تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل الإكسوسومات عن بول الإنسان باستخدام تقنية هطول الأمطار المعدلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وهناك طريقة الهطول معدلة لعزل البولية Exosomes
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كان تحديد المؤشرات الحيوية التي تسمح بالكشف المبكر عن أمراض الكلى في البول والبلازما مجالا ذا أهمية نشطة لعدة سنوات. يتم إطلاق حويصلات الإكسوسوم البولي ، التي يتراوح حجمها بين 40 و 100 نانومتر ، في البول في ظل الظروف العادية بواسطة خلايا من جميع أجزاء النيفرون وقد تحتوي على بروتين ومرنا مرسال وميكرو رنا ممثل نوع الخلية الأصلية. في ظل ظروف الخلل الكلوي أو الإصابة ، قد تحتوي الإكسوسومات على نسب متغيرة من هذه المكونات ، والتي قد تكون بمثابة مؤشرات حيوية للمرض. هناك حاليا العديد من الطرق المتاحة لعزل الإكسوسومات البولية ، وقد أجرينا سابقا مقارنة تجريبية لكل من هذه الأساليب ، بما في ذلك ثلاثة تعتمد على الطرد المركزي الفائق ، واحدة تستخدم مكثف الترشيح الفائق بالغشاء النانوي ، وواحدة تستخدم كاشف الترسيب التجاري والأخرى تستخدم تعديلا لتقنية الترسيب باستخدام كاشف ExoQuick الذي طورناه في مختبرنا. وجدنا أن طريقة الترسيب المعدلة أنتجت أعلى إنتاجية من جزيئات الإكسوسوم و miRNA و mRNA ، مما يجعل هذا النهج مناسبا لعزل الإكسوسومات من أجل توصيف الحمض النووي الريبي اللاحق. نستنتج أن طريقة ترسيب الإكسوزوم المعدلة توفر بديلا سريعا وقابلا للتطوير وفعالا لعزل الإكسوسومات عن البول. في هذا التقرير ، نصف تقنية الترسيب المعدلة باستخدام كاشف ExoQuick لعزل الإكسوسومات عن بول الإنسان.
المقدمة
exosomes البولية هي الحويصلات الداخلية صغيرة من 100 نيوتن متر من الهيئات عديد الحويصلات (MVB) المستمدة من جميع أنواع الخلايا تحت الظروف العادية والمرضية في الفضاء البولية بما في ذلك podocytes الكبيبي، وخلايا النبيبات الكلوية والخلايا المبطنة للشبكات الصرف البولية التي يبدو أنها المخصب لmiRNAs 1 -2. وقد كشفت العديد من الباحثين البروتينات متميزة في exosomes معزولة عن البول الأفراد الأصحاء وكذلك مع كلوي و / أو الأمراض منهجية 3-5. Exosomes يمكن عزلها باستخدام طرق مختلفة مثل خطوتين التفاضلي تنبيذ فائق مع أو بدون السكروز 6-7، والجمع بين مرشح nanomembrane مع تنبيذ فائق 8-9، أو هطول الأمطار 10-11. لقد وضعت مؤخرا طريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتطوير وفعال لعزل exosomes البولية وكشف ميرنا ومؤشرات حيوية البروتين 11. على الرغم من أن المؤشرات الحيوية يمكن اكتشافه في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية المختلفة، اورالمعهد الوطني للإحصاء هو الخيار الأكثر ملاءمة للمرضى الذين يعانون أمراض الكلى والمسالك البولية لأنه يمكن الحصول على كميات كبيرة بطريقة نسبيا غير الغازية.
على الرغم من أن هناك عدة طرق لعزل exosomes البولية 6-11، فإن الإجراء الأكثر شيوعا يعتمد على تنبيذ فائق التفاضلي مع وسادة السكروز 30٪. في حين أن هذا الأسلوب هو كفاءة وجودة exosomes الناتجة معزولة مع هذا الإجراء عالية، وأسلوب في حد ذاته يتطلب الموظفين المهرة وهي، والتي تتطلب العديد من الخطوات تنبيذ فائق تستغرق وقتا طويلا. أساليب أخرى، مثل الترشيح وهطول الأمطار، وقد وضعت لعزل exosomes، بما في ذلك واحد يستخدم الملكية هطول الأمطار كاشف (أي ExoQuick-TC: نظام العلوم البيولوجية، ماونتن فيو، كاليفورنيا). وعلى الرغم من هطول الأمطار باستخدام هذا كاشف بشكل سريع وسهل نسبيا، ونقاء exosomes معزولة منخفض بالمقارنة مع المنهجيات تنبيذ فائقالتطوير التنظيمي. ونحن مؤخرا مقابل ستة طرق لعزل exosomes البولية، بما في ذلك تعديل طريقة الترسيب باستخدام ExoQuick-TC التي قمنا بتطويرها في مختبرنا 11. وجدنا أن هذه الأمطار طريقة تعديل أثمرت كميات أكبر من البروتين، ميرنا، ومن mRNAs والإجراء نفسه كان أسرع وأسهل للتنفيذ من تنبيذ فائق. هنا، نحن تصف بروتوكول تجريبي لدينا هطول طريقة تعديلها بطريقة تدريجية، وتشمل مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية مقارنة مع غيرها من أساليب exosome العزلة. ويشمل هطول الأمطار على طريقة تعديل الأولي من الجسيمات exosome، تليها إزالة البروتين تام-هورسفال، الذي يرتبط مع بروتينات exosomal، والمعروف للحد من العائد exosome من البول. وجدنا أن هذه التعديلات زيادة المحصول ونقاء إعداد exosomal من البول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم توضيح الخطوات المتبعة في عزل exosomes البولية باستخدام طريقة الترسيب تعديل في الشكل (1) وتشمل الخطوات الأولية إزالة الخلايا الميتة الكبيرة والحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي. بيليه النهائي تم الحصول عليها من طاف جمعها من كل خطوة لاحقة يتوافق مع exosome، والذي يذوب في محلول العزلة لمزيد من استخراج البروتين، RNA، DNA و.
1. جمع البول
- قبل جمع البول، وإعداد مثبط البروتياز الكوكتيل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وإضافة 3.125 مل من هذا الكوكتيل إلى وعاء معقم فارغة. الأنبوب الذي يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز ويمكن بعد ذلك يتم توزيعها على المتطوعين لجمع البول.
ملاحظة: السبب لإضافة مثبط البروتياز هو تقليل تدهور البروتين في عينة من البول. على الرغم من أننا تستخدم خصيصا كوكتيل مثبط البروتياز منسيغما، يمكن أن تكون بديلا غيرها من مثبطات الأنزيم البروتيني المتاحة تجاريا. - جمع حوالي 10 مل من البول باطلة أولا. معالجة البول مباشرة بعد جمع دون تخزين أو التبريد. عزل exosomes البولية في نسختين باستخدام طريقة الترسيب المحورة؛ واحدة من التكرارات هو لDNA، RNA الكلي واستخراج البروتين، في حين أن الآخر هو لتقدير حجم الجسيمات exosome البولية.
ملاحظة: يمكن جمع عينة البول 24 ساعة لexosome العزلة عن طريق تخزين عند 4 درجات مئوية.
2. إزالة الحطام الخلية وتام-هورسفال البروتين (THP)
- نقل عينات البول إلى 15 مل أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي 10 مل من البول في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 37 ° C للقضاء على الخلايا والحطام الخلية (الشكل 1).
- باستخدام ماصة، ونقل طاف لأنبوب جديد لمزيد من المعالجة. Resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من حل العزلة (250 ملي السكروز، 10 ملي triethanolamine، ودرجة الحموضة 7.6)، يليه 10 دقيقة الحضانة مع DL-dithiothreitol (DTT: نهائي تركيز 200 ملغ / مل) عند 37 درجة مئوية.
يضاف DTT أن تتحلل THP، أي يصيد exosomes، مما يؤدي إلى انخفاض العوائد: ملاحظة. احرص على ترك بيليه دون عائق أثناء نقل طاف، وتأكيد أن طاف هو واضح من بيليه. - عينات بيليه دوامة كل 2 دقيقة حتى بيليه يذوب تماما. ثم إضافة 500 ميكرولتر من حل العزلة إلى بيليه المنحل.
- على الفور بعد إضافة حل العزلة إلى بيليه، الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. الماصة وطاف مع الجمع بين طاف جمعها في وقت سابق.
- Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر من حل العزلة لتحليل SDS-PAGE.
ملاحظة: برنامج تلفزيوني أو TBS يمكن استخدامها بدلا من حل العزلة إلى resuspend الكرية.
3. عزل Exosome بيليه
- إلى 11 مل من supern جمعهاatant، إضافة 3.3 مل من ExoQuick-TC كاشف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
ملاحظة: نسبة حجم طاف لExoQuick-TC كاشف يمكن تعديلها لزيادة أو تقليل العائد exosomal. لاحظنا أن كميات أقل من كاشف أضاف تنتج غلة أصغر من exosomes. - وبعد الحضانة، الطرد المركزي المزيج عينة / ExoQuick-TC في 10،000 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية.
- نقل طاف لأنبوب جديد لتحليل SDS-PAGE.
- ويمكن تخزين بيليه exosome في -80 درجة مئوية لمدة DNA، RNA واستخراج البروتين وتقدير حجم الجسيمات exosome باستخدام CD9 ELISA 11.
