مقالة منهجية

عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة

17K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51116

⸱

أبريل 21, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department NeuroFarBa, Division of Pharmacology, University of Florence, 2Department of Clinical and Experimental Medicine, Division of Physiology, University of Florence

في هذه المقالة

ملخص

المعرفة الحالية على أساس الخلوية من أمراض القلب تعتمد في الغالب على دراسات على نماذج حيوانية. نحن هنا وصف والتحقق من صحة طريقة جديدة للحصول العضلية قابلة للحياة واحد من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني الإنسان. myocytes البطين الإنسان يمكن أن تستخدم للدراسات الكهربية واختبار المخدرات.

الملخص

تخضع العضلية من قلوب المريضة إلى العمليات المعقدة التي تنطوي على إعادة عرض التغيرات في بنية الخلية، الإثارة انكماش اقتران والتيارات أيون الغشاء. ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن زيادة خطر محدث اضطراب النظم والتعديلات التي تؤدي إلى ضعف مقلص الانقباضي والانبساطي في مرضى القلب تلك التغييرات. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات على التعديلات وظيفة خلية عضلية في أمراض القلب من النماذج الحيوانية.

نحن هنا وصف والتحقق من صحة بروتوكول لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لعمليات جراحية في القلب. يوصف البروتوكول بالتفصيل. وذكرت القياسات الكهربية والكالسيوم داخل الخلايا لإثبات جدوى لعدد من القياسات وحيدة الخلية العضلية في البطين الإنسان التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب.

ذكرت وبروتوكول انهيمكن أن يكون مفيدا لإعادة التحقيقات مستقبل أساس الخلوية والجزيئية من تعديلات وظيفية من قلب الإنسان في وجود أمراض القلب المختلفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد أهداف علاجية جديدة على المستوى الخلوي واختبار فعالية مركبات جديدة على العضلية البشرية، مع قيمة متعدية المباشرة.

المقدمة

تشريح الخصائص الكهربية لعضلة القلب قد تقدم بشكل ملحوظ بعد تطوير تقنيات لعزل واحد خلية عضلية قلبية. كما بذلت التطورات الأخيرة في فهم القلب الإثارة تقلص اقتران (EC-اقتران) بفضل القدرة على عزل العضلية واحد قابلة للحياة التي تحتفظ كافة الخصائص الفسيولوجية للأنسجة سليمة. ويعمل أساليب التصحيح المشبك بشكل روتيني لدراسة وظيفة وتعديل الدوائية للsarcolemmal القلب التيارات أيون. كما أجريت تسجيلات لديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع كا 2 + الأصباغ الحساسة بانتظام على myocytes القلب واحد من مجموعة متنوعة من النماذج السليمة والمريضة، وتوفير البيانات الحيوية على فسيولوجيا EC-اقتران وكذلك على التغيرات المرضية من داخل الخلايا كا 2 + مما يؤدي إلى اختلال التوازن الميكانيكية وزيادة العبء محدث اضطراب النظم في أمراض القلب. انفورمانشوئها من هذه الدراسات هو أمر حاسم لفهم الآثار الكهربية والميكانيكية المخدرات في الإعداد السريرية. ومع ذلك، هناك اختلافات محددة في الأنواع التيارات وعبر الغشاء في البروتينات EC-اقتران التي تمثل سمات محددة من إمكانات العمل القلب والميكانيكا القلب. وهكذا، في حين أوضحت دراسات myocytes المعزولة من الثدييات غير البشرية الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للأدوار القنوات الأيونية عبر الغشاء محددة والبروتينات EC-اقتران، فإنها لا توفر بالضرورة النماذج ذات الصلة من myocytes القلب البشري. وبالتالي عزلة myocytes قابلة للحياة من عضلة القلب البشري هو ضروري لفهم كامل للالفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب والتحقق من صحة النهج العلاجية الرواية.

النسيج الأذيني الإنسان متاحة بسهولة في كثير من الأحيان يتم تجاهل الزوائد الأذيني أثناء العمليات الجراحية. الدراسات الكمية الأولي من إمكانات العمل القلب البشري الكبار ومكعب الأيونيةrrents العاملين الخلايا الأذيني معزولة إنزيمي 1-4. وقد تم الإبلاغ عن تسجيلات لإمكانات العمل أو تيارات من خلايا الإنسان البالغ البطين المعزولة في وقت لاحق 3،5-10. وقد استخدمت معظم هذه الدراسات تم الحصول عليها من خلايا قلوب explanted والاستفادة منها إما كولاجيناز نضح من شريحة الشريان التاجي أو التعرض كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة رفعه إلى كولاجيناز للحصول على خلايا معزولة. سمحت هذه الدراسات على توصيف مفصل لعدد من التيارات عبر الغشاء أيون من العضلية البطين الإنسان من قلوب سليمة ومن المرضى الذين يعانون من قصور في القلب الطرفية. تسجيلات من نوع L-كا 2 + الحالية (I CA-L) 5-7، عابر الحالية البوتاسيوم الخارج (أنا ل) 8، الداخل المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ1) 8، ومكونات مختلفة من تأخر المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ ) تم الإبلاغ عن 9. السلف وتكريرالإجراء العزلة 10، يسمح للتوصيف واضح للأساس الأيونية للزيادة المحتملة محدث اضطراب النظم في فشل القلب المحطة، التي تضم 11 إطالة عمل محتمل، وتأخر بعد depolarizations 12 وزيادة مضحك الحالي 13 مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدق سابقا لأوانه.

يتم عزل myocytes القلب الكبار عادة من الحيوانات الصغيرة عن طريق نضح الوراء من القلب كله مع خليط من مختلف انزيم، وهي تقنية التي تنتج غلة عالية من الكالسيوم 2 + الخلايا التي تتحمل 14. عزلة myocytes القلب من شظايا الأنسجة هي بطبيعتها أقل نجاحا ربما بسبب وصول محدود من الانزيمات لmyocytes الفردية مقارنة مع تلك التي نضح من الشرايين التاجية التي تحققت. بسبب توافر محدود جدا من قلوب المانحة غير المستخدمة، والطريقة العملية الوحيدة للحصول على خلايا البطين الإنسان العادي على أساس منتظم هي digestio الأنزيميةن من شظايا الأنسجة في كثير من الأحيان صغيرة جدا رفعه أثناء العمليات الجراحية الاختيارية. نموذج المرض البشري الوحيد الذي اتسم بدقة على مستوى الخلية هو قصور القلب المحطة، نظرا لإمكانية الوصول إلى قلوب المزروعة. ومع ذلك، يحدث فشل القلب محطة في أقلية من المرضى وينطوي على الطريق الشائع للإعادة حاد في خلايا عضلة القلب، وهي مستقلة نسبيا من السبب الكامن وراء 15 في كثير من الأحيان. القدرة على تقييم وظيفة العضلية واحد من المرضى في مرحلة مبكرة غير الفشل من المرض أمر حاسم لفهم الفيزيولوجيا المرضية محددة من الظروف الموروثة أو المكتسبة مختلفة. اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) هو مثال القصص. HCM هو مشترك (1/500 فرد) حالة القلب القابلة للتوريث تتميز تضخم القلب، وزيادة خطر ومقلص التعديلات محدث اضطراب النظم بسبب انسداد المسالك وتدفق الخلل الانبساطي 16. العضلية من قلوب HCM يوndergo على عمليات إعادة معقدة تنطوي على تغييرات في هيكل الخلية (تضخم، حالة من الفوضى myofibrillar) واقتران EC-17. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات من ضعف خلية عضلية في HCM من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. منذ أقلية فقط من المرضى HCM تتطور نحو فشل القلب محطة ويتطلب زرع القلب، هي جدا نادرا ما تتوفر لعزل الخلايا مع الأساليب القياسية قلوب HCM. ومع ذلك، لا يقل عن 30٪ من المرضى الذين تظهر عليهم أعراض الانسداد HCM بسبب تدفق هائل الحاجز تضخم المحورة لتدفق الدم أثناء انقباض المسالك (HCM) 18. الخيار العلاجية المتاحة الأكثر فعالية للتخفيف من انسداد في HCM هو الحاجز الجراحية استئصال العضلة: خلال هذه العملية الجراحية، تتم إزالة جزء متغير الحجم من الحاجز العلوي نهج الأبهر غير المشبعة. هذا الجزء من الحاجز متضخما وبالتالي تتوفر لعزل الخلايا من أنسجة جديدة.

وهناك طريقة لعزل ventricula الإنسانص myocytes من واحد، عبر الوريد عينات خزعة شغاف وعضلة القلب صغيرة وقد وضعت سابقا ونشرت 19. نفذنا طريقة لعزل myocytes الحاجز واحد من عينات عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من HCM تمر استئصال العضلة الحاجز والمرضى الذين يخضعون لإجراءات استبدال صمام. بالإضافة إلى وصف مفصل للبروتوكول العزلة، ممثل الكهربية والكالسيوم 2 + مضان يتم عرض القياسات، مما يدل على جدوى معزولة myocytes البطين الإنسان وجدوى المشبك التصحيح والكالسيوم داخل الخلايا 2 + دراسات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية على الأنسجة البشرية من قبل اللجنة الأخلاقية من جامعة مستشفى Careggi (2006/0024713؛ تجدد مايو 2009). أعطى كل مريض الموافقة المسبقة عن مكتوب.

1. حلول وإعداد معدات

ووصف الحلول في الجدول 1. تم العثور على مخطط مبسط لإجراء العزل الخلية في الشكل 1.

حل CP DB KB مرض السل PS EB1 EB2
كاشف (ملم) KH 2 PO 4 50
MgSO 4 8 1.2 5 1.2 1.2
HEPES 10 10 10
الأدينوزين 5
جلوكوز 140 10 20 10 10 10
مانيتول 100
التورين 10 20 5 20 20
كلوريد الصوديوم 113 136 113 113
بوكل 4.7 85 5.4 25 4.7 4.7
MgCl 2 1.2 5
KH 2 PO 4 0.6 30 0.6 0.6
نا 2 هبو 4 0.6 0.6 0.6
NaHCO 3 12 12 12
KHCO 3 10 10 10
NA-البيروفات 4 4 4
BDM 10 10 10
BHBA 5
حمض السكسينيك 5
EGTA 0.5
K-2 ATP 2
حمض البيروفيك 5
الكرياتين 5
KMES 115
الأنزيمات (U / مل) كولاجيناز نوع V 250 250
النوع البروتيني الرابع والعشرون 4
درجة الحموضة 7.4 KOH 7.3 هيدروكسيد الصوديوم 7.1 KOH 7.35 هيدروكسيد الصوديوم 7.2 KOH 7.3 هيدروكسيد الصوديوم 7.3 هيدروكسيد الصوديوم

. الجدول 1 حلول المستخدمة لجمع العينات، والعزلة خلية وتوصيف وظيفي من myocytes CP = حل شلل القلب؛ DB = تفارق العازلة؛ KB = حل كرافت-Bruhe؛ السل = عازلة تايرود؛ PS = حل ماصة؛ EB1 = انزيم العازلة 1؛ EB2 = انزيم العازلة 2.

  1. إعداد شلل القلب (CP) حل. ويمكن تخزين حل CP في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع.
  2. إعداد كا 2 + خالية من التفكك العازلة (DB). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
  3. إعداد كرافت-Bruhe (KB) حل. ويمكن تخزين KB الحل في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 ويك.
  4. إعداد كا 2 + خالية العازلة تايرود (السل). ينبغي استخدام هذا الحل خلال اليوم.
  5. تصفية جميع الحلول باستخدام مرشحات حقنة قبل استخدامها.
  6. إعداد جهاز الهضم (الشكل 2)، وعاء مصنوع من تجريف اثنين من فرش تواجه من السيليكون والمطاط الصناعي، واحدة منها استدارة بواسطة محرك كهربائي. هو العرف الجهاز الهضم. التفاصيل على الجهاز الهضم هي في الشكل 8؛ صور الجهاز في الشكلين 2 C و 2D. غسل الغرفة الأنسجة مع الايثانول 70٪ والمياه.

2. جمع وتجهيز العينات عضلة القلب

  1. صب 40 مل من cardiplegic (CP) الحل في أنبوب 50 مل وتخزينها في الجليد لنقل عينة من غرفة المنطوق إلى المختبر العزلة الخلية.
  2. جمع العينة عضلة القلب البطيني من غرفة المنطوق مباشرة بعد الختان، وغسله مع الثلج الباردةالحل CP وتخزينها في الأنبوب. استخدام العينات الشغاف رفعه من الحاجز البطيني العليا المشتركة خلال جراحة القلب المفتوح، الترجيح> 100 ملغ.
  3. بسرعة نقل العينة إلى المنطقة المختبر؛ بدء تجهيز العينات في غضون 10 دقيقة من العينة الختان.
  4. مع الحفاظ على العينة في المخزن الجليد الباردة CP، وإزالة بعناية طبقة تليفي الشغاف باستخدام مقص غرامة تحت stereomicroscope؛ بعد ذلك، قص الأنسجة عضلة القلب إلى قطع صغيرة (2-3 ملم طويلة). اعتمادا على حجم العينة الأنسجة، وقطع المبلغ الإجمالي للالبطين عضلة القلب ما بين 100 ملغ و 1 غرام لكل العزلة.
  5. عند الانتهاء من تنميق الأنسجة، ونقل أجزاء عضلة القلب في الجهاز الهضم، مع الجليد نظيفة حل CP الباردة. تجنب ملء مجلدا كاملا بين اثنين من فرش السيليكون (3-4 مل) مع قطع عضلة القلب، وذلك باستخدام ما لا يزيد عن 1 غرام من الأنسجة المجموع.

3. الغسيل والهضم من عضلة القلب قطعة غليظة

  1. الخلفإيه يتم نقل قطع في غرفة تجريف للجهاز الهضم، وتغيير المخزن المؤقت CP في غرفة مع الكالسيوم الباردة 2 تفارق العازلة خالية من + (DB).
  2. وضع الجهاز الهضم في حمام الحراري، وذلك للغرفة ليكون في اتصال مع الماء الساخن في الحمام (الشكل 1). تعيين الحمام إلى 37.5 درجة مئوية، وتشغيله، وذلك لرفع درجة الحرارة ببطء من الغرفة الأنسجة. تشغيل المحرك للجهاز الهضم، وتحديد سرعة دوران الثورة إلى 1 / ثانية.
  3. تنفيذ 3 دورات الغسيل مع DB، وتغيير الحل في غرفة نظيفة مع DB كل 8 دقائق. وارتفعت درجة حرارة DB (37 ° C) والأكسجين المشبع قبل الحصول على اتصال مع أجزاء عضلة القلب.
  4. إعداد انزيم عازلة 1 (EB1) وذلك بإضافة 250 U / مل من كولاجيناز نوع V و 4 U / مل البروتياز نوع الرابع والعشرون لحل DB. إعداد انزيم العازلة 2 (EB2) وذلك بإضافة 250 U / مل كولاجيناز نوع V إلى حل DB. الاحماء (37 ° C) وoxygenatه EB1 وEB2.
  5. تنفيذ دورتين 12 دقيقة من عملية الهضم في الجهاز الهضم بالتناوب مع EB1 الاوكسيجين 100٪ (عند 37 درجة مئوية). في كل دورة، استخدم ~ 3 مل من EB1. إزالة حل عن طريق الشفط ماصة وتجاهل أنه بعد كل دورة.
  6. 6 إعداد 15 مل أنابيب لجمع الخلايا و~ 80 مل من البرد (4 درجات مئوية) KB حل ليبلغ حجمه المخازن المؤقتة.
  7. إجراء دورة الهضم 15 دقيقة الأولى مع 3 مل 100٪ EB2 الاوكسيجين في 37 درجة مئوية. بعد دورة الهضم، وجمع محلول يحتوي على myocytes فصلها الأول في أنبوب 15 مل وتمييع تعليق الخلية مع 12 مل KB الباردة الحل. تخزين مسطحة أنبوب في درجة حرارة الغرفة.
  8. تمييع الحل EB2 المتبقية مع مبلغ مساو من DB من أجل خفض تركيز كولاجيناز الخامس للدورات التالية الهضم.
  9. تنفيذ دورات أخرى 5 12 دقيقة الهضم مع 3 مل EB2 عند 37 درجة مئوية؛ بعد كل منهم جمع من خلية عضلية تحتوي على العازلة في أنبوب مخروطي 15 مل وتمييع مع 12 مل KB الحل. تخزين الخلايا التي تحتوي على أنابيب 6 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

4. إعادة تعليق الخليوي وكا 2 + إعادة التكيف

  1. إضافة 1 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) إلى 20 مل كا 2 + خالية من تايرود العازلة (السل). تحديد الحل.
  2. أجهزة الطرد المركزي لستة خلية عضلية تحتوي على أنابيب مخروطية في 100 x ج لمدة 5 دقائق لإجبار myocytes لتسوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا في كل أنبوب مع كمية متغير (1-3 مل، اعتمادا على المحصول) من جيش صرب البوسنة التي تحتوي على السل في RT.
  3. تدريجيا يزيدون كا 2 + تركيز في المخزن المؤقت الخلية التي تحتوي بإضافة مأخوذة صغيرة من 100 مليمول / لتر و CaCl 2 الحل. في الخطوات الأولى والثانية يتم رفع كا 2 + تركيز تصل إلى 50 ميكرومول / لتر و 100 ميكرومول / لتر، على التوالي. يتم تنفيذ الخطوات كا 2 + بالإضافة التالية كل 5 دقائق ويتم رفع تركيز بنسبة 100 ميكرومول / لتر في كل خطوة رالزراعة العضوية تركيز النهائي من 0.9 ملمول / لتر.
  4. تقييم العائد من إجراء العزل. نقل 0.5 مل من خلية عضلية تحتوي على الحل على غرفة أسفل الزجاج من المجهر. تقييم 15 حقلا المجهر على التكبير 10x الهدف وحساب النسبة المئوية من myocytes صحية (مثل قضيب على شكل الخلايا مع التصدعات واضحة ولا شوائب كبيرة، الشكل 2). العائد المتوقع هو حوالي 20٪.

5. التقييم الوظيفي للالمعزولة العضلية.

بروتوكول التالي هو مثال من cardiomyocyte تقييم وظيفي الإنسان بما في ذلك التسجيلات في وقت واحد من إمكانات العمل والكالسيوم داخل الخلايا 2 + التدفقات.

  1. إعداد الحل ماصة (PS) لإجراء التجارب المشبك التصحيح في التكوين التصحيح مثقبة. ويمكن تخزين الحل في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. إضافة 1.8 ملمول / لتر و CaCl 2 إلى كا 2 عازلة خالية من تايرود + (السل). Uحد ذاته هذا الحل لsuperfusion من خلال التجارب العضلية المشبك التصحيح / مضان.
  3. نقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل وإضافة 10 ميكرومول / لتر Fluoforte و 10 ميكرولتر Powerload التركيز. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. بعد ذلك، تعيين أنبوب في الوضع الرأسي وترك الخلية لتسوية لمدة 5 دقائق؛ resuspend الخلايا في كا 2 + التي تحتوي على السل.
  4. نقل 0.25 مل من تعليق خلية إلى صغيرة (0.5 مل)، ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها المجهر شنت غرفة تسجيل، superfused عن طريق الجاذبية مع نظام microperfusor ساخنة في معدل تدفق 0.3 مل / دقيقة (درجة الحرارة: 37 ± 0.5 درجة مئوية).
  5. باستخدام مجتذب micropipette، وإعداد التصحيح ماصات المشبك بقطر غيض من 3 إلى 5 ميكرون والمقاومة من 3-4،5 م عندما تمتلئ PS.
  6. إضافة الأمفوتريسين B إلى مجموعة من PS (250 ميكروغرام / مل) واستخدامها لملء الأقطاب.
  7. تحديد شكل الخلية قضيب مع التصدعات واضحة، تخلو من شوائب، لجمهورية مقدونيا ختم جيجا وانتظر 5 إلى 10 دقيقة، حتى قطرات المقاومة وصول أقل من 20 MΩ.
  8. انتزاع إمكانات العمل في وضع المشبك الحالي باستخدام نبضات قصيرة (<3 ميللي ثانية) على ترددات مختلفة من التحفيز (0.2 هرتز، 0.5 هرتز و 1 هرتز، 1 دقيقة في كل تردد). أثناء مرحلة التسجيل، وتشغيل إضاءة حقل مشرق في 492 ± 3 نانومتر، والكشف عن مضان في Fluoforte 505-520 نانومتر. اكتساب مضان وغشاء المحتملة باستخدام إشارات Digidata 1440A وpClamp 10.0 البرمجيات. تكرار تسلسل تسجيل عدة مرات إذا لزم الأمر؛ ومع ذلك، والحفاظ على مجموع وقت تسجيل أقل من 15 دقيقة لكل خلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كان يعمل الطريقة الموصوفة أعلاه لتوصيف وظيفي من تشوهات العضلية معزولة عن الحاجز بين البطينين من المرضى الذين يعانون من اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) الذي خضع لعملية استئصال العضلة، مقارنة مع مرضى الفشل الضخامي غير غير الجراحية 21. وتستمد النتائج الواردة في هذا القسم من هذا العمل 21 وترد هنا كمثال للكيفية التي يمكن أن تستخدم هذه التقنية لتوصيف تغيرات في وظيفة خلايا عضلة القلب في ظروف مرض القلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفناها والتحقق من صحتها وسيلة لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية من عضلة القلب البطيني الإنسان. بدءا من البروتوكولات التي سبق وصفها التي استخدمت بنجاح إلى خلايا معزولة من العينات الجراحية الأذيني، والتقنية للسماح وقد وضعت فصل myocytes واحدة قابلة للحياة المريضة من عضلة القلب البطيني وصقلها. وأظهرت التقارير المبكرة التي عزلة العضلية واحدة من قطع من الأذيني البطيني الأنسجة وضعف انتقائي repolarizing التيارات البوتاسيوم، مما أدى إلى تغير الخصائص الكهربية والاستجابات الفسيولوج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي (بكتيريا المشروع 241577 "القلب الكبير" برنامج الإطار الأوروبي 7، CP)، الدولية لوكسمبورغ عمليات Menarini مينارينى (AM)، تيليثون GGP07133 (CP) والعلوم جلعاد (AM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4)Sigma-AldrichP9791
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4*7H2O)Sigma-AldrichM1880
HEPESSigma-AldrichH3375
AdenosineSigma-AldrichA9251
D- (+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
MannitolSigma-AldrichM4125 < / a >
التورينسيجما ألدريتشT0625
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)سيجما ألدريتشP5958
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم )سيجما ألدريتش< أ href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it& ؛ المنطقة = تكنولوجيا المعلومات ">S7653 < / a >
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتش< href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it& ؛ region=IT">P9333
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907 < / a>
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)Sigma-AldrichS6297
بيكربونات البوتاسيوم (KHCO3)Sigma-Aldrich237205< / a>
بيروفات الصوديومسيجما ألدريتشP2256
2,3-Butanedione monoximeSigma-AldrichB0753 < / a>
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)سيجما-ألدريتش< href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it& ؛ المنطقة = IT">S8045 < / a>
L-Glutamic acid أحادي البوتاسيوم ملح أحادي الهيدراتSigma-Aldrich49601
حمض البيروفيكسيجما-ألدريتش107360< / a>
3-حمض الهيدروكسي بوتيريكسيجما ألدريتش166898< / a>
الأدينوزين 5 & prime ؛ -ثنائي هيدرات ملح ثنائي الفوسفات ثنائي الفوسفات (K2< / sub>-ATP)سيجما ألدريتش< href = "http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it& ؛ region=IT">A8937
CreatineSigma-AldrichC0780
SuccinicAcid Sigma-AldrichS3674 < / a>
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ، N & Prime ؛ -tetraacetic acid (EGTA)Sigma-AldrichE0396
ألبومين من مصل الأبقارسيجما-ألدريتشA0281< / a>
كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)سيجما-ألدريتشM8266
Collagenase من Clostridium histolyticum, Type VSigma-AldrichC9263 < / a>
البروتيناز ، البكتيري ، النوع الرابع والعشرونسيجما-ألدريتشP8038
محلول كلوريد الكالسيوم ، ~ 1 م في H2< / sub>OSigma-Aldrich21115< / a>
محلول كلوريد الكالسيوم 0.1 مسيجما ألدريتش53704
ميثان سولفونات البوتاسيومسيجما-ألدريتش 83000 < / a >
كاشف فلوفورتإنزو علوم الحياةENZ-52015
تركيز الحمل الكهربائي ، 100XLife TechnologiesP10020
نظام التروية السريعWarner InstrumentsVC-77SP
Amphotericin B القابل للذوبانسيجما ألدريتشA9528 < / a>
Multiclamp 700B مكبر للصوت التصحيح المشبكالجزيئية
Digidata 1440Aالجزيئية
pClamp10.0 الجزيئية
مخصصالجهاز مصنوع حسب الطلب في مختبرنا باستخدام أنابيب بلاستيكية ، مصبوب سيلجارد ومحرك ؛ تم وصفه بالتفصيل في الشكل 1C-1D وفي الشكل 7. يمكننا تقديم مزيد من التفاصيل إذا طلب ذلك.
مطاط أسطوانة سيليكون لفرش جهاز الهضمDow CorningSYLGARD & reg; 184
محرك دوار متغير السرعة لجهاز الهضمCrouzetCrouzet 178-4765
قالب للفرش الصبNA.ن.القالب مصنوع خصيصا من قضبان PTFE قياسية قطرها 2.5 سم.
الأجهزة الأجهزة جهاز هضم الأجهزة

المراجع

  1. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
  2. Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
  3. Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
  4. Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
  5. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
  6. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  7. Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
  8. Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
  9. Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
  10. Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
  11. Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
  12. Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
  13. Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
  14. Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
  16. Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
  17. Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
  18. Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
  19. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  20. Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
  21. Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
  22. Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
  23. Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
  24. Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
  25. Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
  26. Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
  27. Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
  28. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
  29. Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة