Method Article

طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

DOI:

10.3791/51161

⸱

January 29th, 2014

 ,  , 
1Department of Immunopathology, Sanquin Research and Landsteiner Laboratory Academic Medical Center, University of Amsterdam, 2Department of Hematology, Academic Medical Center, University of Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات لقياس تفعيل مكملا الناجم عن أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء. وميزة كبيرة على المقايسات الحالي الكمي وطبيعة السهل تفسير ل.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تكمل مما أدى إلى تسارع التخليص عبر مستقبلات مكملا في الكبد (انحلال الدم خارج الأوعية) أو يؤدي إلى تحلل كرات الدم الحمراء داخل الأوعية الدموية لل. Alloantibodies (على سبيل المثال ABO) أو الأجسام المضادة لمستضدات RBC (كما رأينا في فقر الدم الانحلالي الذاتية، AIHA) مما يؤدي إلى تفعيل تكمل يحتمل أن تكون ضارة ويمكن أن يكون - وخصوصا عندما يؤدي إلى تحلل داخل الأوعية الدموية - 1 القاتلة. حاليا، تكمل التنشيط بسبب (السيارات) الأجسام المضادة في كرات الدم الحمراء في المختبر يتم تقييم باستخدام اختبار كومبس يعكس ترسب تكمل على RBC أو عن طريق فحص الدم الانحلالي nonquantitative يعكس RBC تحلل 1-4. ومع ذلك، من أجل تقييم فعالية مثبطات مكملا، وهي ملزمة أن يكون التقنيات الكمية. نحن هنا وصف اثنين من هذه التقنيات. الأول، وهو فحص للكشف عن C3 و C4 ترسب على خلايا الدم الحمراء التي يسببها الأجسام المضادة في مصل المريض قبلsented. لهذا، يتم استخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع fluorescently المسمى مكافحة C3 أو C4 لمكافحة الأجسام المضادة. المقبل، وصفت الحالة للدم الفحص الكمي. يتم قياس انحلال الدم بوساطة تكمل في هذا الاختبار، الناجمة عن المصل المريض استفادة من الكشف الطيفي من الهيموغلوبين الافراج عنهم. كل من هذه المقايسات استنساخه جدا والكمية، وتسهيل الدراسات التنشيط تكملة الناجم عن الأجسام المضادة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يتسبب عن طريق نقل الدم من كرات الدم الحمراء معربا عن مستضد والذي هو غير موجود على كرات الدم الحمراء المتلقي. ويمكن لهذه الأجسام المضادة ألو يسبب ردود فعل الانحلالي الحاد نقل نظرا لتكمل التنشيط على نقل التالية 5. في المناعة الذاتية فقر الدم الانحلالي (AIHA)، المرضى الذين لديهم أضداد ذاتية ضد كرات الدم الحمراء الخاصة بهم. وهذا يؤدي إلى تسارع إزالة الخلايا عن طريق التفاعل بين مفتش ملزمة لكرات الدم الحمراء مع Fcγ-المستقبلات على البالعات في الطحال و / أو في حالة أضداد ذاتية قادرة على تنشيط مستقبلات مكملا عبر مكملا في الكبد 6،7. تفعيل مكملا مداهم انحل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد بروميلين المعاملة خلايا الدم الحمراء

  1. خلايا الدم الحمراء كتبته-0 غسل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني 1X (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2-5 دقيقة).
  2. احتضان 1 حجم كرات الدم الحمراء محملة مجلدين من حل بروميلين 0.5٪ لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X 3x أخرى.
  4. الخلايا يمكن تخزينها كحل 3٪ في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني 1X لمدة أسبوع واحد على الأقل.
....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 2A مؤامرة مبعثر ممثل لكرات الدم الحمراء. ويمكن رؤية النابضة مناسبة لكرات الدم الحمراء واحدة في دي FSC-W - FSC-A مؤامرة (P1). عادة حوالي 95٪ من كرات الدم الحمراء تقع ضمن هذه البوابة P1 (الخلايا واحد)، ولكن عندما يتم استخدام نسبة عالية من مصل المريض، وهذا يمكن أن ينخفض ​​إلى 70-80٪، وخصوصا عندما المضادة للRBC الغلوبولين المناعي موجود في مصل المريض.

وتظهر نتائج ممثلة لتأثير مصل المريض AI.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقايسات أعلاه هي استنساخه وقوية. فهي سهلة لأداء وأنه من الممكن القيام بها مع العديد من العينات في نفس الوقت (في لوحة 96 أيضا). وبالتالي، فإن هذا النهج أيضا أن تكون مناسبة لنظام مؤتمتة بالكامل، مثل نظام الروبوت ELISA. وعلى النقيض من التقنيات المستخدمة حاليا، وهذه القياسات ليست الكمية وهذا سيساعد على سبيل المثال في دراسة تأثير مثبطات مكملا. وعلاوة على ذلك، فإن التفسير هو الهدف، وهو ما يشكل تحسنا خلال المقايسات المستخدمة حاليا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SZ وDW تتلقى منحة غير المقيد للViropharma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSFresenius Kabi 
BSASigmaB-4287 
باربيتالفاغرون0261تخضع هذه المادة الكيميائية لتنظيم الأدوية.
الصوديوم باربيتالفاجرون0263تخضع هذه المادة الكيميائية لتنظيم الأدوية.
الجيلاتينميرك1.0470.0500 
كلوريد الصوديومميرك1.06404.1000 
كلوريد المغنيسيومميرك1.05833.0250 
كلوريد الكالسيومميرك1.0238.0500 
Dylight 488 صبغة أمين التفاعليةبيرس46402 
Dylight 650 صبغة أمين التفاعليةبيرس62265  ؛
& ألفا. C5 (Eculizumab) AlexionPharmaceuticals 
FACS (Canto)BDيمكن استخدام أي FACS يحتوي على الليزر المناسب.
مقياس الطيف الضوئي (مثل الطيف Multiskan)  Thermo Labsystems1500-193يمكن استخدام أي مقياس طيف ضوئي بنطاق الطول الموجي الصحيح
FACSDiva software v 6.1.2BD643629يمكن استخدام أي برنامج تحليل FACS متوافق
مع Bromelain SanquinK1121 
BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia - a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Complement ActivationAntibody DepositionFlow CytometryHemolytic AssayRed Blood CellsC3 C4 DetectionQuantitative AnalysisSpectrophotometric DetectionPatient SerumAnti C5 Antibody

Related Articles