مقالة منهجية

حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن

DOI:

10.3791/51154

⸱

أبريل 15, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neurosciences, John Van Geest Centre for Brain Repair, University of Cambridge, UK, 2NIHR Biomedical Research Center, University of Cambridge, UK

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زرع الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) يحمل وعودا كبيرة في الأعصاب التجدد. تحولت تسليم النظامية من الشخصيات في انخفاض الغازية، وعلاجية فعالة جدا بروتوكول فعالة، لتقديم الخلايا الجذعية في الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية / العصبية السلائف (الشخصيات) هي مصدر الخلايا الجذعية واعدة للمناهج تهدف إلى زرع إصلاح الدماغ أو ترميم الأعصاب في التجدد. وقد نشأ هذا التوجيه من الأدلة الوفيرة على أن يتحقق إصلاح الدماغ بعد تنسيق أو النظامية زرع مجلس الشعب في العديد من النماذج قبل السريرية للأمراض العصبية.

وقد حددت هذه البيانات التجريبية الطريق تسليم خلية واحدة من العقبات الرئيسية لالتصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لأمراض الدماغ التي تتطلب تقييم عاجلة. يمثل Intraparenchymal ترقيع الخلايا الجذعية نهج منطقي لتلك الأمراض التي تتميز آفات الدماغ معزولة ويمكن الوصول إليها مثل إصابات الحبل الشوكي ومرض باركنسون. للأسف، وهذا المبدأ ينطبق بشكل سيئ لظروف تتميز الطبيعة متعددة البؤر، التهابات ونشرها (سواء في الزمان والمكان)، بما في ذلك مرض التصلب المتعدد (MS). على هذا النحو، الدماغ استهداف SYSTأصبح EMIC تسليم مجلس الشعب منخفض بروتوكول الغازية وفعالة علاجيا لتقديم الخلايا إلى الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي (CNS).

هذه الطريقة بديل من تسليم خلية يعتمد على توجه للنسيج المريض مجلس الشعب، وتحديدا القدرة الفطرية ل(ط) بمعنى البيئة وظيفية عبر جزيئات التصاق الخلية وخلوى وchemokine مستقبلات التهابات؛ (ب) عبور الحواجز التشريحية تسرب بعد الوريد (رابعا) أو intracerebroventricular (ICV) الحقن؛ (ج) تتراكم على مستوى الموقع حول الوعاء متعددة (ق) من التهابات الدماغ والنخاع الشوكي الضرر؛ و (iv) ممارسة التغذية الأنسجة ملحوظا والآثار التنظيمية المناعة على الخلايا المستهدفة المضيف مختلفة في الجسم الحي.

نحن هنا وصف الطرق التي قمنا بتطويرها لد. و<م> تسليم ICV من الشخصيات مسانج في الفئران مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، ونموذج من الجهاز العصبي المركزي إزالة الميالين المزمن التهابات، وتتوخى تسليم خلية جذعية النظامية كأسلوب قيمة لاستهداف انتقائي من الدماغ ملتهبة في علم الأعصاب التجدد.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشأت أدلة قوية مستمدة من الدراسات المجراة مما يدل على الكفاءة العلاجية من زرع الخلايا الجذعية العصبية الجسدية / السلائف (الشخصيات) في النماذج الحيوانية من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي 1-8. ومع ذلك، هناك عدد من القضايا المتعلقة إيصال الخلايا الجذعية إلى المضيف تتطلب دراسة متأنية قبل أن تترجم هذه النتائج التجريبية في التطبيقات السريرية. وهناك عقبة كبيرة لا سيما من أجل وضع (nonhematopoietic) التصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لمتعددة البؤر، أمراض الدماغ المزمنة التهابات هو تحديد الطريق الأمثل لحقن مجلس الشعب. فهم شركة الفيزيولوجيا المرضية للمرض المستهدفة (تنسيق أو متعددة البؤر؛ الأولية التنكسية التهابات أو الأساسي)، وتحليل حذرا من القضايا الجدوى والمخاطر المرتبطة التقنيات تسليم في تحديد البروتوكول الأمثل للتسليم الخلايا الجذعية.

في حين أن التنسيق ( على سبيل المثال. في لحمة الجهاز العصبي) زرع الخلايا الجذعية هو نهج منطقي لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي تتميز المناطق المحصورة مكانيا من الضرر (مثل الشلل الرعاش ومرض هنتنغتون، والمخ والحبل الشوكي الإصابات، والسكتة الدماغية)، نفس النهج جدا قد يثبت أن يكون عمليا غير مجدية في ظروف مثل MS، حيث متعددة البؤر، المزمنة، ونشرها مكانيا ضرر CNS يتراكم مع مرور الوقت. في هذه الحالة الأخيرة، التي تستهدف حقن الخلايا تنسيق لآفات الفردية وأعاقت أيضا القدرة محدود من الشخصيات المزروعة على الهجرة لمسافات طويلة داخل لحمة الجهاز العصبي المركزي، مما أثار تحديد طرق بديلة، وأكثر مناسبة من الجهاز العصبي المركزي التي تستهدف زرع مع مجلس الشعب أقل الغازية .

