يمكن عزل خلايا عضلة القلب الفردية من الفئران البرية والطافرة عن القلب من أجل دراسة انقباضها وعابر الكالسيوم. هذا يسمح بتوصيف مساهمة الخلل الخلوي في ضعف القلب من أي سبب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحتوي خلايا عضلة القلب ، وهي خلية العمود الفقري للقلب ، على عناصر هيكلية خلوية وانقباضية منظمة بشكل رائع تولد قوة الانقباض المستخدمة لضخ الدم. تم عزل خلايا عضلة القلب الفردية لأول مرة منذ أكثر من 40 عاما من أجل دراسة فسيولوجيا وبنية عضلة القلب بشكل أفضل. تحسنت التقنيات بسرعة لتشمل الهضم الأنزيمي عن طريق التروية التاجية. في الآونة الأخيرة ، وفر تحليل الانقباض وتدفق الكالسيوم للخلايا العضلية المعزولة أداة حيوية في التحليل الخلوي والخلوي لفشل القلب. يوفر تخطيط صدى القلب ومخطط كهربية القلب معلومات حول القلب على مستوى الأعضاء فقط. توجد أنظمة زراعة خلايا عضلة القلب ، لكن الخلايا تفتقر إلى الهياكل الأساسية من الناحية الفسيولوجية مثل الأورام العضلية المنظمة والأنابيب التائية اللازمة لوظيفة الخلايا العضلية داخل القلب. في البروتوكول المقدم هنا ، يتم عزل خلايا عضلة القلب عن طريق نضح Langendorff. تتم إزالة القلب من الفأر ، وتركيبه عبر الشريان الأورطي إلى قنية ، وغمره إنزيمات الهضم ، ويتم إدخال الخلايا لزيادة تركيزات الكالسيوم. يتم استخدام برنامج الكشف عن الحواف والقشة العضوية لتحليل الانقباض ، ويتم استخدام صبغة فلورية ملزمة للكالسيوم لتصور عابرات الكالسيوم لخلايا عضلة القلب ذات الخطى الكهربائية. زيادة فهم الدور الذي تلعبه التغيرات الخلوية في ضعف القلب. يستخدم تقليديا لاختبار تأثيرات الأدوية على خلايا عضلة القلب ، ونستخدم هذا النظام لمقارنة الخلايا العضلية من الفئران والفئران WT مع طفرة تسبب اعتلال عضلة القلب التوسعي. هذا البروتوكول فريد من نوعه في مقارنته بالخلايا الحية من الفئران ذات وظائف القلب المعروفة وعلم الوراثة المعروف. تتم مقارنة العديد من الحالات التجريبية بشكل موثوق ، بما في ذلك التلاعب الجيني أو البيئي ، والعدوى ، والعلاج بالعقاقير ، والمزيد. بالإضافة إلى البيانات الفسيولوجية ، يمكن إصلاح خلايا عضلة القلب المعزولة بسهولة وتلطيخها لعناصر الهيكل الخلوي. يعد عزل خلايا عضلة القلب عن طريق التروية طريقة متعددة الاستخدامات للغاية ، وهي مفيدة في دراسة التغيرات الخلوية التي تصاحب أو تؤدي إلى قصور القلب في مجموعة متنوعة من الحالات التجريبية.
المقدمة
توفر خلايا عضلة القلب القوة الانقباضية للقلب. يحتوي كل خلية عضلية على عناصر هيكلية خلوية وانقباضية منظمة ضرورية للتقلص. لا يحتوي القلب على خلايا عضلة القلب فحسب ، بل يحتوي أيضا على الخلايا الليفية والأنسجة الضامة والخلايا العضلية المعدلة مثل ألياف بركنجي. يمكن ملاحظة التغييرات في أي من أنواع الخلايا هذه أو جميعها في قصور القلب ، مما يجعل تحديد السبب النهائي لضعف القلب أمرا صعبا. يسبق انخفاض الانقباض البطيني للقلب الفشل درجات متفاوتة من تراكم الأنسجة الليفية وتضخم وخلل في خلايا عضلة القلب1. يمكن أن يحدث عدم انتظام ضربات القلب بسبب خلل وظيفي في الخلايا الموصلة2 ، أو التليف الذي يقطع التوصيلالقلبي 3 ، أو التغيرات في التعبير عن القنوات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ضمان الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات باستخدام الحيوان المناسب والعناية بالجسم.
