يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياسات المجهر بالفيديو داخل الحيوية لتدفق دم الشبكية في الفئران

5.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51110

⸱

ديسمبر 26, 2013

 ,  , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

يمكن استخدام الفحص المجهري داخل الحيوية في لتصور وقياس أقطار الأوعية الدموية في الشبكية ، وسرعات مجرى الدم ، وتدفق الدم الكلي في الشبكية.

الملخص

يمكن أن تساهم التغيرات في تدفق الدم في الشبكية في أمراض العين والخلل البصري أو تكون نتيجة لها. لذلك ، يمكن أن يساعد القياس الكمي للتروية المتغيرة في البحث في آليات أمراض الشبكية. يمكن استخدام الفحص المجهري بالفيديو داخل الحيوية لمتتبعات الفلورسنت لقياس أقطار الأوعية الدموية وسرعات مجرى الدم في الأوعية الدموية الشبكية ، وتحديدا الشرايين المتفرعة من الشريان الشبكي المركزي والأوردة المؤدية إلى الوريد الشبكي المركزي. يمكن حساب معدلات تدفق الدم من الأقطار والسرعات ، مع مجموع التدفق الشرياني ، والتدفق الوريدي بشكل منفصل ، مما يوفر قيما لإجمالي تدفق الدم في الشبكية. تصف هذه الورقة والفيديو المرتبط بها طرق تطبيق هذه التقنية على الفئران ، والتي تشمل 1) تحضير العين للفحص المجهري داخل الحيوية للحيوان المخدر ، 2) التسريب الوريدي للكريات المجهرية الفلورية لقياس سرعة مجرى الدم ، 3) التسريب الوريدي لديكستران فلوري عالي الوزن الجزيئي ، للمساعدة في التصور المجهري للأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، 4) استخدام كاميرا مجهر رقمي للحصول على مقاطع فيديو لشبكية العين المنفوخة ، و 5) استخدام برامج معالجة الصور لتحليل الفيديو. يمكن استخدام نفس التقنيات لقياس معدلات تدفق الدم في الشبكية في الفئران.

المقدمة

< p class = "jove_content" > الشبكية هي واحدة من أكثر الأنسجة نشاطا في الجسم ، وبالتالي تتطلب إمدادات دم سخية. تلبي دورتان منفصلتان هذا الطلب: الدورة الدموية المشيمية للجزء الخارجي من شبكية العين ، والدورة الدموية في الشبكية للجزء الداخلي من شبكية العين. تعد فحوصات تروية الشبكية ضرورية لفهم الآليات المرضية وعواقب اعتلال الشبكية السكري ، واعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين ، وانسداد الشريان أو الوريد ، والسكتة الدماغية. تم استخدام عدة طرق لتحديد تدفق الدم في الشبكية ، مع كل تقنية لها مزاياها وعيوبها وقيودها وافتراضاتها. من بين هذه التقنيات ضخ الكريات المجهرية بقطر 7-8 ميكرومتر التي تستقر في الشرايين قبل الشعيراتالدموية 1،2 ، والتصوير الذاتي الكمي3،4 ، والتصوير المقطعي للاعتلال الوعائي البصري والتماسك البصري5،6 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي7،8 ، والفحص المجهري بالفيديوداخل الحيوية 9-16. تشمل مزايا هذا الأخير التصور المباشر لأوعية الشبكية وتدفقها ، والاعتماد على عدد قليل من الافتراضات البسيطة فقط ، والقدرة على تحمل التكاليف للمختبرات التي تحتوي على مجهر مضان مع كاميرا فيديو متصلة. في الدراسات السابقة للفحص المجهري بالفيديوداخل الحيوية 9-16 ، تم استخدام ديكستران الفلورسنت كعلامة بلازما ، وتم استخدام خلايا الدم الحمراء المصنفة بالفلورسنت (من متبرع) كعلامات سرعة. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام الكريات المجهرية ذات التصنيف الفلوري بقطر 1.9 ميكرومتر ، بدلا من خلايا الدم الحمراء ، لقياس السرعة ، مع هذا التغيير الذي يلغي الحاجة إلى متبرع بخلايا الدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت مراجعة الإجراءات التي تنطوي على استخدام والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في LSUHSC-S وتم تنفيذها وفقا للمعايير التي حددتها المعاهد الوطنية للصحة.