ظهرت عدا كبيرا من الملاحظات التي الشخصيات استهداف الورم داخل القحف (على سبيل المثال. دبقي) في الفئران عندما تم حقنها intravascularly خارج CNS9. تتبع هذا المنويةفي الجسم الحي من الأدلة pathotrophism الخلايا الجذعية 10، وقد تراكمت البيانات واسعة النطاق تتعلق الجدوى والنجاعة العلاجية للزرع النظامية من الشخصيات في الحيوانات المختبرية مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، كنموذج للالتهابات الضرر العصبي المركزي، إما عن طريق الوريد (د) أو intracerebroventricular (ICV). مجلس الشعب حقن 1،2،5،6،8 .. لقد عرض لأول مرة أن هذا يعتمد على القدرة على زرع لاستهداف الشخصيات وأدخل CNS ملتهبة، والدخول في وقت لاحق بين الخلايا متعددة برامج الاتصالات داخل microenvironments محددة في الجسم الحي 11. من أجل خصيصا لاستهداف الجهاز العصبي المركزي، ويتم تسليمها الشخصيات مباشرة في السائل النخاعي (CSF) الدورة الدموية عن طريق الحقن ICV، أو في مجرى الدم عن طريق الحقن د. مرة واحدة إما دخول مجرى الدم أو السائل النخاعي، الشخصيات زرع تتفاعل بنشاط معوالدم في الدماغ (BBB) ​​أو الدم السائل النخاعي (BCSFB) الحواجز وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وينظم هذا التفاعل بين مجلس الشعب والكسب غير المشروع BBB (أو BCSFB) من خلال مجموعة محددة من سطح مجلس الشعب جزيئات التصاق الخلية (الحدب) ويسر عن طريق التعبير عن مستويات عالية من CAM مكافحة بروابط على تنشيط البطانية / خلايا البطانة العصبية 12-14. أمثلة من هذه الحدب تشمل مستقبلات للهيالورونات، CD44، وجزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1 يجند في وقت متأخر جدا المستضد (VLA) -4 5،15،16 (أنه في الكريات البيض، هي المسؤولة عن التفاعل مع البطانة العصبية تفعيلها والخلايا البطانية)، وإلى حد أقل بكثير اللمفاويات وظيفة المرتبطة مستضد (LFA) -1 و ف selectin بروتين سكري يجند (PSGL) -1. الشخصيات أيضا أن أعرب عن مجموعة واسعة من المستقبلات chemokine، بما في ذلك CCR1، CCR2، CCR5، CXCR3، وCXCR4 (ولكن لا تعبر عن CCR3 وCCR7)، والتي هي وظيفيا نشطة، سواء في المختبر والمجراة 5،16. وبالتالي، systemicaالشخصيات حقن LLY استخدام هذه الحدب، جنبا إلى جنب مع G-مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، لتتراكم على مستوى الجهاز العصبي المركزي ملتهبة. على العكس، حقن الشخصيات بشكل منتظم في الفئران صحية لا تدخل الجهاز العصبي المركزي عن طريق الأوعية الدموية أو المسارات الفضاء السائل النخاعي 2. CNS التهاب، أو البطانية / تنشيط الخلايا البطانة العصبية التالية خلوى النظامية أو lypopolisaccharide (LPS) حقن كنموذج للالتهاب الدماغ الناجم عن كيميائيا، لذا فمن الضروري لتراكم الشخصيات حقن منتظم في الدماغ والحبل الشوكي 2. وبالتالي، والاستهداف الناجح لCNS مع العلاجات مجلس الشعب النظامية تعتمد على تحديد نافذة معينة المرض الفرص (وو) التي الدماغ والحبل الشوكي بيئة تفضي إلى تراكم والهجرة transendothelial من الشخصيات. تنشأ مثل هذه الظروف عادة في سياق الحاد وتحت الحاد التهاب 17. مرة واحدة بعد أن دخلت الجهاز العصبي المركزي، زرع الشخصيات غير متمايزةوقد تبين لتحسين ميزات الممارسة الطبية السريرية المرضية من الفئران وكذلك أكبر، الرئيسيات غير البشرية مع EAE. وقد وصفت هذه أن تعتمد الحد الأدنى من استبدال الخلايا وإفراز 2 ملحوظا من عوامل المناعة نظير الصماوي التنظيمية واعصاب داخل الجهاز العصبي المركزي حول الوعاء 2،5،6،18 مقابل غير CNS المناطق الملتهبة 19،20 (مثل العقد الليمفاوية) في استجابة لل إشارة الخلية التهابات التي تسببها تسلل الخلايا المناعية 5.

هنا نحن تصف الجوانب المنهجية الأساسية لحقن النظامية من الشخصيات الجسدية في نموذج الفأر من EAE المزمن. وبشكل أكثر تحديدا، يمكننا تعريف البروتوكولات التي وضعناها ل(ط) اشتقاق، وتوسيع والاستعداد لزرع الشخصيات الجسدية من منطقة subventricular (SVZ) من الكبار C57BL / 6 الفئران؛ (ب) لحث على EAE المزمنة في مثل الفئران و (iii) أداء فعالة علاجيا النظامية (في الوريد أو ICV) ط زرع مجلس الشعبn لالفئران EAE.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ رعاية الحيوانات المختبرية التي وافقت عليها وزارة الداخلية في المملكة المتحدة تحت الحيوانات (الإجراءات العلمية) العمل 1986 (PPL رقم 80/2457 ليرة سورية).

1. اشتقاق الجسدية الخلايا الجذعية العصبية / السلف (الشخصيات) من المنطقة Subventricular (SVZ) من الدماغ من الفئران الكبار

  1. إعداد أدوات تشريح وسائل الإعلام
    ملحوظة: يجب أن يكون مستعدا هذه الحلول اثنين من 1-2 ساعة قبل تشريح أدوات جاهزة وprewarmed في 37 º C 20-30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام (أنه يساعد على تخفيف غراء ويحسن نشاط انزيم).
    1. الأوتوكلاف مقص حاد مستقيم واحد، واحد مقص جراحي صغير واثنين من ملقط مسنن منحني صغيرة.
    2. "الهضم" الحل: إعداد منفصلين 50 مل أنابيب مع:
      الحل رقم 1: 25 مل محلول الملح المتوازن (EBSS) + 10 ملغ حامض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) + 10 ملغ L-السيستين ايرل؛و
      الحل رقم 2: 25 مل EBSS + 50 ملغ غراء.
    3. إعداد 'متوسطة كاملة النمو "(CGM): كاملة الماوس المتوسطة القاعدية مع ملاحق انتشار الماوس، الهيبارين 0.002٪، وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF و 10 نانوغرام / مل)، وعامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي، و 20 نانوغرام / مل)، والمضادات الحيوية (القلم / بكتيريا).
  2. تشريح الدماغ
    NB: إزالة العظام الزمنية يمكن أن تتلف بسهولة الأنسجة بسبب الحدة بهم. لتجنب هذا، وتأمين بحزم العظام مع ملقط وسحب حتى تمت إزالة العظام بأكمله.
    1. لكل إعداد الشخصيات، اعدام من قبل خلع عنق الرحم ن = 5-7 و 4-8 الاسبوع القديمة C57BL / 6 الفئران.
    2. تطهير مع الايثانول 70٪ (في الماء) شعر الفئران اعدام وقطع خلف الأذنين مع مقص حاد مباشرة إلى إزالة الرأس؛
    3. جعل شق خط الوسط باستخدام مقص جراحي صغير لقطع الجلد فوق الجمجمة. باستخدام ملقط، طيها اثنين من بقع من الجلد إلى المعارضالبريد الجمجمة.
    4. مع مقص الجراحية الصغيرة أداء اثنين من التخفيضات قليلا في قاعدة الجمجمة وإزالة العظام تحت الجسر / النخاع (الجمجمة بطني). المضي قدما من خلال الانسحاب العظام الزمنية. مع نفس مقص إجراء خفض على طول الجمجمة، بدءا من القاعدة إلى المصابيح، دون الإضرار سطح الدماغ. أيضا، إجراء خفض بين العظام الأمامية والعيون، لتسهيل إزالة العظام الجداري. مع اثنين من ملقط بدء إزالة الجمجمة عن طريق سحب كل من العظام الجداري نحو الخارج. في حين سحب، وإيلاء الاهتمام لالسحايا، التي يمكن أن تتلف الدماغ عندما يتم إزالة العظام.
    5. مرة واحدة تمت إزالة الجمجمة، مرر ملقط بين الدماغ والجمجمة لفصل تماما غادر السحايا. رفع بلطف صعودا الدماغ من الجمجمة. قطع الأعصاب البصرية للافراج عن الدماغ، وأخيرا جمع الدماغ في أنبوب مع الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS).
    6. الحفاظ على أنبوب على الجليدد تكرار نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.
  3. تشريح SVZ، neurosphere تشكيل وصيانة المقايسات
    متوسط ​​عدد الخلايا س عامل تخفيف × 10 4

    حيث يمثل 10 4 التحويل من الحجم الكلي للغرفة عدادة الكريات (مجموع حجم = 0.1 ملم 3 -> 10-4 سم 3 -> 10-4 مل). عند النظر في عامل التخفيف، فإن كلا من واحد القيام به مع CGM ومع وصمة عار الحيوية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. على سبيل المثال، إذا تم فرز 160 خلايا في الساحات الزاوية 4، فإن الكثافة النهائية (خلية / مل) من التعليق الخلية يكون:

