها. الاحتمالات الرئيسيان (والتي لا يستبعد بعضها بعضا) هي الاعتراف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، والكشف عن الأضرار الناجمة عن العدوى. التفريق بين الاحتمالين، يجب أن تنفصل التعرض لمسببات المرض من الأضرار التي يتسبب بها. لتمكين wormsorter فصل الديدان التي كانت مستعمرة على نطاق واسع من قبل الغرام نالممرض egative الزائفة الزنجارية، مع الضرر المحتمل الناجم عن الحمل الممرض، من الديدان التي تعرضت بالمثل، ولكن لا، أو هامشيا، المستعمر. واستخدمت هؤلاء السكان متميزة لتقييم العلاقة بين الممرض الحمل وتحريض الاستجابات المناعية النسخي. وتشير النتائج إلى أن اثنين وفصلها، ودعم إمكانية الاعتراف الممرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التلقائي الفرز الدودة يشبه إلى حد كبير نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتعمل من خلال قياس إشارة الفلورسنت في دودة (شريطة عادة عن طريق التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات مراسل) لأنها تمر في أنبوب تقويمها، مما يتيح إعادة توجيه إما إلى أنبوب جمع / جيد أو إلى حاوية النفايات وفقا لالنابضة المعلمات التي وضعتها الباحثة 1. وwormsorter يمكن أن تسهل البحث في نواح كثيرة؛ مثال على توظيفها كأداة تحليلية هو دراسة أنماط الزمانية المكانية التي تلت النشاط المروج لما يقرب من 1،000 الجينات 2.
ومع ذلك، فإن الاستخدام الرئيسي للwormsorter في شاشات الجينية، وبعد الهدف مستويات التعبير الجيني أو توطين بروتين فلوري على طول محور الدودة 3-5.

هنا، نحن تصف تطبيق جديد لwormsorter، في أعقاب الاستعمار من دودة من قبل الممرض الموسومة fluorescently. مع هذا كأداة ركزنا على العلاقة بين pathogأون الاستعمار / تحميل والاستجابة المناعية، للحصول على أفكار جديدة في الآليات المسؤولة عن الشروع في الاستجابات المناعية في دودة.

في جميع الكائنات الحية تقريبا درست حتى الآن، الشروع في الاستجابات المناعية الفطرية لمسببات الأمراض الميكروبية يتوقف على الاعتراف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، و / أو الخطر / الضرر المرتبط أنماط الجزيئية (DAMPs) 6،7. وتشمل الثانية، وكلاهما صدر الجزيئات (مثل ATP 8)، والبروتينات تغييرها أو علامات أخرى من العمليات الخلوية تغير 9،10؛ الهياكل الميكروبية يتم حفظها الأولى التي تشمل مكونات جدار الخلية الجرثومية، سوط منها، أو طبقة ثنائية الدهن 6 منه. يتم التعرف على كلا النوعين من الإشارات من البروتينات تسمى مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير)، التي تقوم عليها محددة وملزمة من جزيء نمط تفعيل سلسلة من الأحداث التي أدت إلى استجابة واقية. C. وقد ايليجانس مفيدة للغاية باعتبارها tractaنموذج بلي لتشريح مختلف جوانب التفاعلات المضيف الممرض، ولكن الشيء الوحيد الذي لا يمكن فهمه جيدا هو كيف يتم البدء الاستجابات المناعية في دودة. وقد تبين أن أيا من المستقبلات المفترضة التي هي orthologous لمستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) في الكائنات الحية الأخرى لربط PAMPs، والعديد من orthologs من خنازير أن تقوم بدور محوري لالاستجابات المناعية في الكائنات الحية الأخرى تظهر مساهمة محدودة من المستغرب أن الاستجابات دودة الممرض والمقاومة. على سبيل المثال، الرقم مستقبلات ذبابة الفاكهة، وهو أمر ضروري لمقاومة مسببات الأمراض إيجابية الجرام، تتمثل في C. ايليجانس من قبل homolog الوحيد، تول-1، مما يسهم في الحماية من غرام سلبي السالمونيلا التيفية الفأرية الممرض 11، ولكن ليس من سلبية الغرام، ومسببات الأمراض أو إيجابية أخرى اختبار 11،12. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات تشير إلى أن الاستجابات المناعية يمكن أن يتسبب من خلال تعطيل البروتين الخلوي الترجمة حكما أدى بعض تشير إلى أن C. ايليجانس في المقام الأول بالكشف عن DAMPs 9،13،14. ومع ذلك، تشير التقارير التي تصف قدرة مسببات الأمراض القتلى للحث على الاستجابات المناعية التي PAMP ملزمة يجوز لها دور هام في التعرف على العوامل المسببة للأمراض في C. ايليجانس 15،16. العمل السابق مع التركيز على الاستجابات المناعية في سن متطابقة وراثيا متزامنة C. ايليجانس السكان، تظاهر تقلب فردية كبيرة في استعمار الامعاء من البكتيريا سلبية الغرام الممرض الزائفة الزنجارية.