< p class = "jove_title" >1. تحضير حلول التروية

  1. Sonicate محلول مخزون 1٪ (بالوزن) من الكريات المجهرية بقطر 1.9 ميكرومتر.
  2. اسحب ~ 25-30 × 106 كريات فلورية خضراء (أي ~ 10 ميكرولتر من محلول المخزون) في حقنة 300 ميكرولتر. قم بتخفيف الكريات المجهرية عن طريق سحب 240 ميكرولتر إضافي من المحلول الملحي في المحقنة.
  3. تحضير محلول 50 ميكرولتر من 2 × 10 6 ديكستران فلوري ذو وزن جزيئي مذاب في محلول ملحي معقم ، مع جرعة محقونة في حدود 3-10 مجم / كجم. احتفظ بالديكستران مغطى بورق الألمنيوم حتى يحين وقت التسريب.
فئة

2. التخدير الحيواني وقنية الأوعية

الدموية
  1. تخدير للإدخال الجراحي للقنيات الوعائية ولتحديد المواقع الثابتة تحت هدف المجهر. تتوفر العديد من خيارات بروتوكولات التخدير ، مع مزايا وعيوب مختلفة ، وتأثيرات محتملة على المعلمات الجهازية. من بين العديد من الخيارات المختلفة مزيج من الكيتامين (100-150 مجم / كغ) ، والزيلازين (10 مجم / كغ) ، وأسيبرومازين (2 مجم / كغ) ، أو مزيج من الكيتامين (50 مجم / كغ) والبنتوباربيتال (50 مجم / كغ). الإجراءات الموصوفة حادة وتنتهي بالقتل الرحيم الناجم عن جرعة زائدة من البنتوباربيتال (150 مجم / كغ) متبوعا ببضع الصدر. إدراج مسكن ليس ضروريا للإجراء النهائي.
  2. احتفظ بوسادة تدفئة أسفل لبقية التجربة.
  3. حافظ على رطوبة العينين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات أثناء عمليات الإدخال الجراحية اللاحقة للقنيات الوعائية.
  4. قم بإعداد قنية الأوعية الدموية للحقن اللاحقة لمتتبعات الفلورسنت. يتم وضع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم (على سبيل المثال ، 0.28 مم القطر الداخلي ؛ 0.61 مم القطر الخارجي) على طرف إبرة حقنة ، مع قطع الطرف الحاد للإبرة مسبقا عن طريق الانحناء ذهابا وإيابا باستخدام مرقئ.
  5. املأ حقنة وأنبوب بمحلول ملحي هيبارين (25 وحدة / مل).
  6. احلق جانبا واحدا من أسفل البطن وقم بعمل شق لكشف الوريد الفخذي.
  7. لتقنب الوريد الفخذي ، اربط الوعاء بخياطة 5.0 ، وقم بعمل شق جزئي في الوعاء (حوالي نصف قطر الوعاء) ، وأدخل الأنبوب في الوعاء ، وقم بتأمين الأنبوب مع خياطة مربوطة حول القسم المقن.
< p class = "jove_title" >3. التحضير للفحص المجهري داخل الحيوية

  1. قم بتوسيع حدقة العين بقطرة من محلول تروبيكاميد للعيون 1٪ متبوعا بقطرة 2.5٪ محلول هيبروميلوز للعين.
  2. غطي العين بغطاء زجاجي مقاس 5 مم.
  3. ضع على لوح زجاجي ، والذي سيتم وضعه تحت هدف المجهر للمجهر المستقيم. ضع شاشا جراحيا بشكل استراتيجي أسفل الرأس للسماح بمحور مباشر عبر الهدف إلى الشبكية المركزية والقرص البصري.
  4. ركز من خلال المجهر على القرص البصري ، وابحث عن القرص بهدف 4X منخفض الطاقة واستخدم مرشح الفلورسين.
< p class = "jove_title" >4. ضخ الكريات المجهرية الفلورية لقياس السرعات

  1. باستخدام هدف 4X ، ركز على شبكية العين مع وجود القرص البصري في وسط مجال الرؤية.
  2. قم بغرس محلول الكرة المجهرية الفلورية بمعدل 250 ميكرولتر / دقيقة / كجم.
  3. قم بتسجيل شبكية العين القابلة للعرض بالفيديو حول القرص البصري ، باستخدام وقت تعرض الكاميرا ~ 8 مللي ثانية.
  4. أوقف ضخ الكرة المجهرية عند تسجيل مدة كافية من الفيديو (1-2 دقيقة) ؛ من المحتمل أن يظل بعض محلول الكرة المجهرية غير مستخدم.
< p class = "jove_title" >5. ضخ علامة البلازما الفلورية لقياس الأقطار

  1. باستخدام هدف 4X ، ركز على شبكية العين مع وجود القرص البصري في وسط مجال الرؤية.
    2. قم
  2. بغرس المحلول المحضر من ديكستران الفلورسنت في الوريد الفخذي كبلعة تزيد عن ~ 5 ثوان ، أثناء تسجيل الفيديو. سيساعد هذا الفيديو في تحديد هوية الشرايين مقابل الأوردة ، مع انتشار الشرايين أولا. قم بتنفيذ هذه الخطوة مع ضبط وقت التعرض للكاميرا على ~8 مللي ثانية، على الرغم من أن وقت التعريض الدقيق ليس حرجا.
  3. قم بالتبديل إلى هدف 10X ووقت تعريض ضوئي من 20 إلى 40 مللي ثانية لتحسين الدقة لفيديو كل من الشرايين 4-7 و4-7 وريد في شبكية العين السطحية. ركز على (وتسجيل الفيديو) ما يقرب من ربع واحد من شبكية العين القابلة للعرض في كل مرة ، مع وجود مركز القرص البصري في أحد أركان مجال الرؤية. يجب بذل محاولة لتقليل الوقت الذي يضيء فيه ضوء المجهر الأنسجة لتقليل احتمالية السمية الضوئية الناجمة عن الضوء /الصبغة 17.
< p class = "jove_title" >6. تحليل الفيديو

  1. باستخدام مقياس ميكرومتر ، قم بمعايرة نظام الفيديو لتحويل ميكرومتر / بكسل.
  2. باستخدام برنامج معالجة الصور ، قم بتشغيل الفيديو المسجل.
  3. من فيديو ضخ بلعة ديكستران الفلورسنت ، حدد الشرايين مقابل الأوردة.
  4. لكل من 4-7 شرايين و 4-7 وريد مسجلة بهدف 10X ، قم بقياس الأقطار المملوءة بالفلورسنت ديكستران ، بمتوسط 5 مقاييس للقطر لكل وعاء على طول الطول القابل للعرض.
  5. لكل من الشرايين والأوردة نفسها ، قم بقياس طول خط الكريات المجهرية الفلورية ، باستخدام 10 خطوط كريية مجهرية متتالية في كل وعاء لتجنب تحيز الاختيار. اقسم أطوال الخطوط على وقت التعرض لحساب سرعة الكرة المجهرية ، على سبيل المثال ، 160 ميكرومتر / 8 مللي ثانية = 20 ميكرومتر / مللي ثانية = 2 سم / ثانية. متوسط 10 سرعات لكل سفينة.
  6. احسب معدل التدفق الحجمي لكل سفينة بالمعادلة التالية: التدفق = متوسط السرعة × π × القطر2/4.
  7. اجمع معدلات التدفق الشرياني ، وبشكل منفصل معدلات التدفق الوريدي ، للحصول على تدفق الدم الكلي للشبكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1 تُظهر لقطات مفردة من فيديو تجربة، مع عرض الألواح من A إلى D ومن F إلى I لآثار كريات مجهرية فلورية مُلتقطة باستخدام عدسة موضوعية 4X وزمن تعريض 8 مللي ثانية (مع دمج بكسلات 2 × 2 لتقليل حجم ملف الفيديو). الشكل 1E يُظهر اتجاه الأوعية الشبكية في الأجزاء الأخرى من الشكل. لن تحتوي كل إطار من أطر الفيديو بالضرورة على خط مضيء واضح التركيز؛ ومع ذلك، قد تحتوي بعض الإطارات على عدة خطوط مضيئة يمكن استخدامها في التحليل (مثلاً اللوحات C وD وG وH وI). في هذه التجربة، كانت معظم البقع الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن تطبيق هذه التقنية من الفحص المجهري بالفيديو داخل الحيوية ليس فقط على الفئران ، ولكن أيضا على الفئران. يعتمد هذا البروتوكول على عدة افتراضات فقط ، ولكنه يقتصر على الاستخدام تحت التخدير ومع اتساع حدقة العين كما وصفناه. الافتراضات والقيود الأخرى هي كما يلي:

1. افتراض الحد الأدنى من خطأ التكبير البصري الناتج عن الطبيعة الانكسارية للعين. كما وصفه آخرون18-20 ، فإن طريقة ملء الفراغ بين القرنية والغطاء بطبقة سائلة من محلول العيون تقاوم القوة الانكسارية للقرنية. أي تكبير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

بتمويل من NIH EY017599 (NRH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مختبرات القارات المجهرية الفلوريةFS04F / 10584 (أخضر)
مجساتجزيئية عالية الوزن الجزيئي الفلوري ديكسترانD-7137 (أخضر) ؛ D-7139 (أحمر)
نظام المجهرنيكونEclipse E600FN + المرفقات 4X
موضوعينيكونخطة فلور 4Xالفتحة العددية 0.13 ؛ مسافة العمل 17.2 مم
10X موضوعيخطة نيكون10Xالفتحة العددية 0.25 ؛ مسافة العمل 10.5 مم
محلول العيون تروبيكاميدBausch Lomb1٪ Tropicamide
محلول طب العيون HypromelloseHUB Pharmaceuticals2.5٪ Goniovisc
برنامج معالجة الصوركاليفورنيا سان فرانسيسكو فالي لابمايكرو مدير
كاميرا فيديو رقمية للفحصالمجهري القياساتالضوئية CoolSnap ES1392 × 1040 بكسل دقة ؛ حجم البكسل 6.45 × 6.45 & م
جامعة

المراجع

  1. Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization. Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).
  2. Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique. Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).
  3. Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats. Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).
  4. Pouliot, M., et al. Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP). Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).
  5. Zhi, Z., et al. Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography. Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).
  6. Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography. Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).
  7. Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats. Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).
  8. Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).
  9. Wright, W. S., Harris, N. R. Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina. Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).
  10. Lee, S., Harris, N. R. Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice. Microcirculation. 15, 379-387 (2008).
  11. Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist. Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).
  12. Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan. Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).
  13. Yadav, A. S., Harris, N. R. Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse. Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).
  14. Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics. Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).
  15. Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse. Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).
  16. Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina. Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).
  17. Rumbaut, R. E., Sial, A. J. Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates. Microcirculation. 6, 205-213 (1999).
  18. Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice. Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).
  19. Walsh, M. K., Quigley, H. A. In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice. J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).
  20. Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).
  21. Hughes, A. A schematic eye for the rat. Vis. Res. 19, 569-588 (1979).
  22. Remtulla, S., Hallett, P. E. A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat. Vis. Res. 25, 21-31 (1985).
  23. Schmucker, C., Schaeffel, F. In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry. Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).
  24. Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).
  25. Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate. Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المجهر الحيويالكريات الدقيقة الفلوريةالأوعية الدموية الشبكيةسرعة تدفق الدمقياس قطر الوعاء الدمويالديكستران الفلوريكاميرا المجهر الرقميةبرنامج معالجة الصورشبكية فأر
قياسات المجهر بالفيديو داخل الحيوية لتدفق دم الشبكية في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.