    160/4 × 5 (التخفيف مع CGM) × 2 (مع تخفيف وصمة عار الحيوية) 4 × 10
    1. بدوره على غطاء محرك السيارة تشريح مجهزة مجهر تشريح.
    2. تنظيف جميع الأسطح مع الايثانول 70٪ (في الماء)، ورذاذ مع حل مكافحة الميكوبلازما لخفض مخاطر التلوث.
    3. غطاءالجزء السفلي من كوب مع شاش معقم (للحفاظ على أدوات شحذ) وملء مع الايثانول 70٪ (في الماء). نقع في الدورق اثنين من أزواج من ملقط، زوج واحد من المقص الصغير وشفرة جراحية.
    4. وضع الدماغ كله على مصفوفة المخ تقطيع اللحم.
    5. باستخدام اثنين من شفرات الحلاقة إجراء باجتزاء الاكليلية 2 ملم من القطب الأمامي من الدماغ، باستثناء مساحات البصرية، و 3 ملم الخلفي إلى خفض السابقة؛ ووضع النسيج على طبق بتري نظيفة.
    6. تحت المجهر تشريح عزل الأنسجة SVZ ومقطعة إلى 1 ملم 3 قطع باستخدام مقص قطع القزحية. أكرر لجميع العقول.
      1. تخلط جيدا الحلين (القسم 1.1.2) أعلاه وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرون على الفور بعد أن يتم تشريح أدمغة وSVZs مستعدون ليتم هضمها.
    7. نقل المقاطع إلى 30 مل من "هضم" الحل، في resuspend بلطف مع A10 ماصة مل واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. كل 15 دقيقة يهز بلطف أنبوب 2-3X.
    8. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    9. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من CGM بواسطة pipetting الأولى مع P1000 ثم مع ماصة P200 (10-20x ولكل منهما)، حتى الحصول على تعليق خلية واحدة.
    10. تتخذ تعليق حتى 5 مل مع CGM ونقل إلى T25 قارورة سم 2.
    11. بعد 5-7 أيام في المختبر (DIV) neurospheres ستشكل. جمع تعليق في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 150 × ز.
    12. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر من CGM.
      فصل في neurospheres ميكانيكيا بواسطة الركض الخلايا 100-150X مع ماصة P200، حتى الحصول على تعليق خلية واحدة وأعتبر ما يصل إلى 1 مل مع CGM.
    13. تمييع تعليق الخلية، على سبيل المثال 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 40 ميكرولتر من CGM للحصول على 1:05 التخفيف، وتخلط جيدا. خلط 10 ميكرولتر من مخففتعليق خلية ه مع 10 ميكرولتر من وصمة الحيوية وتخلط جيدا.
    14. ملء غرفة عدادة الكريات العد مع 10 ميكرولتر من تعليق خلية 01:01: حل وصمة عار الحيوية. الاعتماد بشكل منفصل عدد حية (أبيض) والقتلى (الأزرق) الخلايا في الساحات الزاوية 4. لتحديد عدد الخلايا / مل، وتطبيق الحساب التالي:
    15. في resuspend 2 × 10 5 خلايا في 5 مل من CGM ونقل إلى T25 سم 2 قارورة؛
    16. تكرار المقاطع 1.3.11-1.3.12 كل 4-5 DIV. من الفقرة الثانية من التوسع فصاعدا، وتقييم الجدوى الخليوي عن الإقصاء وصمة عار الحيوية والبدء في بناء منحنى النمو المستمر من خلال الطلاء الشخصيات في كثافة نسيلي (8،000 cells/cm2)، كما هو موضح 21. الحفاظ على أرقام الهواتف المحمولة وكرر الإجراء كل 4-5 DIV. لإنشاء منحنى النمو المستمر، والمضي قدما على النحو التالي:
      ملاحظة: للحصول على إعداد خلية جيدة، وبعد 4-5 مجالات DIV ينبغي قد وصلت إلى قطر 150-200 ميكرون. أن يكون تقدير جيد من رانه الخلية الكثافة، فمن المهم للعثور على عامل التخفيف الأمثل من أجل أن يكون توزيعا جيدا، وخلايا غير المتداخلة في جميع أنحاء عدادة الكريات. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هناك بين 50-200 مجموع الخلايا. عندما عد، إلا أن الخلايا تتكون في الساحة دون لمس الحدود يتعين النظر. أيضا، بقاء الخلايا هو عامل حاسم لديك إعداد صحية. الأهم من ذلك، ينبغي أن تكون أكبر من 90٪. منحنى النمو الخطي هو مؤشر آخر على إعداد الخلايا السليمة.
      1. حساب عدد الخلايا الحية والميتة (على سبيل المثال 1.3 × 10 6).
      2. تحديد معدل النمو قسمة عدد الخلايا الحية من قبل عدد من الخلايا مطلي (مثل 1.3 × 10 2/6 × 10 = 6.5 5).
      3. حساب العدد الكلي للخلايا عن طريق ضرب معدل النمو في إجمالي عدد الخلايا الموجودة في نقطة زمنية سابقة (في بداية = 2 × 10 5).
      4. تقرير المتوسط7؛ الانحراف المعياري لبناء خط الاتجاه الخطي.
    17. بدءا من مرور 6، يتم استبدال تفارق الميكانيكية بواسطة تفارق الأنزيمية. بعد الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف، resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي، في resuspend 7-8X مع P200 واحتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    18. في resuspend 7-8X مع P200 للحصول على تعليق خلية واحدة وإضافة 800 ميكرولتر من CGM. عد الخلايا (على حد سواء الحية والميتة) وإنشاء جدواها. في resuspend 2 × 10 5 خلايا في 5 مل من CGM ونقل إلى T25 قارورة سم 2.
  4. تنبيغ الفيروسية من الشخصيات في الجسم الحي تتبع الخلايا
    ملاحظة: للتحقق من كفاءة تنبيغ الفيروسية، وبناء منحنى النمو بالتوازي مع الشخصيات transduced وnontransduced. بالإضافة إلى ذلك، كفاءة النسيلي، وهذا هو العدد المطلق للخلايا neurosphere تشكيل الحاضر ضمن خلية إعداد الأنشوئها أو تحليل دورة الخلية من خلال محتوى الحمض النووي (مع يوديد propidium، PI)، يمكن استخدام المزيد من المؤشرات عن حالة الخلية. إذا كانت نسبة الخلايا المصابة لا ينبغي أن تكون جيدة، وبروتوكول تنبيغ الفيروسية يمكن أن تتكرر مرة ثانية مع نفس السكان من الخلايا. مرة واحدة على مستوى عدوى مرضية ومنحنى النمو مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع خلايا النوع البري، الشخصيات transduced يمكن توسيعها و / أو المزروعة.
    1. حصاد neurospheres والحصول على تعليق خلية واحدة. لوحة الخلايا في كثافة عالية (1.5 × 10 6 خلايا في قارورة T75 سم 2) في 10 مل CGM.
    2. بعد 12 ساعة إضافة 3 × 10 6 TU / مل من الجيل الثالث ناقلات lentiviral pRRLsin. PPT-HCMV هندسيا مع E. القولونية المستمدة β-غالاكتوزيداز (lacZ) أو مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP).
    3. بعد 48 ساعة، حصاد الخلايا، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة وreplate الخلايا في نسبة 1:1.
    4. بعد3 ممرات في المختبر تحقق من كفاءة عدوى. التدفق الخلوي يستخدم عادة لاختبار فعالية العدوى، والمقبولة عموما على مستوى مرض من عدوى أن تكون في حدود 75-95٪ من الخلايا إيجابية. التحقق مرة أخرى كفاءة العدوى بعد 3 مقاطع مزيد من التوسع للتحقق من الحفاظ على التعبير علامة.
  5. Neurosphere تجميد
    1. حصاد neurospheres من قارورة T25 سم 2، الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وتجاهل طاف.
    2. resuspend الكرية مع 1 مل من تجميد المتوسطة (CGM مع 10٪ ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
    3. وضع cryovials في -80 درجة مئوية داخل حاوية التجميد.
    4. بعد 24 ساعة على الأقل تحريك الخلايا إلى cryobox وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة أشهر، أو تقديمهم إلى النيتروجين السائل (N 2) لتخزين لفترة أطول.
  6. Neurosphere الذوبان
    NB: لتجنب الآثار السامة للاتصال المطول سو الشخصيات مع DMSO، يجب أن تكون عملية الذوبان في أسرع وقت ممكن.
    1. إزالة cryovial من -80 ° C / N 2 وابقائه على الثلج الجاف.
    2. ذوبان الجليد بسرعة القارورة في حمام مائي، حتى يتم إذابة تقريبا كل تعليق خلية وفقط قطعة صغيرة من التعليق المثلج لا يزال قائما.
    3. resuspend وتعليق خلية مع 5 مل من prewarmed CGM الطازجة.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    5. إزالة طاف، في resuspend بلطف مع 5 مل من CGM الطازجة وطبق تعليق خلية في بيئة نظيفة، غير المعالجة T25 قارورة سم 2.
  7. 1.7) توصيف مجلس الشعب
    ملحوظة: غسل الماضي PBS يمكن استبدالها مع 0.05٪ من الصوديوم أزيد-PBS لمنع نمو الفطريات أو التلوث، ويتم تخزين coverslides عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع.

    NB: لوصمة عار للعلامات داخل الخلايا إضافة كيل permeabilizing لبرنامج تلفزيوني في عرقلة الحل. إذا كان مصدر الأجسام المضادة الأولية هي الماعز، albumi مصل بقرين (BSA) أو مصل أخرى من الماعز ينبغي استخدامها.

    NB: لوصمة عار للعلامات داخل الخلايا استخدام وكيل permeabilizing في حل الأجسام المضادة الأولية.
    1. وضع الزجاج 13 ملم coverslide على الجزء السفلي من 24 لوحة جيدا. إضافة 150 ميكرولتر من محلول طلاء على رأس كل coverslide لإنشاء قطرة صغيرة. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    2. حصاد neurospheres وفصل للحصول على تعليق خلية واحدة.
    3. عد الخلايا الحية وتمييع للحصول على 80،000 cells/35 ميكرولتر. إزالة الزائدة من محلول طلاء من coverslide بواسطة طموح لطيف، وطبق في 35 ميكرولتر من التعليق الخلية.
    4. احتضان 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تحقق بسرعة في المجهر النقيض من المرحلة إذا بدأت خلايا الالتزام.
    5. إعداد متوسطة التمايز عن طريق خلط القاعدية المتوسطة الفأر مع المكملات المناسبة (انظر الجدول 1) والمضادات الحيوية (بين / بكتيريا).
    6. إضافة 400 ميكرولتر من التمايز المتوسطة واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    7. بعد 3 DIV، وتغير نصف المتوسط ​​مع المتوسطة التمايز الطازجة.
    8. بعد 6 DIV، وإزالة المتوسطة ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تحت غطاء الكيميائية إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من prewarmed بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) 4٪ سكروز. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). إزالة PFA وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
    9. المضي قدما في كيمياء سيتولوجية مناعية، وإزالة برنامج تلفزيوني ومنع مع برنامج تلفزيوني 10٪ مصل الماعز العادي (خ ع) (حل حجب)، واحتضان 1 ساعة على RT.
    10. إزالة عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة المطلوب مع PBS 1٪ NGS. احتضان عند 4 ° CO / N أو، بدلا من ذلك، 120 دقيقة في RT.
    11. بعد الحضانة، وغسل 2X مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخفف مع PBS 1٪ NGS. احتضان 60 دقيقة في RT.
    12. غسل 2X مع برنامج تلفزيوني ومكافحة وصمة عار على النوى مع 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) المخفف 1:20،000 مع برنامج تلفزيوني permeabilizing الوكيل لمدة 3 دقائق على RT في الظلام. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع الماء المقطر.
    13. وضع قطرة من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية والأنسجة مع ملقط تحميل coverslide مع الخلايا التي تواجه المتوسطة المتزايدة. اضغط بلطف coverslide للضغط على الفائض من تصاعد المتوسطة. مغادرة coverslide في الظلام في RT حتى جفت المتوسطة المتزايدة وتخزينها في 4 درجات مئوية.

المناعة الذاتية التجريبية 2. المايلين دبقية قليلة التغصن جلايكوبروتين (موج) التي يسببها في C57BL / 6 الفئران

  1. إعداد مستحلب
    1. على دورق زجاجي تحضير مستحلب يتكون من مساعد فرويند غير كاملة تحتوي على 4 ملغ / مل من السل المتفطرة [تعريف باسم مساند فرويند الكامل (CFA)] و 200 ميكروغرام من MOG (الببتيد 35-55)، معتبرا أن المبلغ الإجمالي للمستحلب وسوف يكون في الماوس 300 ميكرولتر.
      NB: Appropriaضوابط الشركة المصرية للاتصالات من الفئران MOG تحصين في CFA هي تحصين الفئران مع CFA فقط. التباين المتوقع من ظهور المرض في الفئران MOG تحصين هو 11.3 (± 1.8) نقطة في البوصة.

      ملحوظة: عند حساب إجمالي حجم مستحلب حاجة، والنظر ضعفي حجم وعدد من الفئران لتحصين. الأواني الزجاجية ينبغي تفضيل لبلستيكور لتقليل النفايات جزء من المستحلب.
      1. مع حقنة الزجاج عقد مزيج G 19 إبرة لمدة 30 دقيقة، وحفظ دائما المستحلب على الجليد.
      2. للتحقق مما إذا مستحلب جاهز، وانخفاض كمية صغيرة من المستحلب على المياه. مستحلب جاهز ليتم حقنه فقط إذا استمر الانخفاض كما هو ولا تفريق.
      3. تحصين المجموعة الضابطة من الفئران مع CFA فقط. علاج فئران التجارب (MOG تحصين) مع MOG في CFA. التباين المتوقع من ظهور المرض في MOG تحصين الفئران هو 11.3 (± 1.8) نقطة في البوصة.
    2. نقل إبرة 19 G إلى 1 مل حقنة بلاستيكية لالثانية نضح مستحلب. تجنب الفقاعات، تغيير إبرة مع 25 G وترك حقنة على الجليد. محاقن مملوءة المستحلب على استعداد لاستخدامها ويجب أن تبقى على الجليد لبضع ساعة.
  2. تحصين
    1. وضع الفئران (6-8 أسابيع من العمر، أنثى) في مربع الاحترار والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الوريد الذيل لتمدد.
    2. نقل الماوس واحد من مربع الاحترار إلى كابح الماوس. إغلاق كابح لتجنب أي حركة الماوس.
    3. ملء حقنة 1 مل الأنسولين مع 100 ميكرولتر من السم السعال الديكي (5 ميكروغرام / مل) تجنب صنع الفقاعات. حقن ببطء الحل في الوريد الذيل. إزالة الإبرة والصحافة لبضع ثوان مع قطعة من الورق لسد النزيف.
    4. ضع الماوس مرة أخرى في قفص وكرر نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.
    5. تخدير ماوس مع استمرار استنشاق isoflurane و(1-2٪، 2 لتر / دقيقة) وحقن 100 ميكرولتر من مستحلب تحت الجلد على مستوىاثنين من الأجنحة وقاعدة الذيل (300 ميكرولتر مستحلب / الماوس). إزالة ببطء الحقنة، وتجنب تسرب المستحلب.
    6. بمناسبة الماوس مع الناخس الأذن، وضع الفئران في قفص وتحقق حتى الشفاء التام. أكرر لجميع الفئران.
    7. بعد 48 ساعة (2 أيام التحصين آخر، نقطة في البوصة) تكرار القسم 2.2.3.
  3. التحليل السلوكي من الفئران EAE
    1. بدءا من 5 نقطة في البوصة، وزن الفئران يوميا، ورصد الأداء الحركي من خلال استخدام نظام التسجيل على نطاق وصفها في الجدول 1.

3. حقن الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الذيل الوريد (رابعا)

  1. إعداد الخلية
    1. neurospheres الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    2. إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    3. في resuspend بلطف 10-12X (avoidinز فقاعات) مع P200 حتى الحصول على تعليق خلية واحدة واتخاذ إلى 800 ميكرولتر مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم.
    4. عد الخلايا باستخدام وصمة عار الحيوية لفحص بقاء الخلية وتمييع تعليق مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + للحصول على كثافة النهائي من 10 ميكرولتر cells/150 6. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الاستخدام.
  2. مجلس الشعب حقن الرابع
    ملحوظة: تفارق مثالية في تعليق خلية واحدة وعدم وجود فقاعات الهواء جانبان رئيسيان للنظر للحد من خطر إما كتل / المجاميع مقابل تشكيل الصمات التي قد تؤدي إلى انسداد الوريد ويترتب على ذلك الموت.
    1. في ذروة المرض (16-18 نقطة في البوصة)، وتزن يسجل الفئران. توزيع الفئران وفقا لدرجاتهم من أجل الحصول على مجموعات متجانسة.
    2. وضع الفئران في مربع الاحترار والانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الوريد الذيل لتمدد.
    3. نقل الماوس واحد من مربع الاحترار إلى كابح الماوس. إغلاق كابح لتجنب أي حركة الماوس.
    4. ملء الأنسولين حقنة 1 مل مع 150 ميكرولتر من تعليق خلية والتأكد من إزالة كافة الفقاعات. حقن ببطء الحل في الوريد الذيل. إزالة الإبرة والصحافة لبضع ثوان مع قطعة من الورق من أجل سد نزيف (أرقام 6A و6B).
    5. ضع الماوس في قفص وتحقق حتى الشفاء. كرر نفس الإجراء بالنسبة لجميع الفئران.