1. إعداد اسهم المخازن مقدما
- إعداد 2 لتر الأسهم الكالسيوم 2+ تايرود الملاحة في (الجدول 1). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- إعداد 2 لتر الأسهم 1.2 ملي كا 2+ تايرود (الجدول 2). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مرة واحدة يتم جمع انقباض واقتفاء أثر عابرة (الشكل 2)، ويتم تحليل البيانات بسهولة مع البرنامج المناسب. تتبع بأكمله، أو أجزاء منها يمكن متوسط (الشكل 3). يمكن تحليل انقباض في مجموعة متنوعة من الطرق. من أجل وظيفة الانقباضي، يمكن للمرء أن تقييم حجم الانكماش مع تقصير كسور، أو سرعة الانكماش مع مرور الوقت إلى الذروة تقصير، وتقلص السرعة. وظيفة الانبساطي يمكن تحليلها على نحو مماثل مع الوقت إلى 50٪ تقصير والاسترخاء السرعة. لالعابرين الكالسيوم وبيانات مشابه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
عزل العضلية الجودة يتطلب مستوى معين من الممارسة والتحسين. هذا البروتوكول يتضمن الخطوات الرئيسية التي يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج عملية الهضم. وينبغي النظر بعناية عند أداء هذه، ومخرج من البروتوكول. ينبغي التقليل من الوقت من ازالة القلب إلى القسطرة ونضح، من الناحية المثالية أقل من خمس دقائق. سوف الشطف قلب فورا في المخزن نضح الجليد البارد بعد إزالة من الماوس وتشريح وcannulating قلب في المخزن الجليد الباردة أيضا زيادة فرص الهضم الجودة. والقسطرة في حد ذاته هو خطوة حاسمة. يجب وضع غ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
مارك زنياك لاستخدام قسم الخليوي والتنموية المعدات الأحياء بالفيديو.
جامعة فاندربيلت التصوير خلية الموارد المشتركة.
وأيد هذا العمل من منحة AHA 12PRE10950005 لتخطيط موارد المؤسسات، منحة AHA 11GRNT7690040 إلى DMB، NIH منحة R01 HL037675 إلى DMB. DMB هو رئيس غلاديس P. Stahlman في أبحاث القلب والأوعية الدموية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كلوريد الصوديوم | RPI | S23020 | |
| KCl | سيجما | P-3911 | |
| MgCl2 | سيجما | M-8266 | |
| هيبس | EM العلوم | S320 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2& middot; 2H 2 < / sub > O | فيشر | C79 | |
| D- (+) - الجلوكوز | سيجما | G7528 | |
| 2،3-بوتانيديون مونوكسيم (BDM) | سيجما | B-0753 | |
| التورين | سيجما | T-0625 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | سيجما | A-7030 | |
| كولاجيناز ب | تشخيص روش | 1-088-823 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 1-088-882 | |
| Protease XIV | Sigma | P-5147 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals، LLC | 401586D | |
| Isofluorane | Butler Schein | 11695-6776-2 | |
| Fura-2 AM | Teflabs | 103 | |
| DMSO & ndash ؛ اللامائية | Sigma | 276855 | |
| نظام تنظيم سرعان الخلايا وتحليل الفلورسنت | IonOptix | ||
| 250 & mu ؛ مرشح شبكة النايلون | م سيفار أمريكا | لاب باك 03-250 / 50 | |
| 23 جرام محول لور كعب | بكتون ديكنسون | 1482619E | |
| PE-50 أنابيب | بيكتون ديكنسون | 427410 |
المراجع
- Babick, A. P., Dhalla, N. S. Role of Subcellular Remodeling in Cardiac Dysfunction due to Congestive Heart Failure. Medical Principles and Practice. 16, 81-89 (2007).
- Nogami, A. Purkinje-Related Arrhythmias Part I....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