ومع ذلك، وتعامل دراسات النسخي هؤلاء السكان المستعمر بنسب مختلفة، واحدة كيان 17،18. الاستفادة من هذا التباين، وضعنا بروتوكولا مع التركيز على wormsorter الآلي لفصل السكان المستعمر بشكل مختلف من انواع معينة ايليجانس تتعرض ل، معربا عن GFP P. الزنجارية. دراسة التعبير الجيني في السكان المستعمر بشكل مختلف، القوات الجويةتقييم litated للعلاقة بين الحمل الممرض (والأضرار المرتبطة بها) والاستجابات المناعية، وقدمت رؤى جديدة حول التعرف على العوامل المسببة للأمراض في C. ايليجانس 19. أدناه ونحن تصف البروتوكول، والتي يمكن تطبيقها لفرز المصابين الديدان الممرض أي fluorescently المسمى.

إلى المستخدمين المحتملين تجدر الإشارة إلى أن عدد الديدان المطلوب تسويتها يعتمد على طبيعة التحليلات والبروتوكولات اللاحقة في الاستخدام. على سبيل المثال، في حالة تحليل ميكروأري التعبير الجيني،> سيطلب 1،000 الديدان للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي، إذا تم استخدام البروتوكولات القياسية، ولكن ~ 100 الديدان يكفي إذا استخدمت التضخيم، مما يسمح بسرعة جمع المواد وبالتالي تقليل الإجهاد ل الديدان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحصول على الثقافة المتزامنة من النشء الحيوانات

  1. تنمو الديدان على عدة لوحات NGM المصنف مع OP50-1 E. البكتيريا القولونية (10X تتركز من ثقافة مشبعة) حتى وصلت إلى العديد من الديدان مرحلة حامل.
  2. علاج الحيوانات مع الحل حامل البيض الإعدادية للحصول على الثقافة متزامنة (البيض).
  3. البيض وحة على عدة 60 ملم لوحات NGM المصنف مع 10x المركزة OP50-1 في كثافة حوالي 150-200 بيضة / لوحة.
  4. احتضان لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 2 يوم (حتى وصلت الديدان إلى L4 - يونغ مرحلة الكبار).

2. إعداد الزائفة الزنجارية لوحات واصابة الديدان

  1. في يوم من البيض الإعدادية (الخطوة 1.1) تطعيم ثقافة PA14 :: GFP في 2 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على B ريفامبيسين الملك في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع الإثارة O / N.
  2. لوحة للPA14 :: GFP طريق مسدودتلح على العديد من لوحات القتل البطيء (SKP) حسب الحاجة للمقايسة. على كل 150 ملم SKP طبق بتري ماصة 75-100 ميكرولتر الثقافة المشبعة وموزعة بالتساوي باستخدام رش زجاجية معقمة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
  3. إزالة لوحات من الحاضنة، والسماح لهم لتبرد لRT (~ 20 دقيقة). باستخدام العازلة M9، وغسل الديدان من الخطوة 1.4 على PA14 :: لوحات GFP في حجم الحد الأدنى من السائل. عند استخدام 150 مم لوحات، وعدة مئات من الديدان يمكن وضعها على لوحة واحدة.
  4. احتضان لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 18-21 ساعة. لP. الزنجارية تتعرض الديدان الشباب البالغين، وهذا هو الوقت نافذة عرض التوزيع الأمثل للالمستعمرة ضد الحيوانات noncolonized.

3. إعداد Wormsorter

قبل تنفيذ نموذج هذا النوع، تأكد من أن الجهاز يعمل بشكل صحيح. ويمكن الحصول على التفاصيل في http://www.unionbio.com/support/documents.aspx؟id=43، وعشروترد أدناه البريد الخطوات الأساسية.

  1. تعيين ضغط صمام غمد إلى حوالي 5 رطل (4.5-5.5 المدى).
  2. للتحقق من أن السائل غمد معدل التدفق المناسب، ووضع أنبوب 15 مل المخروطية تحت موزع، بدوره على صمام غمد، وإيقاف صمام فارز. عقد أنبوب تحت موزع لمدة 60 ثانية. يجب أن تكون وحدة التخزين في أنبوب مل 9-10. إذا كان خارج هذا النطاق، وضبط ضغط صمام غمد وفقا لذلك.
  3. لضمان أن السائل سوف غمد معدل التدفق (مجموعة كما في الخطوة 3.2) تسمح الفرز دقيقة، واختبار معدل الفرز باستخدام الجسيمات 40 ميكرون التحكم:
  4. إيقاف صمام غمد. إضافة حوالي 25 مل من السيطرة حل الجسيمات إلى الخزان.
  5. بدوره على صمام غمد، وصمام العينة.
  6. على برامج الكمبيوتر، انتقل إلى "مراقبة الوضع الجسيمات" وانقر عليه.
  7. تأكد من أن معدل تدفق الجسيمات هي جسيمات ~ 5-8 / ثانية، مع TOF (وقت الرحلة) تقارب العرضللجسيمات، 40 ميكرومتر. مثل هذا TOF يشير إلى أن واحدة 40 ميكرون الكائن فقط يمر في كل مرة. إذا كانت القيم هي خارج هذا النطاق، وضبط الإعدادات (بعد توجيهات أعلاه) وفقا لذلك.

4. الفرز المستعمرة مقابل Noncolonized الديدان

  1. باستخدام M9، وغسل الديدان في أنابيب مخروطية 15 مل. تسمح الديدان البالغة لتنزل الى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية وإزالة طاف. ملء الأنبوب مع M9 الطازجة. كرر هذه العملية 3-4X. هذا يزيل نسبة كبيرة من اليرقات وكذلك البكتيريا الزائدة ويستغرق حوالي 10 دقيقة.
  2. إضافة الديدان إلى الخزان wormsorter مع بقضيب صغير خلط بلطف.
  3. ضبط كسب إشارة أولية عن طريق تعيين PMT الأخضر إلى 600 والأحمر والأصفر PMT إلى 200.
  4. ستبدأ بالحصول على بيانات لضبط الإعدادات.
  5. تهدف لمعدل النوع من الأحداث 25-30 (الديدان) في الثانية. إذا كان معدل عدد مرتفع جدا، ويخفف من الديدان في الخزان مع M9 وفقا لذلك. إذا كان معدل هوس منخفضة، وإضافة المزيد من الديدان في حجم صغير من M9.
  6. إذا كانت التجربة يتطلب فصل صارمة للغاية من المستعمرة ضد الديدان noncolonized، تعيين "الاختيار صدفة" إلى "نقية". وهذا يضمن أنه في حال حدوث كائنين قريبة جدا من بعضها البعض أو في نفس قطرة، وآلة ترفض الانخفاض بدلا من جمع مثل هذه المعلومات.
  7. لفرز السكان من الاهتمام، ووضع البوابات حول محاور مشيرا إلى حجم (للحصول على الديدان البالغة) وكثافة مضان (أي ارتفاع للاستعمار، وانخفاض لnoncolonized). يجب تحديد قيم مضان النابضة تجريبيا.
  8. وضع لوحة متعددة جيدا أو طبق بتري تحت موزع لجمع الديدان ثم فتح صمام نوع لبدء الفرز الديدان.
  9. جمع عدد صغير من السكان من الحيوانات للتحقق تحت المجهر أن عدد السكان هو فرز السكان من الاهتمام. إن لم يكن، وضبط المعلمات النابضة وفقا لذلك والاستمرار في جمع العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عندما يقابل عمر، متطابقة وراثيا C. ويتعرض ايليجانس إلى P. الزنجارية، ويلاحظ توزيع واسعة في مستويات الاستعمار (الشكل 1A). مع مساعدة من بروتوكول الموصوفة هنا فصل كفاءة noncolonized من الديدان المستعمر لا يمكن أن يتحقق (الشكل 1B). على عكس الديدان noncolonized، تظهر الديدان المستعمر علامات التلف، مثل تباطؤ وانخفاض 19 التغوط. قد يكون هذا الأخير سبب لماذا الديدان التي استعمرتها P. الزنجارية يجدون صعوبة تطهي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة وصفنا يستفيد من وضع العلامات الفلورية الكيانات خارج دودة، لمتابعة التفاعلات بين دودة وبيئته. في حالة نقدم، واستند على الفصل وسم الممرض وكان يعمل لالديدان منفصلة مع الممرض الحمل الثقيل من تلك مع عدم وجود (أو الضوء) حمولة. العثور على لاحقة تحليل التعبير الجيني لا فرق في الاستجابات المناعية بين المجموعتين مما يوحي بأنها كانت مستقلة عن الحمل الممرض. وقد أظهرت إشارة أن يبدأ في مكان آخر استجابة لتترافق مع البكتيريا جسديا، بدلا من أن يفرز، مما يوحي بأن هذا قد يكون إشارة PAMP. معا، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفان بالشكر إلى مؤسسة إليسون الطبية لدعمهم. ونود أيضا أن نشكر أعضاء المختبر آبي Dernburg للحصول على المساعدة مع استخدام wormsorter.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
M9 Bufferمحضر في المنزلوصفة في wormbook.org
RifampicinSigmaR3501
محلول تحضير البيضالمحضر في المنزل50 مل ماء ؛ 40 مل مبيض ؛ 10 مل من 10 N هيدروكسيد الصوديوم
NGMلوحات المحضرة في المنزلوصفة في wormbook.org
لوحات SKPالمحضرة في المنزلالوصفة نفسها مثل NGM فقط 0.35٪ بيبتون بدلا من 0.25٪
جزيئات اختبار التحكمUnion Biometrica310-5071-001

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).
  2. Dupuy, D., et al. Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans. Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).
  3. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  4. Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans. Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).
  5. Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).
  7. Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).
  8. Mariathasan, S., et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
  9. Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149, 452-466 (2012).
  10. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  11. Tenor, J. L., Aballay, A. A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity. EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).
  12. Pujol, N., et al. A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).
  13. McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans. Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).
  14. Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling. Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).
  15. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, (2010).
  16. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. , (2011).
  17. Shapira, M., et al. A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).
  18. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. , 183 (2006).
  19. Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans. PLoS One. , 7 (2012).
  20. Jakobsen, H., et al. The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response. PLoS One. 8, (2013).
  21. Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiol. 12, 49 (2012).
  22. Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).
  23. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Pseudomonas aeruginosa NGM GFP

مقالات ذات صلة