4. حقن الخلايا الجذعية العصبية / السلف في صهريج ماجنا (ICV)

  1. إعداد الخلية
    1. الشخصيات الحصاد بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    2. إزالة طاف وإضافة 200 ميكرولتر من الخلايا حل التفكك الكلي. احتضان 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    3. في resuspend بلطف 10-12X مع P200 حتى الحصول على واحد جتعليق الذراع واتخاذ إلى 800 ميكرولتر مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم.
    4. عد الخلايا وتمييع تعليق مع متوسطة القاعدية دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + للحصول على كثافة الخلية المطلوبة. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الاستخدام.
  2. 4.2) حقن ICV مجلس الشعب
    1. في ذروة المرض (16-18 نقطة في البوصة)، وتزن يسجل الفئران. توزيع الفئران وفقا لدرجاتهم من أجل الحصول على مجموعات متجانسة.
    2. ضع الماوس على جهاز التجسيمي تحت المستمر استنشاق isoflurane و(1-2٪، 2 لتر / دقيقة). تأمين رأس الفأر مع القضبان الأذن. ثم ضبط كل من الفم والأنف قطعة. تأكد من أن رأس الفأر هو مسطح وثابت.
    3. المسحة رأس الفأر مع بوفيدون اليود (PVP-I) وإجراء شق لقطع الجلد في الجزء الخلفي من الرأس لفضح الجمجمة.
    4. باستخدام مياداة مجهرية، إدراج غيض من microlحقنة معبر في الشق بين قفا وفقرة الأطلس من خلال العضلات والأربطة سليمة في خط الوسط في الجزء الخلفي من الرقبة. يتم الاحتفاظ الجزء عازمة الإبرة على اتصال وثيق مع السطح الداخلي للقفا لطول بأكملها، كما هو موضح 22.
    5. إدراج ببطء الإبرة وانتظر بضع ثوانى. والمقصود المشغل لنتعلم كيف نتعرف على الشعور الإبرة بأنها "مدمن مخدرات" في الجمجمة الماوس، وذلك قبل بدء ضخ إعداد الخلية. حقن ببطء حجم الخلايا (خلال 3-5 دقيقة). ترك الإبرة في مكانها لبضع ثوان إضافية بعد الحقن وإزالة ببطء المحقنة.
    6. غرزة البشرة ووضع الماوس في قفص الانتعاش حتى الشفاء التام.

5. تجهيز الأنسجة

  1. بعمق تخدير الفئران مع خليط من 0.5 مل الكيتامين (100 ملغ / مل)، 0.25 مل زيلازين (23.32 ملغ / مل) و 4.25 مل من الماء المعقم ويروي transcardically، ثashing مع المالحة EDTA وتحديد مع PFA 4٪. إزالة كل الأعمدة والعقول الفقري وPOSTFIX في PFA 4٪ لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني، وإزالة النخاع الشوكي من عظام وترك الأنسجة لا يقل عن 48 ساعة في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني) في 4 درجات مئوية. تضمين الأنسجة في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) مجمع والمفاجئة تجميد مع النيتروجين السائل، كما هو موضح 2.
  2. استخدام مبضع للفحص المجهري لقطع الأنسجة في 10-12 ميكرون شرائح سميكة.
  3. بدلا من ذلك، تضمين أنسجة جديدة في الاغاروز وقطع الأنسجة باستخدام vibratome 50-80 ميكرون شرائح سميكة.
  4. في كلتا الحالتين، واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية في D-galactopyranoside (X-غال) حل للكشف عن النشاط النووي β-غالاكتوزيداز-كلورو-3-indolyl-β-5 برومو 4.
  5. Recut المقاطع التي تحتوي على β-غال + الخلايا إلى 5 ميكرون شرائح وصمة عار مزدوجة باستخدام ييفي antiglial الحمضية البروتين (GFAP) عن الخلايا النجمية (50 ميكروغرام / مل)، مستضد النووية antineuronal (NeuN) عن الخلايا العصبية (1 &# 956؛ ز / مل) وللخلايا العصبية antiNestin غير متمايزة (10 ميكروغرام / مل).
  6. المضي قدما كما هو موضح في أقسام 1.7.11 1.7.12 و. لstainings متعددة تأكد من استخدام الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع fluorophores مختلفة.
  7. لأنسجة تحتوي على خلايا GFP المسمى المضي قدما كما هو موضح في الخطوات 5،1-5،3 والمضي قدما في stainings متعددة.
  8. إضافة بعض قطرات من تصاعد المتوسطة والشرائح، وتغطي مع ساترة الأنسجة.
  9. لأقسام ملطخة الأجسام المضادة مترافق البيوتين إعداد حل أفيدين معقدة البيوتين (حل ABC، انظر الجدول 2) وترك في الانفعالات لمدة 45 دقيقة.
  10. احتضان شرائح 5 دقائق مع 1٪ H 2 O 2 لمنع نشاط البيروكسيديز الذاتية.
  11. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  12. احتضان مع الحل ABC ل1HR في RT.
  13. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  14. احتضان مع الحل 3،3 '-diaminobenzidine و 0.3٪ H 2 O 2. رصد رد فعل الامم المتحدةدير المجهر ويغسل مع برنامج تلفزيوني في أقرب وقت شريحة البدء في الحصول على البني (عادة حوالي 5-10 دقائق).
  15. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة 5.7.

يتم عرض قائمة شاملة من المواد والكواشف في الجدول 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجلس الشعب الاشتقاق وتوصيف
يتم إجراء تشريح SVZ على برك (ن = 5-7 الفئران / حمام السباحة) من 6-8 الاسبوع القديمة C57BL / 6 الفئران عن طريق التفكك الميكانيكية والأنزيمية (الشكل 1A). بعد أيام قليلة من زراعة في CGM، neurospheres التعويم الحر يبدأ تشكيل (أرقام 1A و 1B). يتم جمع الأجواء الأولية وpassaged كل 4-5 DIV ميكانيكيا. على الركض، والتأكد من أعداد الخلايا الحية والميتة وتآمر أرقام الخلية التراكمي لتوليد منحنى النمو (ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج بالخلايا الجذعية الجسدية ومقرها الناشئة باعتبارها واحدة من أهم الاستراتيجيات الواعدة لعلاج الاضطرابات الالتهابية المزمنة CNS مثل MS2 11. في حين أن آليات الحفاظ على آثارها العلاجية لا تزال بحاجة إلى توضيح تماما، ونظرا لتأثير كبير من زرع مجلس الشعب في نماذج تجريبية مختلفة من الأمراض العصبية تؤدي إلى الاعتقاد الاستفزازية التي تنبع إلى حد ما قد يكون قريبا تطبيق الخلايا في الدراسات البشرية. ولكن، قبل تتوخى أية تطبيقات البشرية المحتملة لمثل هذه العلاجات المبتكرة نحن بح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين أشكر جايدن سميث لاستعراض نقدي وإثبات تحرير المخطوطة. وقد تلقى هذا العمل دعما من الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (NMSS والمنح الجزئية RG-4001-A1)، والإيطالية جمعية التصلب المتعدد (AISM، منح 2010/R/31)، وزارة الصحة الإيطالية (GR08-7)، أجنحة من أجل الحياة، بنكا بوبولاري اجريكولا دي راغوزا (BAPR)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) بموجب اتفاق ERC-2010-جنيها استرلينيا أي برنامج المنح الإطار 7 الجماعة الأوروبية (EC) 260511-SEM_SEM و(FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة ن * درجة؛ 280772 - حصرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>ثقافة الخلايا< / قوي>
EBSSSigmaE2888
L-CysteinSigma AldrichC7352
PapainWorthington30H11965
EDTAFisher ScientificD / 0700/50
الخلايا الجذعيةالقاعدية NeuroCult05700
مكملات انتشار NeuroCultتقنيات الخلايا الجذعية05701
الهيبارينسيجماH3393
عامل نمو الخلايا الليفية الأساسيةPeprotech100-18B-1000
عامل نمو البشرةPeprotechAF-100-15-1000
القلم / البكتيريا العقديةInvitrogen1514012
Matrigel (محلول الطلاء)BD Biosciences354230
NeuroCult & reg ؛ طقم التمايز (الفأر)تقنيات الخلايا الجذعية05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) بدون مختبرات Ca و MgPAAH15-011
Myco tracePAA LaboratoriesQ052-020
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SigmaD2650
<قوي> التألق المناعي < / قوي >
مصل الماعز العاديمختبرات PAAB11-035
البولي إيثيلين جلايكول p- (1،1،3،3-tetramethylbutyl) -فينيل الأثيرSigma AldrichT8787
الفأر المضاد ل NestinAbcamab11306
الأرنب المضاد GFAPDAKO203344
الفأر المضاد لهستون H3 (phospho S10) Abcamab14955
أرنب مضاد ل MAP-2Abcamab32454
الفئران المضادة MBPAbD SEROTECMCA409S
الأجسام المضادة ل O4 ، استنساخ 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
حل التركيبDAKOS3023
EAE< / strong>
Freund's Adjuvant غير مكتملSigma AldrichF5506
المتفطرة السلية< / em>DIFCOH37Ra
MOG (35 – 55) Espikem
السعال الديكيالمختبراتالبيولوجية 181
<قوي>معالجة الأنسجة< / قوي>
قزحية مقص مستقيمأدوات العلوم الدقيقة14060-09
ملقط حاد / منحنيأدوات العلوم الدقيقة11080-02
الدماغأدوات زيفيتشBSMAS005-1
شفرات جراحيةSwann-Morton324
P200 ، P1000 ماصات
الكيتامين (Vetalar)Boehringer Ingelheim01LC0030
Xylazine (Rompun)Bayer32371
الإطار التجسيميKOPFموديل 900
حقنةهاميلتون7762-04
بارافورمالدهيد (PFA)سيجما158127
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6100
تقنيات المتوسطةقائمة السموم تقطيع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145(2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة