مقالة منهجية

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

DOI:

10.3791/51095

⸱

فبراير 22, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Warwick, 2The Sainsbury Laboratory, Norwich Research Park, 3Research School of Biology, The Australian National University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النباتات التكيف بسرعة مع تغير البيئات نظرا لوضع تصور وأنظمة إنذار. خلال الهجوم الممرض والنباتات الاستجابة السريعة للعدوى عن طريق تجنيد وتنشيط مجمعات المناعي. ويرتبط التنشيط في مأمن من المجمعات مع بعض التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات، مثل الفسفرة، ارتباط بالغليكوزيل، أو ubiquitination. وفهم كيفية فشلت هذه PTMs يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم تحقيق المقاومة.

نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لليسين الغنية تكرار ملزمة النوكليوتيدات (NB-LRR) تتفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من التعديلات بعد متعدية الخاصة بهم (PTMs). مع تعديلات صغيرة، وبروتوكول يمكن تطبيقها لتنقية البروتينات النباتية الأخرى المجمعات. ويستند هذا الأسلوب على التعبير عن إصدار الموسومة حاتمة من البروتين من الفائدة، والذي فيما بعد تنقيته جزئيا بذ مناعي وتعرض لمطياف الكتلة لتحديد التفاعل البروتينات وPTMs.

هذا البروتوكول يوضح أن: ط). ويمكن الكشف عن التغيرات الدينامية في PTMs مثل الفسفرة بواسطة مطياف الكتلة؛ الثاني). فمن المهم أن يكون بكميات كافية من البروتين من الفائدة، وهذا يمكن أن تعوض عن عدم وجود نقاء immunoprecipitate؛ الثالث). من أجل الكشف عن PTMs من البروتين من الفائدة، وهذا البروتين لابد من immunoprecipitated للحصول على كمية كافية من البروتين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مسارات المناعي تعتمد على مختلف التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات لتنبيغ بسرعة الإشارات وتنشيط الاستجابات المناعية 1. PTMs هي التعديلات الكيميائية السريعة، وعكسها، ومحددة للغاية من بنية البروتين التي يمكن أن تؤثر على التشكل البروتين، والنشاط، والاستقرار، والترجمة، والبروتين البروتين التفاعلات 2-4. في النباتات، وقد تم تحديد أكثر من 300 أنواع من PTMs بما في ذلك ubiquitination، sumoylation، الكبرتة، ارتباط بالغليكوزيل، والفسفرة 2،5. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة يسلط الضوء على أهمية PTMs في جوانب مختلفة من الحصانة محطة 1،5،6. الفسفرة البروتين، المرفق عكسها من مجموعة الفوسفات إلى سيرين، وبقايا ثريونين أو التيروزين هو منظم من العديد من الوظائف الخلوية وليس من المستغرب أن معظم درس غاية PTM دفاعا النبات يشير شلالات 5-11. التي تعتمد على الفسفرة الإشارات هي جزء لا يتجزأ من defe النباتبدأ تفعيل NSE بعد الإدراك خارج الخلية من الميكروبات عن طريق مستقبلات عبر الغشاء، أو الاعتراف الخلايا من البروتينات المقاومة متعددة المجالات 5،8.

عند غزو النباتات، يتم الكشف عن الميكروبات عن طريق مستقبلات غشاء البلازما تسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 12. خنازير المعروفة هي إما مثل مستقبلات البروتينات (RLPs) أو تحركات مثل مستقبلات (RLKs)، وكلاهما يحمل ectodomain ملزم يجند وعلى مسار واحد عبر الغشاء المجال. وعلى النقيض من RLPs، RLKs ديك مجال الخلايا كيناز 13-15. وectodomain من خنازير بربط الحفظ جزيئات ميكروب يسمى elicitor أنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) الرائدة، في حالة RLKs، لautophosphorylation ونقل الفسفوريل ضمن المجال داخل الخلايا 6، 16. المصب التي يسببها تصور الفسفرة من خنازير، الفسفرة اللاحقة للبروتينات حشوية بما في ذلك تحركات 17، 18، E3 ligases 19،-mitogen تنشيط تحركات البروتينات (MAPKs) 20، 21، تعتمد على الكالسيوم تحركات البروتينات (CDPK) 22، 23، وعوامل النسخ 24 و 25 يؤدي إلى الحصانة أثار PAMP (PTI).

بالإضافة إلى تصور خارج الخلية من قبل خنازير، ويتحقق الاعتراف الخلايا من مسببات الأمراض من خلال مستقبلات حشوية. هذه المقاومة متعددة المجالات (R) البروتينات تحتوي على متغير نطاق N-محطة، مركزية ملزمة النوكليوتيدات (NB) عزر، ويكرر-يسين الغنية C-محطة (LRR)، وبالتالي تسمى البروتينات NB-LRR 26، 27. البروتينات R تعترف مباشر أو غير مباشر جزيئات الفوعة المستمدة من الممرض دعا المستجيبات، والمعروف أيضا لاستهداف خنازير والعقد الأخرى في الجهاز المناعي. الاعتراف يدفع دفاعات قوية مما يؤدي إلى الحصانة أثار المستجيب (ETI) 28-31. البروتينات NB-LRR ديك requisiعزر الشركة المصرية للاتصالات ATP ملزم ضمن المجال NB 30، 32، لكنهم يفتقرون مجال كيناز. وقد تم الإبلاغ عن الفسفرة من المجالات الحفظ من NB-LRRS في مسح البروتين على نطاق واسع 33، ولكن أهميتها لETI غير واضح. على نحو مماثل لPTI، وتفعيل البروتينات NB-LRR يؤدي إلى الفسفرة من البروتينات السيتوبلازمية بما في ذلك MAPKs 34-37 وCDPKs 38-40. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي إلى الاعتراف المستجيب الفسفرة من البروتينات الإكسسوارات التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات NB-LRR 41. وتشمل بعض الأمثلة RIN4 (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) وحديد التسليح (الطماطم، مغد قوطة) البروتينات التي تتفاعل مع البروتينات NB-LRR، RPM1 42 و 43 و 44 الملف Prf، على التوالي. خلال العدوى عن طريق البكتيريا الزائفة syringae، البروتين المستجيب AvrB يدفع RIN4 الفسفرة، وعلى الأرجح من قبل مثل مستقبلات كيناز RIPK 45، 46. وبالمثل، في الطماطم وP. syringae المستجيبات AvrPto وAvrPtoB لحث الفسفرة من قدرة الإنطلاق 47. وعلى النقيض من RIN4 التي تفتقر مجال كيناز ويجب أن يكون عبر فسفرته، قدرة الإنطلاق هو كيناز نشطة قادرة على صناعة السيارات في الفسفرة 48 وعبر الفسفرة من ركائز 49، 50. في حين يتطلب قدرة الإنطلاق النشاط كيناز من أجل تعتمد على المستجيب بدء الإشارات، المسوخ قدرة الإنطلاق-كيناز القتلى لا تزال قادرة على إشارة على نحو المستجيب مستقلة 51. شرحنا في الآونة الأخيرة هذه الملاحظات من خلال إظهار أن المجمع الملف Prf / جهاز السياحة هو من oligomeric، التي تحتوي على العديد من الجزيئات الملف Prf وقدرة الانطلاق 52 وأن جزيئات جهاز السياحة داخل المجمع نفسه يمكن عبر الفوسفات بعضها البعض 47. اقترحنا نموذج التي جزيء واحد من حديد التسليح (استشعار) تتفاعل مع بروتين المستجيب، مما تسبب في تغير التشكل إلى البروتين NB-LRR (الملف Prf) وهذا بدوره ينشط جزيء قدرة الإنطلاق الثاني (المساعد) الطرافةهين المجمع. في وقت لاحق، والمساعد قدرة الإنطلاق جزيء عبر phosphorylates استشعار قدرة الانطلاق مما يؤدي إلى تنشيط كامل للمقاومة معقدة 47.

وتبين هذه الأمثلة أن تحديد مكونات مجمع المناعي وPTMs إمكاناتهم على الاعتراف المستجيب يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم transduced إشارات من المستجيب تصور لأهداف المصب. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لNB-LRR-التفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من PTMs بهم. نستخدم نيكوتيانا benthamiana ومجمع الطماطم الملف Prf / جهاز السياحة كنموذج، ولكن يمكن بسهولة أن تطبق نفس البروتوكول لRLKs من N. benthamiana وA. thaliana 53 مع تعديلات صغيرة كما وصفنا في البروتوكول.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. إعداد المواد النباتية والمخازن

  1. لN. benthamiana
    1. تنمو الأجرعية المورمة سلالات من الفائدة للتعبير عابر (في هذا المثال الملف Prf-FLAG، الملف Prf-3xHA، قدرة الإنطلاق-FLAG وناقلات الفارغة كعنصر تحكم) عن طريق هز (200 دورة في الدقيقة) في الثقافة السائل (L المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة) في 28 ° مئوية حتى مرحلة ثابتة.
    2. وجمع بيليه agrobacteria بواسطة الطرد المركزي (3،000 x ج لمدة 5 دقائق). تجاهل طاف و resuspend agrobacteria مكعبات العازلة في التسلل.
    3. قياس كمية agrobacteria عن طريق الحصول على الكثافة الضوئية (OD) قيمة بأفضل الامتصاصية من 600 نانومتر (عبس 600 نانومتر). ضبط OD من البكتيريا إلى 0،1-0،8.
    4. التسلل N. 4 الاسبوع القديمة النباتات benthamiana (22 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء) مع agrobacteria بواسطة هاند (مع حقنة needleless 1 مل) أو فراغ (إضافة 0.02٪ ت / ت السطحي).
      ملاحظة: استخدم أول ورقة موسعة تقريبا بالكامل، واثنين من الأوراق القديمة على الفور لأنجع تعبير البروتين. للكشف عن البروتينات ubiquitinated أو الأسيتيل التسلل أوراق مع 100 نيوتن متر MG-132 أو 100 نانوغرام / مل Trichostatin A، على التوالي، في 1 و 2 يوما بعد تسلل.
    5. حصاد الأوراق تسلل 2-5 أيام آخر تسلل والتجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحديد أفضل مستوى من التعبير عن بروتين من الفائدة مسبقا من قبل أخذ عينات على مدار الساعة من 5 أيام وكشف عن مستويات البروتين immunoblotting.
  2. لA. thaliana خطوط المعدلة وراثيا مستقرة
    1. تنمو A. thaliana البذور في 6 لوحات جيدة تستكمل مع 5 مل من السائل MS المتوسطة (1٪ ث / ت السكروز) لكل بئر. وضع 3-5 بذور (تعقيم والطبقية) من خط المعدلة وراثياالإهتمام أو خط السيطرة هو دون تغيير لكل بئر. يهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة يومين قبل نقل لوحة لغرفة النمو ويترك لمدة 2 أسابيع (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء).
    2. عينات الحصاد والتجميد في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: يمكنك استخدام كعنصر تحكم خط المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين لا علاقة لها مع نفس العلامة باسم البروتين من الفائدة.
  3. مخازن
    1. إعداد العازلة ألف دي الغاز المخزن المؤقت لمدة 1-2 ساعة (لRLKs، وغيرها من الغشاء ملزمة البروتينات والبروتينات النووية، إضافة 1٪ ت / ت IGEPAL CA-630 53).
      ملاحظة: يمكنك الاحتفاظ الاحتياطي A في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. يمكنك استخدام 1٪ ت / ت تريتون بدلا من IGEPAL CA-360.
    2. إعداد 80 مل من البرد العازلة B 1-2 على الأقل ساعة قبل الاستخراج.
      ملاحظة: نسبة مثالية من الأنسجة العازلة مقابل استخراج هو 01:04 (ث / ت).

2. استخراج البروتين

  1. فقط قبل استخراج تحضير 80 مل من البرد العازلة C. ملاحظة: إضافة 10 ميكرومتر MG-132 للكشف عن البروتينات ubiquitinated.
  2. طحن 20 غرام من N. benthamiana أنسجة (حوالي 15 ورقة) أو A. thaliana الشتلات (2-4 غ لكل لوحة 6 جيدا) في النيتروجين السائل باستخدام قذائف هاون ومدقة.
  3. إضافة 80 مل من البرد العازلة C إلى 20 غرام من الأنسجة الأرض، وتخلط جيدا، وذوبان الجليد على الجليد.
    ملاحظة: طحن جميع العينات في نفس الوقت (بروتين من الفائدة والسيطرة).
  4. التجانس مع 3 رشقات نارية من 10 ثانية لكل بأقصى سرعة مع الخالط الأنسجة (prechilled في 4 درجات مئوية). تصفية من خلال الأنسجة 22-25 ميكرومتر وأجهزة الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 ° C.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، التجانس مع هاون ومدقة prechilled الطازجة.
  5. لحجب وغسل الخطوات من المصفوفة تقارب، وإعداد 20 مل من العازلة D.
  6. كتلة 100 مل من مناسبة مصفوفة تقارب باستخدام 500 مل من البرد العازلة التي تحتوي على 1٪ D BSA لمدة 5 دقائق عند 4 ° C.
    ملاحظة: المفضل بالعربيةوتشمل مصفوفات finity مكافحة FLAG M2 الاغاروز، Streptavidin الاغاروز، GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز.
  7. غسل 3X مع 1 مل الباردة العازلة D.
  8. إزالة طاف من استخراج أوراق والتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون حقنة في أنبوب جديد على الجليد.
    ملاحظة: يجب أن يكون اللون الأخضر أو ​​الأصفر استخراج، وإذا تحولت العينة البني، وتجاهل والبدء من جديد.
  9. اتخاذ قسامة من استخراج النفط الخام لطخة مناعية، إضافة 5X العازلة SDS-PAGE التحميل ودوامة وتفسد بواسطة عينات المغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة.

3. مناعي البروتين

  1. تقسيم استخراج البروتين إلى قسمين 50 مل أنابيب وإضافة 50 ميكرولتر من المصفوفة تقارب معلقة في الواق D لكل أنبوب. احتضان مع التناوب لطيف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لم يتم العثور حضانات أطول لزيادة الغلة.
  2. إعداد 600 ميكرولتر (6X حجم حبة من مصفوفة تقارب) من شطف العازلة بإضافة لالعازلة D (تركيزات النهائي): 0.5٪ BSA، الببتيد 0.25 ملغ / مل FLAG (لمكافحة FLAG M2 الاغاروز) أو 10 ملي مد البيوتين (لStreptavidin الاغاروز).
    ملاحظة: لا ينصح شطف في حالة GFP-Trap_A ومكافحة HA المصفوفات، لذلك الانتقال مباشرة لدرجة الغليان في 1X العازلة SDS-PAGE التحميل، خطوة 3.11.
  3. ترسيب مصفوفة تقارب بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية (5 دقائق في 1000 x ج).
  4. اتخاذ قسامة من مستخلص غير منضم لطخة مناعية، وتجاهل بقية طاف، وترك حوالي 500 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. resuspend والحل الطين مع طرف واسعة الجوف.
  6. نقل الحل الطين مختلطة من كل من أنابيب واحد إلى 1.5 مل أنبوب.
    ملاحظة: من الآن فصاعدا، استخدم 1.5 مل المنخفضة البروتين ملزمة أنابيب microfuge.
  7. 3X النبض لمدة 5 ثانية باستخدام جهاز للطرد المركزي الفوق لترسيب مصفوفة تقارب وإزالة طاف.
  8. تغسل 3-5X مع 1 مل العازلة الباردة D. بين يغسل ترسيب ماتري تقاربس كما هو موضح سابقا وتجاهل طاف. في غسل مشاركة إزالة الزائدة العازلة D مع إبرة حقنة.
    ملاحظة: A غسل النهائي باستخدام العازلة D مع 0.1٪ IGEPAL يمكن استخدامها لزيادة خفض ملزم غير محددة.
  9. أزل مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة المناسبة (لمكافحة FLAG M2 أو Streptavidin الاغاروز خطوة انظر 3.2) 3X، 5 دقائق في كل مرة مع الهز المستمر.
  10. تجميع eluates 3 في أنبوب واحد. تركيز البروتينات باستخدام 30 ميكرولتر من الراتنج الاستيعاب. دوامة، واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق ويعجل الراتنج (2 دقيقة عند 10،000 x ج). تجاهل طاف.
    ملاحظة: للحصول على GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز، تخطى الخطوات 3.9 و 3.10.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 1X العازلة SDS-PAGE التحميل إلى مصفوفة تقارب عجلت أو الراتنج الاستيعاب. دوامة ويغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة.
  12. أجهزة الطرد المركزي لمصفوفة تقارب المغلي أو الراتنج لمدة 2 دقيقة في 10،000 ز س. قسامة 5 ميكرولتر من supernatanر لطخة مناعية، وتشغيل مع الكسور الأخرى في الصعود إلى ~ 10 سم طويلة هلام SDS-PAGE (الشكل 2).
  13. لفصل وتحديد البروتينات فسفرته بواسطة مطياف الكتلة، تحميل 45 ميكرولتر المتبقية في الصعود إلى ~ طويل 19 سم، وهلام SDS-PAGE إذا كان المطلوب فصل إضافي (الشكل 2).
    ملاحظة: يمكن تضمين حارة فارغ بين كل العينات للحد من تلوث العينات.

4. هضم البروتين

  1. وصمة عار على هلام SDS-PAGE مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) وصمة عار.
    ملاحظة: تصغير التعامل مع هلام للحد من التلوث مع keratins. تأكد من أن أيا من المعدات أو الأدوات التي استخدمت لimmunoblotting أو غيرها من الأنشطة التي قد لم يقم تلوث البروتين المتبقية.
  2. يزيل اللون هلام مع الغسيل وفيرة في الماء، ويفضل O / N. خفض الفرقة من الاهتمام من هلام بشفرة حلاقة نظيفة.
    ملاحظة: محاذاة هلام مع طخة مناعية إذا necessaراي لتحديد المنطقة الصحيحة. كما الفسفرة يمكن تأخير الهجرة من البروتينات على SDS-PAGE قطع المنطقة على الفور فوق وتحت عصابة من الفائدة.
  3. الزهر شريحة هلام إلى مكعبات من 2-4 ملم (وهذا يضمن أن الجل ستتم تغطيته من الحلول في أنبوب دون عرقلة نصائح ماصة). وضع في أنبوب.
  4. تقدير الحجم المطلوب للحفاظ على هلام المغمورة أيضا. استخدام هذا المبلغ لاشتقاق، الحضانة مع البروتيني واستخراج الببتيد، ومن ثم استخدام مزدوج إلى وحدات تخزين الثلاثي للغسيل.
    ملاحظة: في هضم نموذجية مع ما يقرب من 100 ميكرولتر من القطع قطع هلام، واستخدام 500 ميكرولتر حل للغسيل، 2 × 180 ميكرولتر من الجفاف، و 150 ميكرولتر للحد، و 120 ميكرولتر لالألكلة، و 120 ميكرولتر للهضم.
  5. غسل قطعة هلام 2 × 20 دقيقة (أو حتى destained) وذلك بإضافة 50٪ أسيتونتريل (في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم، ABC). ماصة قبالة الحل مع الحرص على عدم إزالة قطعة هلام.
  6. يذوى مع 100٪ أسيتوالنتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة.
    ملاحظة: يجب أن تظهر هلام منكمشة والأبيض. إذا استمرت اللون الأزرق، واحتضان أطول في أسيتونتريل / ABC و / أو في درجة حرارة مرتفعة (45-55 درجة مئوية).
  7. خفض السندات ثاني كبريتيد البروتين بإضافة 10 ملي DTT في الماء واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في 56 درجة مئوية مع الهز. إزالة السائل الحرة.
  8. بقايا السيستين يؤلكل بإضافة 55 ملي الكلوراسيتاميد (في 50 ملي ABC) لمدة 20-30 دقيقة (درجة حرارة الغرفة، والظلام). إزالة السائل الحرة.
  9. غسل قطعة هلام 2 × 10 دقيقة مع 50٪ أسيتونتريل (في 50 ملي ABC). إزالة السائل الحرة.
  10. يذوى القطع هلام مع 100٪ أسيتونتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة.
  11. لهضم زيتية، إضافة 40 ميكرولتر من محلول التربسين العمل (100 نانوغرام من التربسين في المخزن الهضم: 50 ملي ABC، 5٪ أسيتونتريل لمدة متوسطها الفرقة Coomassie الملون). السماح قطعة هلام لترطيب لمدة 10 دقيقة. إضافة ما يكفي من العازلة الهضم لتغطية قطعة هلام إذا لزم الأمر. احتضان عند 37 º CO / N.
  12. لوقف عملية الهضم واستخراج الببتيدات من القطع هلام، إضافة حمض الفورميك 5٪ (50٪ في أسيتونتريل) (إضافة نفس الحجم، حيث بلغ حجم الهضم). يصوتن لمدة 5-10 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد. كرر استخراج 3X.
  13. تجفيف الببتيدات بواسطة تجفيد (المفضل) أو المكثف فراغ (مثل السرعة بطالة أو سافانت). تخزينها في -20 درجة مئوية.
  14. يقدم عينتك لقياس الطيف الكتلي.
    ملاحظة: نحن لدينا عينة المقدمة إلى مرفق مطياف الكتلة في مختبر سينسبري (نورويتش، المملكة المتحدة). البروتوكولات في مرافق مطياف الكتلة تختلف اختلافا كبيرا، ولكن سيتم حله عادة الببتيدات في حمض trifluoroacetic 0.2٪ مع 2٪ أسيتونتريل قبل تحميل على نظام اللوني السائل إلى جانب الالكتروميكانيكية ورذاذ جنبا إلى جنب مطياف الكتلة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتينات الموسومة المعدلة وراثيا من مستقرة A. thaliana خطوط أو بعد التعبير عابرة للبروتينات في N. benthamiana. كما هو موضح في الشكل رقم 1 يقترن تنقية البروتين المستهدف مع مطياف الكتلة للسماح تحديد التفاعل البروتينات وPTMs من البروتين المستهدفة. وقد تم تصميم بروتوكول لتنقية البروتينات المشاركة في الحصانة النبات وتحديد PTMs ولكن يمكن تطبيقها على تنقية أي البروتينات النباتية الموسومة.

كمثال نستخدم تنقية معقدة الملف Prf / قدرة الإنطلاق من N. benthamiana. وN. المعدلة وراثيا خط benthamiana 38-12 54، معربا عن 35S: PTO، تحولت عابر مع 35S: تم immunoprecipitated الملف Prf-FLAG ومعقدة مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز (الشكل 2A). وimmunoblots (IB) في الشكل 2Aتوضيح أنه تم immunoprecipitated معظم البروتين المستهدفة (الملف Prf). تم copurified قدرة الإنطلاق والبروتين المستجيب التفاعل مع AvrPtoB الملف Prf والكشف باستخدام الأجسام المضادة وتحليل الطيف الكتلي (أرقام 2A و 2B). وجدنا أن جهاز السياحة أن copurified مع الملف Prf هاجر أبطأ على هلام SDS-PAGE عندما coexpressed مع المستجيب يبني 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB (الشكل 2A). كل من البروتينات المستجيب بفعل الهجرة أبطأ من جهاز السياحة الملف Prf-التفاعل (الشكل 2A). هذا المستجيب تعتمد على الاعتراف الهجرة بطء جهاز السياحة ويعزى سابقا إلى الفسفرة كما يمكن إزالته عن طريق العلاج مع الفوسفاتيز 44. للكشف عن مواقع الفسفرة المساهمة في هجرة بطيئة من قدرة الإنطلاق، ونحن يتعرض copurifying الملف Prf قدرة الانطلاق لتحليل الطيف الكتلي. على الرغم من التعبير عالية من التسليح والكشف سهلة مع immunoblots نتمكن من استرداد الببتيدات جovering 57٪ فقط من تسلسل جهاز السياحة وفشلنا في تحديد أي المواقع الفسفرة (الشكل 2B).

بعد ذلك، قمنا بتغيير استراتيجيات لاستهداف البروتين قدرة الإنطلاق مع المضادة للFLAG. N. تحولت محطات benthamiana WT عابر مع 35S: الملف Prf-35S 3HA و: PTO-FLAG، مع أو بدون 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB كان المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق، التي تضم كلا من الملف Prf المعقد وأشكال حرة، immunoprecipitated مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز وتعرض للتجزئة SDS-PAGE، في جل الهضم زيتية والتحليل الطيفي الشامل (الشكل 2C). مع هذا النهج حددنا الببتيدات قدرة الإنطلاق تغطي حوالي 80٪ من تسلسل ومجهول 100 كيلو دالتون بروتين التفاعل. حددنا مجموعة من المواقع الفسفرة مفردة ومزدوجة لجهاز السياحة الببتيدات 187-202 188-202 و(الجدول 1). كانت سر-198-199 والثريونين المواقع الفسفرة السائد ولكن بو أخرىكما تم الكشف عن مواقع sphorylation (الجدول 1). وقد تم تحديد الفسفرة الأكثر أهمية مزدوجة على سر-198-199 والثريونين فقط في وجود إما بروتين المستجيب (الجدول 1). حددنا مؤخرا مجموعة مماثلة من مواقع الفسفرة جهاز السياحة ويتضح أهمية هذا الحدث الفسفرة مزدوجة للانزعاج 47. بعد بروتوكول الموصوفة هنا كنا قادرين على تحديد التغيرات الدينامية في الدولة الفسفرة من البروتين الهدف.

figure-results-1
الشكل 1. التصميم التجريبي عام. البروتين المستهدف لمناعي (IP) غير الموسومة، وأعرب في بلانتا، عابر في نيكوتيانا benthamiana أو ثابت في نبات الأرابيدوبسيس thaliana. بعد استخراج البروتين ووimmunoprecipitated البروتين المستهدفة مع مصفوفة تقارب. يتم فصل البروتينات على هلام الأكريلاميد من قبل الكهربائي. يتم استئصال العصابات هلام. يتم استخراج البروتينات من العصابات هلام وتعرض لمطياف الكتلة. ويتم تحديد مواقع الفسفرة والبروتينات المتفاعلة. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

figure-results-2
الشكل 2. الملف Prf وقدرة الانطلاق مناعي ألف). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب المصفوفة. اللقاحاتأجريت noblots (IB) للالملف Prf، AvrPtoB وقدرة الإنطلاق. كما أشار بواسطة السهام في الجزء السفلي من لوحة جهاز السياحة طخة مناعية، AvrPto وAvrPtoB تحفز على الهجرة أبطأ من قدرة الإنطلاق باء). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وفصلها على SDS-PAGE. كانت ملطخة الجل مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) والملف Prf مرئية، تم رفعه جهاز السياحة وAvrPtoB البروتينات العصابات من الجل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. يشار إلى تغطية نسبة الببتيد قدرة الإنطلاق والملف Prf متواليات التي حددها مطياف الكتلة. C). وأعرب عن قدرة الإنطلاق-FLAG عابر جنبا إلى جنب مع 35S: بنيات 35S: الملف Prf-35S 3xHA وAvrPtoB، 35S: AvrPto أو ناقلات الفارغة (EV) في N. benthamiana. ثلاثة أيام بعد تسلل المبلغ الإجمالي للتم immunoprecipitated قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه جهاز السياحة وضوحا وقدرة الإنطلاق-التفاعل نطاقات البروتين من الهلام وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. جهاز السياحة و100 كيلو دالتون قدرة الإنطلاق-التفاعل الفرقة البروتين هي واضحة للعيان على الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) الملون وهلام، في حين أن الملف Prf قليلا أقل وضوحا (كما يتبين من السهام). IP: مناعي؛ IB: طخة مناعية؛ مصرف البحرين المركزي: Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ؛ cCBB: الغروية Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

1
PRF
EV AvrPto AvrPtoB
قدرة الإنطلاق الببتيد 188-202
GTELDQ [ص 195 T] HLSTVVK 1 0
GTELDQTHL [ص S 198] TVVK 10 7 5
GTELDQTHLS [ص 199 T] VVK 8 3 4
G [ص 190 T] ELDQTHLS [ص 199 T] VVK 0 1 2
GTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK 0 8 4
GTELDQTHLSTVVK 46 26 48
قدرة الإنطلاق الببتيد 187-202
KGTELDQ [ص 195 T] HLS TVVK 0 1 0
KGTELDQTHL [ص S 198] TVVK 17 17 12
KGTELDQTHLS [ص 199 T] VVK 4 2 2
KGTELDQ [ص 195 T] HLS [ص 199 T] VVK 0 1 1
KGTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK 0 7 5
KGTELDQTHLSTVVK 21 37 18
الببتيدات 187-202 188-202 و 83 88 50
نسبة الببتيدات مع حدثين الفسفرة 0٪ 26.9٪ 11.2٪
قدرة الإنطلاق تسلسل التغطية 78٪ 79٪ 82٪

الجدول 1 الفسفرة مزدوجة من الببتيد قدرة الإنطلاق على تفعيل يشير 35S:. الملف Prf-35S 3xHA و: PTO-FLAG وأعرب عن عابر جنبا إلى جنب مع مشركة خاصة ناقلات (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB في N. benthamiana. ثلاثة أيام آخر تسلل تم immunoprecipitated المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب مصفوفة وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه العصابات مرئية من قدرة الإنطلاق على الغروية Coomassie الرائعة هلام الملون الأزرق وتحليلها مع مطياف الكتلة. وأشار عدد من الببتيدات تحديدها مع قدرة الإنطلاق 0، 1، 2 والأحداث الفسفرة.

جدول مخازن
L المتوسطة تريبتون 10 ز / L
خلاصة الخميرة 5 ز / L
كلوريد الصوديوم 5 ز / L
D-الجلوكوز 1 جرام / لتر
العازلة الزراعية تسلل MgCl 2 10 ملي
MES 10 ملي
ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5
Acetosyringone (اختياري) 150 ميكرومتر
العازلة A تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 150 ملي
كلوريد الصوديوم 150 ملي
EDTA 5 ملي
EGTA 2 مم
الغليسيرول 5٪ (V / V)
العازلة B العازلة A
PVPP 2٪ (ث / ت)
العازلة C العازلة B
Dithiothreitol (DTT) 10 ملي
مصنع المانع البروتياز كوكتيل 1٪ (V / V)
Phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF) 0.5 ملي
Calyculin A 50 نانومتر
فلوريد الصوديوم (ناف) 50 ملي
كربونات الصوديوم (نا 2 زارة النفط 4) 10 ملي
Orthovanadate الصوديوم 1 ملم
حمض Okadaic 100 نانومتر
العازلة D C العازلة دون PVPP
5X SDS-PAGE العازلة تحميل تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 60 ملي
SDS 2٪
الغليسيرول 0.15٪
برموفينول الأزرق 0.10٪
التلفزيون الرقمي الأرضي (إضافة فقط قبل الاستخدام) 50 ملي

الجدول 2. العازلة وصفات وسائل الإعلام.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن توضيح آلية تنشيط مستقبلات بواسطة PAMPs والمستجيبات تسهم إلى حد كبير في فهمنا للمناعة النبات. في السنوات ال 20 الماضية، كانت الشاشتين الهجين الوراثية والخميرة مفيدة لاكتشاف خنازير والبروتينات NB-LRR. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت البروتوكولات المستندة إلى مطياف الكتلة لتحديد البروتينات تنظم بشكل مختلف خلال المناعي إشارة 55-58، PTMs بهم 11،33،59،60، وتكوين المركبات المناعية 61 والمستجيب يستهدف 62. نحن هنا وصف بروتوكول واضحة لتحديد PTMs تنظيم تفعيل المجمعات المناعي.

بالمقارنة مع البروتوكولات التي سبق وصفها، وهذا البروتوكول يسمح تحديد مفصل للتغيرات الديناميكية للPTMs. يمكن بروتوكولات النهج البروتينات واسعة النطاق تحديد PTMs من البروتينات ولكن ليست قادرة على الكشف عن اللدونة موقع PTMs بسبب الحدتبلغ إد من البروتين. في حالة البروتين الفسفرة، والنهج البروتينات على نطاق واسع عادة فقط تحديد المواقع الفسفرة السائد 11،33،59. توصيف مفصل للوضع البروتين الفسفرة يتطلب كمية كبيرة من البروتين التي يمكن الحصول عليها إلا من خلال تنقية جزئية من البروتين المستهدف 47. وصف بروتوكول هنا الأزواج نهج تنقية البروتين الذي ينتج كمية كبيرة من البروتين الهدف، مع تحليل الطيف الكتلي من البروتين النقي. بعد هذا البروتوكول، ويعزى هذا الحدث الفسفرة واحد من قدرة الإنطلاق في الغالب إلى سر-198 كما هو موضح سابقا 52 ولكن أيضا أيد بعض أطياف الطيف الشامل حدثا الفسفرة واحد على الثريونين-195-199 أو الثريونين. عندما لوحظت الأحداث الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق، كان الجمع الغالبة من الأحماض الأمينية فسفرته سر-198-199 والثريونين على الرغم من أن مجموعات على مواقع أخرى لوحظت أيضا (الجدول 1). هذه النتائج تظهر بوضوح اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لوصف التفاصيل في جميع المواقع الفسفرة ممكن.

الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي: 1) استخراج كافية من البروتينات؛ 2) حماية PTMs، و 3) كمية كافية من البروتين الهدف. أولا، لاستخراج ما يكفي من البروتينات، فمن المهم لطحن الأنسجة في النيتروجين السائل وبعد ذلك إلى استخدام الخالط الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول. إذا الخالط الأنسجة غير متوفرة، ويمكن استخدام قذيفة هاون ومدقة. من المهم أيضا لاستخدام نسبة 1-3 (أو أربعة) من غرام من الأنسجة لحجم استخراج العازلة. وهذا النسيج لتخفيف نسبة وقوة عازلة العالية التي نقترح ضمان أن الرقم الهيدروجيني ستبقى محايدة أثناء عملية الاستخراج. وجدنا أن هذا له أهمية خاصة لA. thaliana والطماطم اضافيةctions 52. حماية PTMs يمكن تحقيقه عن طريق بما في ذلك في جميع مخازن مثبطات الانزيمات المناسبة التي يمكن إزالة PTMs. ومن الأهمية بمكان أيضا لأداء جميع الخطوات في 4 درجات مئوية وprechill مخازن والصكوك. ويمكن تحقيق عائدات أعلى من البروتين المستهدفة باستخدام النباتات معربا عن البروتين بكميات كافية وباستخدام كميات عالية من الأنسجة (حوالي 20 غراما). الخطوة الأكثر أهمية للحصول على كميات كافية من البروتين الهدف هو تركيز البروتين الهدف عن طريق مناعي مباشرة. وسلط الضوء على أهمية هذه الخطوة التي كان فشلنا في تحديد PTMs من قدرة الإنطلاق بعد مناعي الملف Prf نظرا لكمية محدودة من coimmunoprecipitated التسليح (الشكل 2B). في المقابل، مناعي مباشرة لجهاز السياحة أسفرت عن الببتيدات إلى حد كبير أكثر قابلية للقياس (الشكل 2C) مما أدى إلى تغطية حوالي 80٪ من بروتين تسلسل وتحديد PTMs (الجدول 1). نحن أيضا شارعيوصي rongly استخدام حاتمة به للبروتين مناعي. بالمقارنة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الأم مصفوفة البروتينات حاتمة به تقارب يمكن أن تسفر عن كميات أكبر من البروتين النقي جزئيا. باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتين قدرة الانطلاق الأصلي 51 (الشكل 2A) للمناعي، وكنا قادرين على تحديد واحد فقط من الفسفرة الموقعين الفسفرة الغالبة من قدرة الإنطلاق.

وقد وضعت في المقام الأول هذا البروتوكول لتنقية جزئية من N. benthamiana حشوية البروتين وتحديد اللاحقة من المواقع الفسفرة بهم. ومع ذلك، باستخدام التعديلات الموصوفة هنا، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لA. البروتينات thaliana وغشاء ملزمة البروتينات. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لانتاج كميات كافية من البروتين المستهدف لتحديد PTMs وليس لتحقيق أعلى نقاء المجمع. إذا نقاء أعلىمطلوب من المجمع خطوة الثانية من تنقية يمكن أن تضاف إلى هذا البروتوكول 52. في هذه الحالة، فإن الخطوة الأولى تسمح شطف من البروتين الهدف من مصفوفة تقارب دون استخدام أملاح عالية أو حمض والخطوة اللاحقة قد يترتب عليها مصفوفة، الأمر الذي يتطلب ظروف قاسية شطف. من المهم التأكيد على أن اختبرناها فقط هذا البروتوكول لتحديد المواقع الفسفرة وأننا حاليا اختبار قدرتها لتحديد مفصل لPTMs إضافية.

نتائجنا تظهر بوضوح ممثل اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لتوصيف المواقع الفسفرة. الأهم من ذلك، أنها تسلط الضوء على أن تحديد مواقع الفسفرة تعتمد في كمية قليلة من البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي والطفرات نقطة واحدة من المواقع لصناعة السيارات في الفسفرة يمكن أن تعطي نتائج مربكة. نعرض هنا وسابقا 47 يترافق أن الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق على سر-198-199 والثريونين مع تفعيل المجمع الملف Prf / جهاز السياحة. في المقابل، أظهرت النتائج التي نشرت في وقت سابق أن الطفرات 47،63 نقطة واحدة من السير-198-199 والثريونين إلى ألانين، التي تمنع الفسفرة على هذه المواقع، هي قادرة على إشارات تشير إلى أن الفسفرة من هذه المواقع ليست شرطا أساسيا لتفعيل معقدة . ويمكن الآن هذه النتائج يمكن تفسيرها من خلال الفسفرة من الموقع الثانوي الثريونين-195. نظرة مماثلة في اللدونة موقع الفسفرة الأخرى بروتين كيناز يمكن الحصول على هذا البروتوكول التالية. علاوة على ذلك، نهج الجمع باستخدام مواقع الفسفرة نقطة الطفرات، والبروتينات التي يمكن أن تمنع تحركات محددة (المستجيبات) إلى جانب مناعي البروتين وتحليل الطيف الكتلي سوف يؤدي إلى فهم أفضل لأهمية التطورية للاللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة (مالية أو غيرها).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم VN من قبل الجمعية الملكية. JPR هو المستقبل زميل مجلس البحوث الأسترالي (FT0992129). نشكر الدكتور ميريام جيفورد لقراءة نقدية للمخطوطة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MgCl2< / sub>SigmaM8266
MESSigmaM8250
AcetosyringoneSigmaD134406سامة - 1 متر مخزون في حقنة DMSO
إبرة حقنةTerumo
مخزون
MG-132 السام MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)SigmaC22111 M في DMSO ، يخزن في -80 درجة ؛ أملاح C
MSSigmaM5524المؤكسدة ،
السكروزSigma16104
قاعدة TrizmaSigmaT1503ضبط الأس الهيدروجيني مع 1 N HCl لصنع 1 M Tris-HCl عازلة
NaClSigmaS30145 M مخزون
EDTASigmaE6758سام - 0.5 متر مخزون
EGTASigmaE4378
الجلاسرينالوطنية التشخيصEC-606
IGEPAL CA-630SigmaI8896PVPP المسببة للتآكل
(بولي فينيل بولي بيروليدون) لابين سيجماP5288وبين PVP
DTT (DL-dithiothreitol)Sigma43815سامة - مخزون 1 م ، مخزن عند -20 درجة ؛
كوكتيل مثبط البروتياز النباتيC SigmaP9599لا يتجمد / يذوب عدة مرات
PMSF (فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل)SigmaP7626قابلة للتآكل وسامة
Calyculin Aتقنية إشاراتالخلية 9902
فلوريد الصوديوم (NaF)SigmaS7920سام - 1 متر مخزون
موليبدات الصوديوم (Na2< / sub>MoO4< / sub>)SigmaS66460.5 M مخزون
أورثوفانادات الصوديوم (Na3< / sub>VO4< / sub>)سيجما450243سامة - تحضير محلول 200 ملي مولار من أورثوفانادات الصوديوم. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.0 باستخدام 1 N NaOH أو 1 N HCl. قد يختلف الرقم الهيدروجيني الأولي لمحلول أورثوفانادات الصوديوم باختلاف الكثير من المواد الكيميائية. عند درجة الحموضة 10.0 سيكون المحلول أصفر. اغلي المحلول حتى يصبح عديم اللون (حوالي 10 دقائق). تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 10.0 وكرر الخطوتين 3 و 4 حتى يظل المحلول عديم اللون ويستقر الرقم الهيدروجيني عند 10.0.  ؛
حمض أوكادايكسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-3513
كينماتيكا بوليترون تجانس الأنسجةفيشر ساينتفيك08-451-320
MiraclothMerck Millipore475855-1R
مضاد ل FLAG M2 agaroseSigmaA2220يوصى بهذه المصفوفة
Streptavidin-agaroseThermo-Scientific20347هذا يوصى باستخدام المصفوفة
GFP-Trap_AChromotekgta-20يوصى بهذه المصفوفة
Anti-HA-AgaroseSigmaA2095بهذه المصفوفة
0.45 & مرشح mVWR 513-1902
BSASigmaA7906
FLAG الببتيدSigmaF3290
D-biotinSigma47868
StrataClean ResinAgilent400714 يوصى باستخدامراتنج الامتصاص هذا لترسيب البروتين
Mini-PROTEAN TetraCell Biorad
PROTEAN II XL CellBiorad
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060يوصى بهذه البقعة
أنابيب البروتين منخفضة الارتباط (LoBind)Eppendorf0030 108.116يوصى بهذه الأنابيب
بيكربونات الأمونيوم (ABC)Sigma9830
AcetonitrileVWR83639سامة وقابلة للاشتعال
2-كلورو أسيتاميدسيجما22790
التربسينبروميجاV5280المهيج ، الحساس
حمض الفورميكسيجما14265سام ، تآكل
حمام مائي سونيكاتيرUltravaweUltra BT حمام بالموجات فوق الصوتية
LTQ-Orbitrap XLالحرارة العلمية
Trichostatin ASigmaT8552سامة
1 مل معقمة Terumo NN-2525R Silwet L-77 (خافض للتوتر السطحي) Lehle Seeds VIS-01 السام تخلط مادة يوصى السام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, A. M., Monaghan, J., Ntoukakis, V. Editorial: Mechanisms regulating immunity in plants. Front. Plant Sci. 4, 64 (2013).
  2. Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr. Opin. Chem. Biol. 8, 33-41 (2004).
  3. Cohen, P. The regulation of protein function by multisite phosphorylation-a 25 year update. Trends Biochem. Sci. 25, 596-601 (2000).
  4. Narayanan, A., Jacobson, M. P. Computational studies of protein regulation by post-translational phosphorylation. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 156-163 (2009).
  5. Stulemeijer, I. J., Joosten, M. H. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plants. Mol. Plant Pathol. 9, 545-560 (2008).
  6. Park, C. J., Caddell, D. F., Ronald, P. C. Protein phosphorylation in plant immunity: insights into the regulation of pattern recognition receptor-mediated signaling. Front. Plant Sci. 3, 177 (2012).
  7. van Bentem, S. D., Hirt, H. Using phosphoproteomics to reveal signalling dynamics in plants. Trends Plant Sci. 12, 404-411 (2007).
  8. Peck, S. C. Early phosphorylation events in biotic stress. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 334-338 (2003).
  9. Thurston, G., Regan, S., Rampitsch, C., Xing, T. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant-pathogen interactions. Physiol. Mol. Plant P. 66, 3-11 (2005).
  10. Xing, T., Ouellet, T., Miki, B. L. Towards genomic and proteomic studies of protein phosphorylation in plant-pathogen interactions. Trends Plant Sci. 7, 224-230 (2002).
  11. Nuhse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. Plant J. 51, 931-940 (2007).
  12. Boller, T., Felix, G. A renaissance of elicitors: perception of microbe-associated molecular patterns and danger signals by pattern-recognition receptors. Ann. Rev. Plant Biol. 60, 379-406 (2009).
  13. Wang, G., et al. A genome-wide functional investigation into the roles of receptor-like proteins in Arabidopsis. Plant Physiol. 147, 503-517 (2008).
  14. Wang, G. D., et al. The Diverse Roles of Extracellular Leucine-rich Repeat-containing Receptor-like Proteins in Plants. Crit. Rev. Plant Sci. 29, 285-299 (2010).
  15. Schwessinger, B., Ronald, P. C. Plant innate immunity: perception of conserved microbial signatures. Ann. Rev. Plant Biol. 63, 451-482 (2012).
  16. Schulze, B., et al. Rapid heteromerization and phosphorylation of ligand-activated plant transmembrane receptors and their associated kinase BAK1. J. Biol. Chem. 285, 9444-9451 (2010).
  17. Lu, D., et al. A receptor-like cytoplasmic kinase, BIK1, associates with a flagellin receptor complex to initiate plant innate immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 496-501 (2010).
  18. Zhang, J., et al. Receptor-like cytoplasmic kinases integrate signaling from multiple plant immune receptors and are targeted by a Pseudomonas syringae effector. Cell Host Microbe. 7, 290-301 (2010).
  19. Lu, D., et al. Direct ubiquitination of pattern recognition receptor FLS2 attenuates plant innate immunity. Science. 332, 1439-1442 (2011).
  20. Asai, T., et al. MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity. Nature. 415, 977-983 (2002).
  21. Rasmussen, M. W., Roux, M., Petersen, M., Mundy, J. MAP Kinase Cascades in Arabidopsis Innate Immunity. Front. Plant Sci. 3, 169 (2012).
  22. Boudsocq, M., et al. Differential innate immune signalling via Ca2+ sensor protein kinases. Nature. 464, 418-422 (2010).
  23. Dubiella, U., et al. Calcium-dependent protein kinase/NADPH oxidase activation circuit is required for rapid defense signal propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8744-8749 (2013).
  24. Ishihama, N., Yamada, R., Yoshioka, M., Katou, S., Yoshioka, H. Phosphorylation of the Nicotiana benthamiana WRKY8 transcription factor by MAPK functions in the defense response. Plant Cell. 23, 1153-1170 (2011).
  25. Mao, G., et al. Phosphorylation of a WRKY transcription factor by two pathogen-responsive MAPKs drives phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 1639-1653 (2011).
  26. Dangl, J. L., Jones, J. D. G. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature. 411, 826-833 (2001).
  27. Eitas, T. K., Dangl, J. L. NB-LRR proteins: pairs, pieces, perception, partners, and pathways. Curr. Opin. Plant Biol. 13, 472-477 (2010).
  28. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444, 323-329 (2006).
  29. Boller, T., He, S. Y. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science. 324, 742-744 (2009).
  30. Bonardi, V., Dangl, J. L. How complex are intracellular immune receptor signaling complexes. Front. Plant Sci. 3, 237 (2012).
  31. Bonardi, V., Cherkis, K., Nishimura, M. T., Dangl, J. L. A new eye on NLR proteins: focused on clarity or diffused by complexity. Curr. Opin. Immunol. 24, 41-50 (2012).
  32. Takken, F. L., Albrecht, M., Tameling, W. I. Resistance proteins: molecular switches of plant defence. Curr. Opin. Plant Biol. 9, 383-390 (2006).
  33. Nakagami, H., et al. Large-scale comparative phosphoproteomics identifies conserved phosphorylation sites in plants. Plant Physiol. 153, 1161-1174 (2010).
  34. del Pozo, O., Pedley, K. F., Martin, G. B. MAPKKKalpha is a positive regulator of cell death associated with both plant immunity and disease. EMBO J. 23, 3072-3082 (2004).
  35. Ekengren, S. K., Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P., Martin, G. B. Two MAPK cascades, NPR1, and TGA transcription factors play a role in Pto-mediated disease resistance in tomato. Plant J. 36, 905-917 (2003).
  36. Romeis, T., et al. Rapid Avr9- and Cf-9 -dependent activation of MAP kinases in tobacco cell cultures and leaves: convergence of resistance gene, elicitor, wound, and salicylate responses. Plant Cell. 11, 273-287 (1999).
  37. Zhang, S., Klessig, D. F. Resistance gene N-mediated de novo synthesis and activation of a tobacco mitogen-activated protein kinase by tobacco mosaic virus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 7433-7438 (1998).
  38. Romeis, T., Piedras, P., Jones, J. D. G. Resistance gene-dependent activation of a calcium-dependent protein kinase in the plant defense response. Plant Cell. 12, 803-815 (2000).
  39. Romeis, T., Ludwig, A. A., Martin, R., Jones, J. D. G. Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response. EMBO J. 20, 5556-5567 (2001).
  40. Romeis, T. Protein kinases in the plant defence response. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 407-414 (2001).
  41. Dodds, P. N., Rathjen, J. P. Plant immunity: towards an integrated view of plant-pathogen interactions. Nat. Rev. Genet. 11, 539-548 (2010).
  42. Grant, M. R., et al. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science. 269, 843-846 (1995).
  43. Mackey, D., Holt, B. F. 3rd, Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cell. 108, 743-754 (2002).
  44. Mucyn, T. S., et al. The tomato NBARC-LRR protein Prf interacts with Pto kinase in vivo to regulate specific plant immunity. Plant Cell. 18, 2792-2806 (2006).
  45. Chung, E. H., et al. Specific threonine phosphorylation of a host target by two unrelated type III effectors activates a host innate immune receptor in plants. Cell Host Microbe. 9, 125-136 (2011).
  46. Liu, J., Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. A receptor-like cytoplasmic kinase phosphorylates the host target RIN4, leading to the activation of a plant innate immune receptor. Cell Host Microbe. 9, 137-146 (2011).
  47. Ntoukakis, V., et al. The Tomato Prf Complex Is a Molecular Trap for Bacterial Effectors Based on Pto Transphosphorylation. PLoS Pathog. 9, (2013).
  48. Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 3157-3157 (2000).
  49. Ntoukakis, V., et al. Host Inhibition of a Bacterial Virulence Effector Triggers Immunity to Infection. Science. 324, 784-787 (2009).
  50. Zhou, J. M., Loh, Y. T., Bressan, R. A., Martin, G. B. The Tomato Gene Pti1 Encodes a Serine/Threonine Kinase That Is Phosphorylated by Pto and Is Involved in the Hypersensitive Response. Cell. 83, 925-935 (1995).
  51. Wu, A. -J., Andriotis, V. M. E., Durrant, M. C., Rathjen, J. P. A Patch of Surface-Exposed Residues Mediates Negative Regulation of Immune Signaling by Tomato Pto Kinase. Plant Cell. 16, 2809-2821 (2004).
  52. Gutierrez, J. R., et al. Prf immune complexes of tomato are oligomeric and contain multiple Pto-like kinases that diversify effector recognition. Plant J. 61, 507-518 (2010).
  53. Ntoukakis, V., Schwessinger, B., Segonzac, C., Zipfel, C. Cautionary notes on the use of C-terminal BAK1 fusion proteins for functional studies. Plant Cell. 23, 3871-3878 (2011).
  54. Rommens, C. M., Salmeron, J. M., Oldroyd, G. E., Staskawicz, B. J. Intergeneric transfer and functional expression of the tomato disease resistance gene Pto. Plant Cell. 7, 1537-1544 (1995).
  55. Jones, A. M., et al. Specific changes in the Arabidopsis proteome in response to bacterial challenge: differentiating basal and R-gene mediated resistance. Phytochemistry. 65, 1805-1816 (2004).
  56. Widjaja, I., et al. Combining subproteome enrichment and Rubisco depletion enables identification of low abundance proteins differentially regulated during plant defense. Proteomics. 9, 138-147 (2009).
  57. Keinath, N. F., et al. PAMP (pathogen-associated molecular pattern)-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  58. Elmore, J. M., Liu, J., Smith, B., Phinney, B., Coaker, G. Quantitative proteomics reveals dynamic changes in the plasma membrane during Arabidopsis immune signaling. Mol. Cell. Proteom. 11, (2012).
  59. Benschop, J. J., et al. Quantitative phosphoproteomics of early elicitor signaling in Arabidopsis. Mol. Cell. Proteom. 6, 1198-1214 (2007).
  60. Maor, R., et al. Multidimensional protein identification technology (MudPIT) analysis of ubiquitinated proteins in plants. Mol. Cell. Proteom. 6, 601-610 (2007).
  61. Elmore, J. M., Coaker, G. Biochemical purification of native immune protein complexes. Methods Mol. Biol. 712, 31-44 (2011).
  62. Win, J., Kamoun, S., Jones, A. M. Purification of effector-target protein complexes via transient expression in Nicotiana benthamiana. Methods Mol. Biol. 712, 181-194 (2011).
  63. Sessa, G., D'Ascenzo, M., Martin, G. B. Thr38 and Ser198 are Pto autophosphorylation sites required for the AvrPto-Pto-mediated hypersensitive response. EMBO J. 19, 2257-2269 (2000).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة