نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على 15 N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

Kerstin Trompelt; Janina Steinbeck; Mia Terashima; Michael Hippler

doi:10.3791/51103

Method Article

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على¹⁵ N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

DOI:

10.3791/51103

⸱

March 13th, 2014

Kerstin Trompelt¹ , Janina Steinbeck¹ , Mia Terashima¹^,² , Michael Hippler¹

¹Institute of Plant Biology and Biotechnology, University of Münster, ²Department of Plant Biology, Carnegie Institution for Science

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف النهج وصفها النسبية، كمية البروتين في الحصول على نظرة ثاقبة لتكوين المجمعات multiprotein في ظل ظروف مختلفة، ويتجلى من خلال مقارنة سلالات مختلفة وراثيا. للتحليل الكمي يتم خلط كميات متساوية من كسور مختلفة من التدرج كثافة السكروز وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر بروتوكول أدخلت أداة لتحليل المجمعات multiprotein في الغشاء الثايلاكويد، من خلال الكشف عن نظرة ثاقبة تكوين معقدة في ظل ظروف مختلفة. في هذا البروتوكول ويتجلى هذا النهج من خلال مقارنة تكوين البروتين المسؤول معقدة للدوري تدفق الإلكترونات (CEF) في كلاميدوموناس reinhardtii، معزولة عن سلالات مختلفة وراثيا. ويتألف الإجراء عزل الأغشية الثايلاكويد، تليها انفصالهما في المجمعات multiprotein بواسطة السكروز الطرد المركزي التدرج الكثافة، SDS-PAGE، مناعي والمقارنة، قياس الطيف الكتلي الكمي (MS) على أساس وضع العلامات الأيضية التفاضلية ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) من سلالات تحليلها. يتم تحميل الأغشية الثايلاكويد solubilized المنظفات على التدرجات كثافة السكروز في تركيز الكلوروفيل متساوية. بعد تنبيذ فائق، يتم فصل التدرجات إلى كسور، التي يتم تحليلها بواسطة الشامل spectrometراي يعتمد على حجم مساو. هذا النهج يتيح التحقيق في تكوين داخل الكسور التدرج وعلاوة على ذلك لتحليل سلوك الهجرة من البروتينات المختلفة، مع التركيز خصوصا على ANR1، CAS، وPGRL1. علاوة على ذلك، ويتجلى هذا الأسلوب من خلال التأكد من نتائج مع immunoblotting وبالإضافة إلى ذلك بدعم النتائج من الدراسات السابقة (تحديد والهجرة تعتمد على المبادرة من البروتينات التي تم وصفها سابقا لتكون جزءا من CEF-supercomplex مثل PGRL1، FNR، و CYT و). والجدير بالذكر أن هذا النهج ينطبق على معالجة مجموعة واسعة من الأسئلة التي هذا البروتوكول يمكن اعتمادها وعلى سبيل المثال تستخدم لتحليلات مقارنة للتكوين معقدة multiprotein معزولة عن الظروف البيئية المتميزة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن لعمليات التمثيل الضوئي في الأغشية الثايلاكويد من النباتات والطحالب تعمل في وضع الخطية ودوري. خلال الخطية تدفق الإلكترونات (LEF) الضوئي الأول (PSI)، الضوئي الثاني (PSII) والسيتوكروم ب ₆ / و في نهاية المطاف نقل الالكترونات من الماء إلى NADP + ^1، مما يؤدي إلى توليد NADPH و ATP ^2. في المقابل، دوري تدفق الإلكترونات (CEF)، والذي يعرف ليكون ذلك حافزا تحت ظروف بيئية متنوعة مثل الدولة 2 ^{3 4} شروط واللاهوائية، والنتائج في إعادة الحد من PSI أكسدة عن طريق حقن الإلكترونات مرة أخرى إلى سلسلة نقل الإلكترون. هذه العملية يمكن أن تتم إما في الجانب اللحمية من السيتوكروم ب ^_6/1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة من كلاميدوموناس

وC. التالية واستخدمت reinhardtii سلالات في هذه الدراسة: WT cc124، WT-cw15 arg7 (جدار الخلية ناقصة وأرجينين عوني التغذي)، وهو ΔPSI سلالة متحولة ²⁹ وpgrl1 خروج المغلوب سلالة ^4.
وقد نمت جميع سلالات في تريس، خلات فوسفات (وات) المتوسطة ^30، عند 25 درجة مئوية مع شدة الضوء المستمر من 20-50 μE / م ² ثانية واهتزاز في 120 دورة في الدقيقة. ينبغي أن تكون ملفوفة ثقافة ΔPSI مع بعض المناديل ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويهدف النهج الكمي البروتيوميات قدم لوصف تكوين المجمعات multiprotein في الأغشية الثايلاكويد يتبين من تحليل مقارن لمكونات CEF-supercomplex في مختلف وراثيا C. reinhardtii السلالات. وقد تم بنجاح تطبيق الطريقة الموصوفة من قبل Terashima وآخرون. ⁶ وتضم عزلة الأغشية الثايلاكويد من اللاهوائية نمت الثقافات، تليها المنظفات الانحلالية. بعد ذلك، يتم تحميل العينات على التدرج كثافة السكروز على أساس تساوي كمية الكلوروفيل ومجزأة المجمعات بواسطة تنبيذ فائق. لكمية MS-تحل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نشرت دراسات البروتين الكمي المختلفة باستخدام الوسم النظائر مستقرة في السنوات الأخيرة. في هذه التجارب عادة ما تتم مقارنة اثنين من عينات مختلفة، منها هو المسمى عينة واحدة مع النظائر مستقرة. بعد ذلك يتم الجمع بين البروتينات أو الببتيدات من العينتين في نسبة متساوية ومواصلة تجهيزها معا ^48. غالبا ما تنوي هذه الدراسات للمقارنة بين حجرات معزولة محددة الخلوية (مثل البلاستيدات الخضراء، الميتوكوندريا، أو الأغشية الثايلاكويد) تتعرض لظروف الإجهاد المختلفة ^{26،34،49<.......}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر MH بدعم من "جمعية الألمانية للبحوث" (DFG). الكاتب المساهمات: تصميم MH البحوث؛ تنفيذ KT، JS وMT البحوث وتحليل البيانات؛ كتب KT وMH الورقة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي > كيميائي < / قوي >
حمض الخليك	AppliChem	A0662	http://www.applichem.com/home/
الأسيتون	AppliChem	A2300	http://www.applichem.com/home/
الأسيتونيتريل Optigrade f & uuml ؛ ص LC-MS	قطري	9340	ضار ، العمل مع القفازات. انظر نص البروتوكول لمزيد من الاحتياطات. < ص >https://www.diagonal.de/< / ص >
كلوريد الأمونيوم ^{15< / sup>N}	مختبرات كامبريدج النظائر	39466-62-1	http://www.isotope.com/cil/index.cfm
كلوريد الأمونيوم ^{14< / sup>N}	AppliChem	A0988	http://www.applichem.com/home/
فوسفات الأمونيوم الهيدروجين	AppliChem	A3583	http://www.applichem.com/home/
كبريتات الأمونيوم	AppliChem	A3598	http://www.applichem.com/home/
Coomassie أزرق لامع R-250	فيشر 10041653 العلمي		http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem	A0819	http://www.applichem.com/home/
EDTA	AppliChem	A2937	http://www.applichem.com/home/
حمض الفورميك	AppliChem	A3858	http://www.applichem.com/home/
HEPES	AppliChem	A3724	http://www.applichem.com/home/
كلوريد المغنيسيوم	AppliChem	A4425	http://www.applichem.com/home/
الميثانول	AppliChem	A2954	http://www.applichem.com/home/
حمض الفوسفور	AppliChem	A0989	http://www.applichem.com/home/
فوسفات هيدروجين ثنائي البوتاسيوم	AppliChem	A1042	http://www.applichem.com/home/
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم	AppliChem	A1043	http://www.applichem.com/home/
هيدروكسيد الصوديوم	AppliChem	A1551	http://www.applichem.com/home/
السكروز	AppliChem	A1125	http://www.applichem.com/home/
Tricine	AppliChem	A3954	http://www.applichem.com/home/
Tris	AppliChem	A2264	http://www.applichem.com/home/
التربسين (معدل درجة التسلسل) وعازلة التربسين	Promega	V5111	http://www.promega.de/
<قوي>المعدات< / قوي >
البخاخات (تعطيل خلية BioNeb) أنابيب	Glas-Col
http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 (14 مم × 89 مم) ؛	بيكمان كولتر	331372	لإعداد تدرجات أسلوب تاكاهاشي < p>http://www.beckmancoulter.de/< / p>
أنابيب الطرد المركزي 25 مم × 89 مم 344058	بيكمان كولتر		لإعداد تدرجات عزل الثايلاكويد. http://www.beckmancoulter.de/< / p>
كولتر أفانتي الطرد المركزي J-20 XP	بيكمان كولتر		http://www.beckmancoulter.de/
الفوكس روزنتال الخلية	قطري	449/72	https://www.diagonal.de/
الخالط (بوتر) 50 مل & nbsp ؛	Fisherbrand	10618242	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
Pistil للمغالط	Fisherbrand	105252220	http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand
أجهزة الطرد المركزي الفائقة (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	بيكمان كولتر		:
http://www.beckmancoulter.de/<قوي>آخر< / قوي>
الأجسام المضادة	أجريسيرا		http://www.agrisera.com/en/index.html

الطرد المركزي غرفة موقع

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron flow in C3 plants. Biochim. Biophys. Acta. 1757 (5-6), 362-368 (2006).
Shikanai, T. Cyclic electron transport around photosystem I: genetic approaches. Annu. Rev. Plant Biol. 58, 199-217 (2007).
Finazzi, G., Furia, A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على¹⁵ N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles