Method Article

وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

DOI:

10.3791/51139

⸱

February 12th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy & Neuroscience, The University of Melbourne, 2Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 3Florey Institute of Neuroscience & Mental Health, The University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة لتسمية البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية باستخدام الأجسام المضادة بولكلونل محددة لالحواتم خارج الخلية. البروتين ملزمة الأجسام المضادة على سطح الخلية وبالتالي المنضوية عبر الإلتقام يمكن تمييزها عن البروتين المتبقية على، أو الاتجار بهن ل، والسطح أثناء الحضانة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل إظهار توطين سطح الخلية من مستقبلات عبر الغشاء المفترضة في الخلايا العصبية مثقف، ونحن المسمى البروتين على سطح الخلايا العصبية الحية مع الأجسام المضادة الأولية المحددة التي أثيرت ضد جزء من البروتين خارج الخلية. بالنظر إلى أن المستقبلات يتم الاتجار من وإلى السطح، إذا تم permeabilized الخلايا بعد التثبيت ثم سوف يتم الكشف عن كل من سطح الخلية والبروتينات الداخلية من قبل نفس الأجسام المضادة الثانوية المسمى. هنا، ونحن تكييفها طريقة تستخدم لدراسة الاتجار البروتين ("تغذية الأجسام المضادة") لتفاضلي البروتين التسمية التي كان قد كتبها المنضوية الإلتقام خلال خطوة الضد الحضانة والبروتين الذي إما بقيت على سطح الخلية أو تم الاتجار بهم إلى السطح خلال هذه الفترة . وقدم القدرة على التمييز بين هذه حمامات اثنين من البروتين ممكن من خلال إدماج خطوة الحجب بين عشية وضحاها مع تتركز درجة عالية من الأجسام المضادة الثانوية أونلبلد بعد incubatio الأوليةن من الخلايا العصبية unpermeabilized مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى. بعد عرقلة الخطوة، permeabilization من الخلايا العصبية يسمح الكشف عن تجمع المنضوية مع الأجسام المضادة الثانوية فلوري المسمى مع fluorophore مختلفة. باستخدام هذه التقنية تمكنا من الحصول على معلومات مهمة عن مكان التحت خلوية من هذا المستقبل المفترضة، وكشف عن أنه كان، في الواقع، يتم الاتجار بهم إلى سطح الخلية في الخلايا العصبية. هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة من أنواع الخلايا والبروتينات على سطح الخلية، وتوفير الأجسام المضادة مناسبة لحاتمة خارج الخلية هو متاح.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في إنشاء وظيفة من البروتينات التي تم تشخيصها حديثا، ويمكن التحقيق في توطين التحت خلوية والاتجار من البروتين في مسألة توفر أدلة مهمة حول دور المحتمل / ثانية من 1،2 البروتين. قدم تحليل المعلوماتية الحيوية من Transcriptome على من القشرة المخية الحديثة النامية 3 لنا مع قائمة من الجينات واظهار التعبير تغيير خلال الماوس corticogenesis الدماغ. نحن ثم اعتمدت نهجا خروج المغلوب الجينات للتأكد من أن البروتين المشفرة بواسطة واحد من هذه الجينات، sez6، دورا رئيسيا في تطوير الخلايا العصبية. لاحظنا أن الجينات المتعلقة الاستيلاء 6، أو Sez6 والبروتين الموجود في التشعبات النامية وهذا هو ايضا في العمود الفقري شجيري، ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. نأت الحصين العصبية الثقافة

  1. إعداد coverslips (زجاج البورسليكات):
    1. يغسل في الإيثانول بنسبة 100٪.
    2. الهواء الجاف تحت أشعة فوق البنفسجية.
    3. معطف مع بولي-D-يسين (0.5 ملغ / مل في 0.15 M العازلة بورات، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
    4. في اليوم التالي (يوم الثقافة) غسل 3X في برنامج تلفزيوني ثم معطف مع laminin (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المزدوجة لون تقنية المناعية فلوري المقدمة هنا هو مفيد لوصفها المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء في الخلايا الحية (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1). خلال فترة الحضانة، وربط الحواتم المناعية الوصول إليها ونسبة من السكان من جزيئات البروتين، جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة المربوطة، وendocytosed. بالإضافة إلى ذلك، قد بروتين توليفها حديثا الوصول إلى سطح الخلية عن طريق الاتجار إلى الأمام، ويمكن إعادة تدويرها عاد جزيئات البروتين إلى غشاء البلازما 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنية الموضحة هنا هي مكملة لتلك التي biotinylation سطح الخلية (التي استعرضها Arancibia-Càrcamo وآخرون) 12 وهذا هو الأسلوب المفضل للحفاظ على المعلومات حول توطين التحت خلوية من البروتين المنضوية، قدم الأجسام المضادة الأولية المناسبة ل حاتمة خارج الخلية هو متاح. بالإضافة إلى ذلك، الكميات الاتجار البروتين / تدخيل مع مرور الوقت يمكن أن يؤديها (عن طريق تحديد coverslips في أوقات مختلفة على مدار الحضانة الخلية الحية مع الأجسام المضادة الأولية) دون الحاجة لإعداد مستخلصا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين أشكر Teele Palumaa للحصول على المساعدة مع الأرقام. بتمويل من منح المشروع 1008046 من مجلس البحوث الطبية، أستراليا الوطنية للصحة و.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBS مع Ca و MgInvitrogen14040182
المتوسط العصبيInvitrogen21103-049
B27 الملحقInvitrogen17504-044
L-GlutamineInvitrogen25030-081
نظام تفكك Papainشركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةPDS
مصل البقر Albumin سيجما ألدريتش أسترالياA9418
هانك & # 039 ؛ محلول ملح متوازن بدون كالسيوم ، مغنيسيوم ، فينول أحمرInvitrogen (Gibco)14175-079
Poly-D-LysineSigma Aldrich AustraliaP0899
لامينين الفأر الطبيعيInvitrogen23017-015قم بإذابة الثلج على الجليد قبل صنع aliquots
مصل الأبقار الجنيني HyCloneThermo Fisher
FluorodeoxyuridineSigma Aldrich أسترالياF0503
UridineSigma Aldrich أسترالياU3003
18 مم أغطية زجاجية مستديرةMenzel Gl & auml ؛ serCB00180RA1
VECTASHIELD تصاعد مائي متوسطمختبرات ناقلاتH1400
حمار مضاد للأرانب Dylight 649   ؛مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية711-495-152
AffiniPure Fab< / sub> جزء الماعز المضاد للأرانب 1gG (H + L)  مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية111-007-003
بارافورمالدهايدسيجما ألدريتش أسترالياP6148سامة - مقبض في غطاء الدخان
Triton-X-100سيجما ألدريتش أسترالياT8787
Alexa Fluor 488 الحمار المترافق المضاد للأرانب 2 درجة ؛ الجسم المضادInvitrogen - المجسات الجزيئيةA21206

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lewis, T. L. Jr, Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
  2. von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antibody FeedingProtein InternalizationCell Surface LabelingImmunofluorescence MicroscopySecondary Antibody BlockingNeuronal Protein TraffickingConfocal MicroscopyFluorescent Secondary AntibodyPermeabilization TechniqueDual Color Labeling

Related Articles