مقالة منهجية

مقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا لقياس النشاط السام للخلايا

18.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51105

⸱

ديسمبر 17, 2013

 ,  , 
1Vaccine and Gene Therapy Institute of Florida

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول مقايسة السمية الخلوية الحساسة القائمة على الخلية. من خلال تعداد الانخفاض في تواتر الخلايا التائية CD4 + المستهدفة الحية في وجود عدد متزايد من الخلايا التائية المستجيبة CD8 + ، يسمح هذا الاختبار بالتقييم المباشر للنشاط المحلل للخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد.

الملخص

< p class = "jove_content" > نادرا ما يتم تقييم النشاط المحلل للخلايا التائية CD8 +. نصف هنا فحصا جديدا قائما على الخلية لقياس قدرة خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد على قتل خلايا CD4 + T المحملة بالببتيد المماثل. تنقسم الخلايا التائية CD4 + المستهدفة إلى مجموعتين ، مصنفة بتركيزين مختلفين من CFSE. يتم نبض أحد السكان بالببتيد ذي الأهمية (CFSE-low) بينما يظل الآخر غير نابض (CFSE-high). يتم خلط خلايا CD4 + T النبضية وغير النبضية بنسبة متساوية وتحضنها بعدد متزايد من خلايا CD8 + T المنقاة. يتم تحليل القتل المحدد لخلايا CD4 + T المستهدفة الذاتية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد الزراعة المشتركة مع خلايا CD8 + T التي تحتوي على الخلايا التائية المستجيب الخاص بالمستضد CD8 + التي تم اكتشافها بواسطة تلطيخ رباعي الببتيد / MHCI. يسمح التحلل المحدد لخلايا CD4 + T المستهدفة المقاسة بنسب مستجيب مختلفة مقابل نسب مستهدفة ، بحساب الوحدات اللايتية ، LU30/106 خلايا. يسمح هذا الاختبار البسيط والمباشر بالقياس الدقيق للقدرة الجوهرية لخلايا CD8 + T لقتل خلايا CD4 + T المستهدفة.

المقدمة

النشاط المحلل للخلايا هو الوظيفة الرئيسية للخلايا التائية CD8 + ولكن لا يزال نادرا ما يتم قياسه لأن المقايسات المستخدمة لهذا الغرض مرهقة وكان من الصعب توحيدها. يعد القياس الدقيق لهذه الوظيفة ذا أهمية قصوى عند توصيف وظائف المستجيب لخلايا CD8 + T ، حيث لم يتم وصف أي تنبؤات موثوقة للسمية الخلوية الفعالة بوساطة الخلويةحتى الآن 1،2. هنا ، نقترح فحصا وظيفيا جديدا لقياس النشاط السام للخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد على خلايا CD4 + T المستهدفة. تم تطوير العديد من الأساليب لتوفير بدائل لمعيار الذهب ، مقايسة إطلاق الكروم. نقدم هنا فحصا قائما على الخلايا يكشف عن عملية القتل بأكملها حيث يقيس موت الخلايا المستهدفة الحية. تم اشتقاق هذه الطريقة من بروتوكولات المقايسات السامة للخلايا القائمة على قياس التدفق الخلوي في الجسم الحي في الفئران4,5 وفي المختبر في البشر6. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام خلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد الموجودة في إجمالي عدد الخلايا التائية CD8 + كخلايا مستجيبة وتستخدم خلايا CD4 + T الذاتية كخلايا مستهدفة. يتم تعداد الخلايا التائية المستجيب CD8 + ذات الأهمية باستخدام رباعيات MHCI / الببتيد7. يتم حساب موت الخلايا المستهدفة من خلال النسبة بين خلايا CD4 + T المحملة / غير المحملة بالببتيد. لقد أظهرنا سابقا أن هذه الطريقة كانت قابلة للتكرار وحساسة ومحددة ولا تعتمد على عدد الخلايا المستجيبة ضمن إجمالي خلايا CD8 + T8. من خلال تعداد كل من عدد الخلايا المستجيبة والخلايا المستهدفة في مقايسة الزراعة المشتركة ، يمكن حساب القدرة الجوهرية لخلايا CD8 + T لقتل الخلايا المستهدفة والتعبير عنها في وحدات الحالة9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير الخلايا Texor CD8 + T

  1. قم بإذابة PBMCs المحفوظة بالتبريد الذاتية (2-3 قوارير من 50 × 106 خلايا) عن طريق نقل التبريد من النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. اغسل الخلايا عن طريق ملء الأنبوب حتى 50 مل ب RPMI كامل (4 ملي مولار L-glutamine ، و 100 U / ml البنسلين والستربتومايسين ، مع 10٪ FBS). عد PBMCs وإعادة تعليق الخلايا بتركيز 5 × 106 / مل في RPMI الكامل.
  3. أضف ببتيد محدد (5 ميكروغرام / مل) و IL-2 (10 نانوغرام / مل) إلى PBMCs.
  4. قم بإعداد الثقافة في 96 صفيحة بئر عميقة ؛ بذرة 1 مل من معلق الخلية لكل بئر.
  5. بعد 3 أيام من المزرعة ، استبدل نصف وسط زراعة الخلايا ب RPMI كامل طازج.
  6. بعد 6 أيام من الاستزراع، اجمع جميع PBMCs باستخدام ماصة متعددة القنوات وانقل الخلايا في خزان معقم.
  7. عد وغسل وإعادة تعليق PBMCs عند 5 × 107 / مل في المخزن المؤقت للفصل الموصى به في أنابيب سفلية مستديرة سعة 14 مل. أضف كوكتيل تخصيب الخلايا التائية CD8 + البشري بخلية 50 ميكرولتر / مل. تخلط وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف الجسيمات المغناطيسية عند 150 ميكرولتر / مل واحتضانها لمدة 5 دقائق.
  8. ارفع معلق الخلية حتى 7 مل عن طريق إضافة المخزن المؤقت للفصل. انتقل إلى العزل المناعي المغناطيسي لخلية CD8 + T التي لم تمسها عن طريق وضع الأنبوب في المغناطيس. بعد 5 دقائق ، مع بقاء الأنبوب في المغناطيس ، اسكب الخلايا ذات الأهمية في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. خذ كمية صغيرة وصمة عار الخلايا بالأجسام المضادة ضد CD3 و CD8 في 1X PBS-2٪ FBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن بعد ذلك قياس نقاء الخلايا التائية CD8 + عن طريق قياس التدفق الخلوي بنقاء متوقع يبلغ 95٪ أو أعلى.
  9. أعد تعليق خلايا CD8 + T في 450 ميكرولتر مع RPMI كامل.
  10. أضف 225 ميكرولتر من RPMI الكامل إلى 5 أنابيب غطاء لولبي.
  11. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية (من 1: 2 إلى 1:32) عن طريق نقل 225 ميكرولتر من CD8 + إلى الأنبوب التالي (انظر الشكل 1 اللوحة العلوية).
فئة

2. تحضير خلايا CD4 + T المستهدفة

  1. قم بإذابة PBMCs المحفوظة بالتبريد الذاتية (قارورة واحدة من 50 × 106 خلايا) عن طريق نقل التبريد من النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من RPMI.
  3. اغسل الخلايا وأعد تعليق PBMCs عند 5 × 107 / مل مع عازلة فصل في أنابيب سفلية مستديرة سعة 14 مل. أضف كوكتيل تخصيب الخلايا التائية CD4 + البشري بخلية 50 ميكرولتر / مل. تخلط وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف الجسيمات المغناطيسية عند 100 ميكرولتر / مل واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. ارفع معلق الخلية حتى 7 مل عن طريق إضافة مخزن مؤقت للفصل. انتقل إلى عزل خلايا CD4 + T عن طريق وضع الأنبوب في المغناطيس. بعد 5 دقائق ، مع بقاء الأنبوب داخل المغناطيس ، اسكب الخلايا المرغوبة في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. خذ كمية صغيرة وصمة عار الخلايا بالأجسام المضادة ضد CD3 و CD4 في 1x PBS-2٪ FBS لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن بعد ذلك قياس نقاء الخلايا التائية CD4 + عن طريق قياس التدفق الخلوي بنقاء متوقع يبلغ 95٪ أو أعلى.
  5. عد خلايا CD4 + T ، وقسمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل واغسلها في 1x PBS دافئ.
  6. قم بإعداد محلول عمل عالي CFSE بمعدل 0.4 ميكرومتر في PBS الدافئ.
  7. قم بإعداد محلول عمل منخفض CFSE 0.04 ميكرومتر عن طريق تخفيف جزء من محلول العمل العالي 10x CFSE في PBS الدافئ.
  8. أعد تعليق الخلايا عند 20 × 106 / مل من PBS (إذا كان عدد خلايا CD4 + T أقل من 10 × 106 / مل ، قم بإعادة تعليق الخلايا في 0.5 مل من PBS) وصمة عار نصف خلايا CD4 + T عن طريق إضافة حجم واحد متساو من محلول عمل عالي CFSE 0.4 ميكرومتر (التركيز النهائي 0.2 ميكرومتر). على سبيل المثال ، بالنسبة ل 1 مل من الخلايا ، أضف 1 مل من محلول عمل CFSE. قم بتلطيخ النصف المتبقي من CD4 + عن طريق إضافة حجم واحد متساو من محلول عمل منخفض CFSE 0.04 ميكرومتر (التركيز النهائي 0.02 ميكرومتر). تلطخ الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  9. بعد الحضانة ، قم بتجميع خلايا الحبيبات عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقها في 1 مل من RPMI الكامل الدافئ لإخماد تفاعل وضع العلامات.
  10. نبض الخلايا التائية CD4 + منخفضة CFSE عن طريق إضافة الببتيد محل الاهتمام بتركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل في RPMI الكامل واحتضانه لمدة 45 دقيقة في غلاف جوي 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  11. اغسل خلايا CD4 + T عالية CFSE ومنخفضة CFSE في RPMI كامل. كرر لمدة غسلتين إجمالا. أعد التعليق بتركيز 2 × 105 خلايا / مل لكل منها في RPMI كامل.
  12. امزج المجموعتين المستهدفتين بنسبة 1: 1 (CFSE-High: CFSE-Low) (انظر الشكل 1 اللوحة السفلية).
< p class = "jove_title" >3. الزراعة المشتركة

  1. من كل تخفيف لخلايا CD8 + T ، قم بزرع 100 ميكرولتر في طبق مكرر إلى 96 بئر مستديرة.
  2. أضف الخلايا التائية المستهدفة المختلطة CD4 + (100 ميكرولتر) إلى كل تخفيف من الخلايا المستجيبة للحصول على حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.
  3. لقياس موت الخلايا المبرمج القاعدي ، قم بزرع 3 آبار بالخلايا المستهدفة وحدها.
  4. احتضان الاستزراع المشترك لمدة 6 ساعات في غلاف جوي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.

4. تلطيخ التدفق الخلوي والاكتساب

  1. انقل الخلايا إلى صفيحة ذات 96 بئرا على شكل حرف V وصمة عار باستخدام رباعيات pMHC المترافقة ب PE لمدة 15 دقيقة في جو 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية.
  2. اغسل في 1x PBS-2٪ FBS والخلايا الملطخة بخلية ميتة قابلة للإصلاح Far Red LIVE / DEAD ، αCD3-Alexa700 ، αCD8-Percp ، αCD4-Brilliant Violet 650 لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
  3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS-2٪ FBS وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر مع 2٪ فورمالديهايد في 1x PBS.
  4. اكتساب الخلايا على مقياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يلخص المخطط الموجود في الشكل 1 هذا المقايسة. تم إعادة تعليق خلايا CD8+ T المنقاة (الخلايا المؤثرة) في 450 µl من وسط RPMI الكامل، وأُجريت تخفيفات تسلسلية عن طريق إضافة 225 µl من خلايا CD8+ T إلى الأنبوب التالي الذي يحتوي على 225 µl من الوسط (اللوحة العلوية). تم عد خلايا CD4+ T المنقاة (الخلايا المستهدفة)، وتقسيمها إلى أنبوبين، وصبغها بتركيزين مختلفين من CFSE (عالي ومنخفض) كما هو موضح في البروتوكول. تم تحفيز خلايا CFSE-low CD4+ T بالببتيد المعني، بينما ظلت خلايا CFSE-high CD4+ T غير محملة كعينة ضابطة. أُعي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح الفحص الموصوف هنا بالقياس الكمي للوظيفة الرئيسية لخلايا CD8 + التائية: النشاط المحلل للخلايا. يعد القياس الدقيق لهذه الوظيفة ذا أهمية قصوى عند توصيف وظائف المستجيب للخلايا التائية CD8 + ، حيث أفادت الدراسات السابقة عن وجود تناقض بين هذه الوظيفة وإفراز السيتوكين لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد10،11. نظرا لوقت حضانة الزراعة المشتركة القصير (6 ساعات) واستخدام الخلايا المستهدفة الذاتية ، هناك معدل منخفض للقتل غير المحدد للخلايا المستهدفة. لذلك فإن هذا الاختبار محدد للغاية وموثوق به. يمكن أيضا تعديل هذا الاختبا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مكتب السياحة والتجارة والتنمية الاقتصادية في فلوريدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تخصيب الخلايا التائية البشرية EasySep CD4 +الخلايا الجذعية19052
EasySep Human CD8 + T Cell EnrichmentKit الخلايا الجذعية19053
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit - لقياس التدفق الخلويInvitrogenC34554
Far Red LIVE / DEAD قابل للإصلاح للخلايا الميتةInvitrogenL10120
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Human CD3BD557943
Brilliant Violet 650 Anti-Human CD4 AntibodyBiolegend317435
PerCP المضاد للإنسان CD8 الأجسام المضادةBiolegend344707
RPMI 1640 متوسط 1xVWR10-040-CV
Penicillin-Streptomycin 100x SolutionInvitrogen15070063
مصل الأبقار الجنينية - ذهبي ، معطل بالحرارةPAAA15-252
لوحات 96 بئر ؛ معامله; قاع U. مع غطاءBD Falcon353077
25 مل بوليسترين معقم ، خزانات ملفوفة بشكل فرديالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2321-2230
96 بئر U-bottom ، معقمة 2 مل ألواح بئر عميقةThermo Scientific275743
Human IL-2 (v126) ، درجة البحثMiltenyi Biotec130-093-096
RoboSep Buffer ، عازلة فصلالخلاياالجذعية20104
15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلينBD Falcon352097
14 مل أنبوب دائري القاع ، مادة البولي بروبيلينBD Falcon352059
الخلية الجذعيةالمغناطيسية الرائعة EasySep18001
PBS 1xVWR21-040-CV
96-well ؛ صفيحة قاع على شكل V مع غطاءفيشر12-565-481
محلول الفورمالديهايد ، كاشف ACS ، 37 بالوزن ٪ في H2< / sub>OSigma-Aldrich252549-500ML
1.5 مل غطاء لولبي أنبوب صغير ، مخروطيSarstedt72.692.005

المراجع

  1. Appay, V., Van Lier, R. A. W., Sallusto, F., Roederer, M. Cytometry. 73, 975-983 (2008).
  2. Betts, M. R., Harari, A. Phenotype and function of protective T cell immune responses in HIV. Curr. Opin. HIV AIDS. 3, 349-355 (2008).
  3. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284, 553-555 (1980).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J. Immunol. 171, 27-31 (2003).
  5. Byers, A. M., Kemball, C. C., Moser, J. M., Lukacher, A. E. Cutting edge: rapid in vivo CTL activity by polyoma virus-specific effector and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 171, 17-21 (2003).
  6. Devevre, E., Romero, P., Mahnke, Y. D. LiveCount Assay: concomitant measurement of cytolytic activity and phenotypic characterisation of CD8(+) T-cells by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 311, 31-46 (2006).
  7. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  8. Mbitikon-Kobo, F. M., Bonneville, M., Sekaly, R. P., Trautmann, L. Ex vivo measurement of the cytotoxic capacity of human primary antigen-specific CD8 T cells. J. Immunol. Methods. 375, 252-257 (2012).
  9. Bryant, J., Day, R., Whiteside, T. L., Herberman, R. B. Calculation of lytic units for the expression of cell-mediated cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 146, 91-103 (1992).
  10. Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8(+) T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
  11. Trautmann, L., et al. Profound metabolic, functional, and cytolytic differences characterize HIV-specific CD8 T cells in primary and chronic HIV infection. Blood. 120, 3466-3477 (2012).
  12. Hildemann, S. K., et al. High Efficiency of Antiviral CD4(+) Killer T Cells. PLoS One. 8, (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

T CD8 MHC CFSE

مقالات ذات صلة