ملاحظة: يمكن تخزين بيليه exosome في -80 درجة مئوية لمدة 1 سنة مع تجميد محدود والذوبان.
4. كشف العلامات البيولوجية وتحليل Exosome بيليه
- لتحليل المصب، استخراج DNA و RNA والبروتين من بيليه exosome باستخدام DNA / RNA / طقم العزلة البروتين وكي العزلة RNAر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيزات باستخدام معمل NanoDrop من خلال قياس الامتصاصية في 260 و 280nm مع 2 ميكرولتر من العينة.
- أداء الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR (QPCR) باستخدام فحوصات الرنا الميكروي TAQMAN (في حالتنا، كنا الإنسان مير 192- ومير 1207-5p محددة المقايسات) أو الاشعال ميرنا محددة.
- لتحليل SDS-PAGE، استخدم 4-12٪ مكرر تريس هلام وعينات البروتين منفصلة من قبل الكهربائي واحدة الأبعاد. تصور المواد الهلامية استخدام عدة الفضة تلطيخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- إجراء تحليل لطخة غربية باستخدام الأغشية PVDF وفقا للتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. استخدام الأرنب بولكلونل الأجسام المضادة لموت الخلايا المبرمج الجين المرتبط-2 التفاعل بروتين X أو ALIX والفأر وحيدة النسيلة الأجسام المضادة للورم قابلية الجينات 101 البروتين أو TSG101 في الكشف طخة الغربي. قياس كثافة العصابات التي كتبها الوصول المفتوح البرمجيات NIH يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أوبرنامج مماثل.
- تحديد عدد من الجزيئات exosome البولية تم الحصول عليها باستخدام مجموعة CD9 ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
exosomes البولية تحمل البروتين، ميرنا ومرنا المؤشرات الحيوية يفرز من خلايا الظهارية الكلوية. عزل وكشف عن هذه exosomes قد توفر أداة تشخيصية مفيدة للكشف المبكر عن أمراض الكلى مثل اعتلال الكلية السكري. هناك عدة طرق لعزل exosomes من عينات البول التي جمعت من البشر. نحن سابقا مقابل ستة طرق البول exosome العزل والتحقيق مما أدى بروتين، مستويات مرنا، وميرنا 11. كان هدفنا هنا لوصف بالتفصيل هطول طريقة تعديل وضعنا لعزل فعالة من exosomes البولية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
معظم الطرق التي تنطوي على ترسيب exosomes من البول لا تعالج إزالة شبكة البوليمرية التي شكلتها البروتين تام-هورسفال (THP). هذا البروتين موجود في كميات كبيرة في البول، حيث exosomes أنه الفخاخ مزعومة أثناء الأولي الطرد المركزي بسرعة منخفضة. في أسلوبنا تعديل خفضنا THP باستخدام DTT قبل هطول الأمطار exosome. كما هو مبين في الشكل 2، لوحظ وجود كمية أكبر من THP في البول غير المجهزة وبيليه، مع عدم THP في طاف النهائي وexosome بيليه، ما يدل على إزالته من البروتين. الكمي من الب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تم دفع رسوم النشر لهذا المقال من قبل العلوم البيولوجية الفرعية للتنفيذ.
شكر وتقدير
نحن ممتنون لمؤسسة عائلة روني لدعمها لهذه الدراسة. نقدر مساهمة الدكتور م. لوكريسيا ألفاريز في تخطيط وتنفيذ التجارب الموضحة في هذا العمل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كورنينج 15 مل أنبوب الطرد المركزي | كورنينج (سيجما ألدريتش) | CLS430791 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز | سيجما ألدريتش | P8340 | |
| طرد مركزي | سورفال | ||
| DL-dithiothreitol | سيجما ألدريتش | D9779 | يستخدم بتركيز نهائي 200 مجم / مل |
| نظام Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12٪ Bis-Tris Gel 1.0 مم ، 10 بئر | Invitrogen | NP0321BOX | لتحليل SDS-PAGE |
| ECL مجموعة الكشف عن النشاف الغربية المتقدمة | Healthcare Life | Sciences RPN2135 | للكشف عن اللطخة الغربية للمؤشرات الحيوية |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | لعزل |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | لقياس كمية الإكسوسوم |
| AllPrep DNA / RNA / Protein mini kit | Qiagen | 80004 | للحمض النووي ، الحمض النووي الريبي ، عزل البروتين |
| Rneasy MinElute Cleanup Kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | لقياس البروتين | |
| ProteoSilver Sslice Stain | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | لتلوين المواد الهلامية |
| SDS-PAGEتقنيات حياة نظام الرحلان الكهربائي للخلايا الصغيرة Xcell SureLock | لتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE فحوصات | ||
| الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ل TSG101 | Abcam | للكشف عن اللطخة الغربية للمؤشرات الحيوية |
المراجع
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
