مقالة منهجية

انخفاض تركيز إتراكونازول والآماد ناجحة في علاج

11.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51166

⸱

مارس 14, 2014

1School of Public Health, Tropical Medicine and Rehabilitation Sciences, James Cook University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن القضاء على العدوى dendrobatidis Batrachochytrium في البرمائيات باستخدام التركيز المنخفض (0.0025٪) ومدة أقصر (الحمامات خمس دقائق لمدة ستة أيام) من الايتراكونازول من يستخدم عادة. وقد لوحظت أقل وفيات وعدد أقل من الآثار الجانبية السلبية باستخدام هذا البروتوكول العلاج تعديلها.

الملخص

البرمائيات تواجه أكبر انخفاض من أي فئة الفقاريات والسبب الرئيسي لهذه الانخفاضات هو الممرض الفطرية، dendrobatidis Batrachochytrium (دينار بحريني)، والذي يسبب chytridiomycosis المرض. المستعمرات ضمان الأسير مهمة في جميع أنحاء العالم للأنواع المهددة والبرمائيات قد تكون شريان الحياة الوحيد لتلك الموجودة في التهديد الحرجة من الانقراض. الحفاظ على المستعمرات خالية من المرض هو من أولويات مديري الأسير، لم يتم تحديدها حتى الآن علاجات آمنة وفعالة لجميع الأنواع وعبر مراحل الحياة. العلاج الكيميائي الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الايتراكونازول، على الرغم من أن الجرعة المستخدمة عادة يمكن أن تكون ضارة لبعض الأفراد والأنواع. أجرينا محاكمة العلاج السريري لتقييم ما إذا كانت الجرعة أقل وأكثر أمانا لكنها فعالة من الايتراكونازول يمكن العثور على علاج التهابات دينار بحريني. وجدنا أن طريق الحد من تركيز العلاج ،01-،0025٪ وتخفيض مدة العلاج من 11-6 أيام من 5 دقائق الحمامات، ويمكن علاجه الضفادع من عدوى دينار بحريني مع آثار جانبية أقل وأقل الوفيات المرتبطة العلاج.

المقدمة

البرمائيات تشهد حاليا أكبر انخفاض في التنوع البيولوجي من جميع الأصناف الفقارية 1. Chytridiomycosis، مرض جلدي الناجمة عن حيدة الخلية لدى الحيوانات الفطرية dendrobatidis الممرض Batrachochytrium (دينار بحريني)، هي واحدة من الأسباب الرئيسية لهذه الانخفاضات الدراماتيكية 2 دينار بحريني هو أسوأ الممرض على الاطلاق عن التسبب في فقدان التنوع البيولوجي: أن يصيب أكثر من 600 نوعا من البرمائيات وديه تسبب انخفاض في أكثر من 300 نوعا، منها أصبحت ما يصل الى 200 أنواع المهددة بالانقراض أو انقرضت 2،3. وحيدة الخلية لدى الحيوانات البرمائية الفطر لا تستضيف محددة وليس واضحا ما هي الصفات للمضيف السماح للعدوى دينار بحريني إلى التقدم المسببة للأمراض شديدة. Chytridiomycosis يسبب الوفاة عن طريق تعطيل القنوات الأيونية في الجلد، مما يؤدي إلى فقدان الكهارل وفشل القلب 4. أيضا، طاف دينار بحريني (لا تحتوي على zoospores دينار بحريني) يسبب استجابة مناعية في الضفادع الصغيرة 5 الشجريةز الباحثين إلى الاعتقاد دينار بحريني تنتج السمية من قبل المنتج 6.

لأن العديد من الأنواع آخذة في الانخفاض بسرعة، المستعمرات ضمان الأسير وبرامج التربية هي التدابير الهامة الحفظ، ويمكن أن تكون شريان الحياة الوحيد بالنسبة لبعض الأنواع. إنشاء وصيانة المستعمرات خالية من المرض يشكل تحديا لإدارة المرافق البرمائيات. أساليب العلاج الكيميائي الحالي لعلاج الالتهابات دينار بحريني، على الرغم من فعالية، يمكن أن تكون ضارة للحيوانات يعالجون، وكانت لا توجد طريقة علاج واحد ناجح في كل أنواع وفئات العمر من البرمائيات 7.

وقد أجريت التجارب السريرية قليلة من العلاجات لعدوى دينار بحريني 7. الطرق الثلاثة الأكثر شيوعا للعلاج هي العلاج الحراري، الكلورامفينيكول والايتراكونازول. العلاج الحراري هو خيار العلاج nonchemotherapeutic الذي يظهر لديهم آثار جانبية قليلة، ويمكن استخدامها على عدة مراحل الحياة، وينايرحليف فعالة. في محاكمة العلاج، وجدت شاتفيلد وريتشاردز-8 Zawacki أن 96٪ من الحيوانات المعالجة قد مسح العدوى بعد أن يقع في 30 درجة مئوية لمدة 10 يوما. على الرغم من أن هذه المحاكمة لم تكن ناجحة 100٪، فإنه يوفر الأساس للآخرين لتقييم العلاج الحراري للأنواع الخاصة بهم. العلاج الحراري، على الرغم من فعالية بالنسبة لكثير من الأنواع، وغير عملي لكثير من الأنواع جبال الألب التي لا يمكن أن تبقى في درجات حرارة عالية لفترة طويلة من الزمن. الكلورامفينيكول، وهو مضاد للجراثيم، وقد استخدمت بنجاح لعلاج دينار بحريني في كثير من الأنواع، ويمنع نمو الفطريات في المختبر. باعتبارها مضادة للجراثيم، والكلورامفينيكول لا يهاجم الفطر على وجه التحديد ولكن كان من المعروف أن يسبب موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة 9. وكان قد تردد أن العلاج يسبب موت الخلايا المبرمج الكلورامفينيكول في الجلد، مما أسفر عن مقتل مباغات داخل الخلايا، على الرغم من أن الآلية الدقيقة لعمل غير معروف. على الرغم من أنه لم يتم إجراء التجارب السريرية، وبالتاليلم يتم تقييم الجرعة ووقت العلاج، تتطلب بروتوكولات العلاج الحالية عادة غمر لمدة يومين أو أربعة أسابيع 10،11، مما يجعل هذا العلاج غير عملي لالبرمائيات الأرضية. كما تم تقييد الكلورامفينيكول في بعض البلدان للاستخدام البيطري لأن ارتبط التعرض البشري مع شكل نادر من فقر الدم اللاتنسجي 12.

الايتراكونازول، وهو مضاد آزول، هو الأكثر استخداما على نطاق واسع لعلاج عدوى دينار بحريني في عام البرمائيات في الأسر. البروتوكول الأكثر استخداما على نطاق واسع هو الحيوانات الاستحمام في حل الايتراكونازول 0.01٪ لمدة خمس دقائق في اليوم لمدة 11 يوما متتالية. وقد اشتق هذا البروتوكول من المعايير المستخدمة لإدارة الثدييات، و، في حين فعالة لالبرمائيات، لا يقوم على التجارب السريرية في البرمائيات 11،13. هذا البروتوكول يمكن أن يسبب آثار جانبية سلبية في بعض الأنواع، وخاصة في جنس رنا والضفادع الصغيرة وmetamorphs الأخيرة 11.وقد كان العلاج الشرغوف ناجحة باستخدام تركيز أقل من ذلك بكثير (0.0005٪) من الايتراكونازول، ولكن كان مرتبطا مع تصبغ 14. تم محاكمتهم هذا نفس التركيز على metamorphs الأخيرة وجدت أن تنجح في علاج العدوى 15. لأن هناك خطر الآثار الجانبية السلبية مع العلاج الايتراكونازول، استخدمت بعض الممارسين نصف تركيز المعتادة (0.005٪) لمدة 11 يوما متتالية وجدت هذا أن تكون ناجحة في علاج الالتهابات دينار بحريني 16.

هذه الدراسة هو ملخص لمحاكمة العلاج السريري باستخدام الايتراكونازول لعلاج العدوى دينار بحريني 15. يصف بروتوكول محاولة للعثور على أقل جرعة العلاج والوقت الذي هو على حد سواء آمنة وفعالة لعلاج الحيوانات المصابة دينار بحريني مع الايتراكونازول. كانت الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة metamorphs الأخيرة من الضفادع ساحل الخليج، Incilius nebulifer.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأخلاق الموافقة: تمت الموافقة على هذه الدراسة وأساليبها من خلال استخدام الحيوان والعناية جنة جامعة تولين في (البروتوكول لا 0407).

1. اختبار للعدوى دينار بحريني

  1. ينظف لدينار بحريني
    1. الحيوانات مسحة مع مسحة القطن المعقم خمس مرات على ventrum، خمس مرات على كل الفخذ، كل جانب، ولكل الأطراف لما مجموعه 45 السكتات الدماغية. ينظف هو أسلوب موسع لأخذ العينات للدينار بحريني على الجلد البرمائيات.
    2. تناوب بلطف مسحة أثناء والسكتات الدماغية بين لضمان جمع أكبر قدر من الحمض النووي على مسحة.
    3. متجر مسحات في 1.5 مل microtubes في -20 درجة مئوية.
  2. استخراج الحمض النووي وفحص QPCR
    1. استخراج الحمض النووي الجيني من مسحات باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي، وفقا لتعليمات لأنسجة الحيوان.
    2. تحليل الحمض النووي المستخرج باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QPCR) التالية بويل وآخرون 17، مع إجراء التعديلات التالية:
    3. تمييع عينات استخراج الحمض النووي 1:10 مع الماء منزوع الأيونات مزدوجة.
    4. إضافة 0.7 ميكرولتر من ألبومين المصل البقري (BSA) لمنع تثبيط PCR.
    5. تشمل مراقبة إيجابية الداخلية في كل عينة لضمان وPCR تثبيط لا تؤثر النتائج.
    6. عينات تشغيل مع السيطرة الإيجابية والسلبية وسلسلة من المعايير لتقدير التخفيف بوغ حرك (العدوى) حمولة.

2. تلقيح

  1. ثقافة دينار بحريني
    1. إعداد مرق تريبتون بإضافة 10 ز تريبتون إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، تعقيمها (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) وتترك لتبرد. مرة واحدة يتم تبريده الى 23 درجة مئوية، إضافة 1 مل البنسلين، الستربتوميسين.
    2. تنمو سلالة دينار بحريني (JEL411 من J. Longcore، معزولة عن Guabal، بنما من Phyllomedusa يمور) في مرق تريبتون لمدة سبعة أيام في 23 درجة مئوية.
  2. نقل بروث الثقافة وتريبتون لوحات أجار.
    1. لجعل لوحات، إضافة 10 ز 10 ز تريبتون وأجار إلى 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة).
    2. مرة واحدة الخليط تعقيمها هو باردا بما فيه الكفاية للمس، ولكن قبل ذلك تجميده، تصب في أطباق بتري، 1/4-1/3 الكامل، في غطاء تدفق الصفحي.
    3. عندما الاكرم أجار وتبرد تماما، إضافة 0.5 مل مرق دينار بحريني إلى كل لوحة وموزعة بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. السماح ليجف.
    4. مرة واحدة يتم تلقيح لوحات مع zoospores دينار بحريني، لوحات الختم مع parafilm.
    5. السماح لوحات لاحتضان عند 23 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام. تحقق بوغ حرك الحركة لضمان الجدوى قبل التلقيح.
  3. لوحات الفيضانات لحل التلقيح بوغ حرك
    1. بعد 5-7 أيام من الحضانة دينار بحريني والنمو، وإغراق كل لوحة مع 5 مل من ماء الصنبور العمر وتسمح zoospores للدخول وسائل الإعلام لمدة 10 دقيقة.
    2. صب suspe بوغ حركnsion في وعاء المحمولة.
    3. ويقدر تركيز بوغ حرك مع عدادة الكريات.
    4. تمييع الخليط إلى تركيز من 1 × 10 6 في 3 مل ماء الصنبور مع العمر.
  4. تطعيم الحيوانات
    1. في الفردي 50 مل الحاويات، وتطعيم كل حيوان بصب 3 مل مزيج اللقاح على ventrum لها. سماح اضافية لقيحة بالتنقيط في قاعدة الحاوية التلقيح.
    2. ستبقى كل حيوان في حاوية التلقيح لمدة 24 ساعة لضمان العدوى.
    3. بعد 24 ساعة من التلقيح، والعودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها الفردية.
    4. تسمح العدوى لبناء لمدة أسبوعين. تأكيد الإصابة مع مسحة والنتائج QPCR، وبدء العلاج.
    5. لضوابط BD-السلبية والفيضانات الحرة BD-لوحات أجار مع 5 مل الذين تتراوح أعمارهم بين ماء الصنبور، وتلقيح الحيوانات وهمية باستخدام نفس الأساليب على النحو الوارد أعلاه.

3. العلاج حمية

  1. استعداداتإعادة حمام العلاج
    1. إضافة 2.50 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى 1 L الحل رينغر البرمائيات (0.0025٪ الايتراكونازول - أدنى تركيز العلاج الفعال).
      1. البرمائيات رينغر الحل وصفة: 1 L التناضح العكسي أو منزوع الأيونات الماء، وكلوريد الصوديوم 6.6 جم، 0.15 جم كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 0.15 غرام، و 0.2 غرام بيكربونات الصوديوم. الحل الأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة) والسماح لتبرد لدرجة حرارة الغرفة.
      2. ل0.01٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 10.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر
      3. ل0.005٪ تركيز العلاج الايتراكونازول، إضافة 5.00 مل الايتراكونازول مائي (1٪ سبورانوكس الحل عن طريق الفم) إلى الحل 1 L البرمائيات رينغر.
    2. لضوابط BD-الإيجابية والسلبية BD-، والاستحمام الحيوانات في الحل رينغر البرمائيات مع عدم وجود الايتراكونازول.
  2. العلاج <رأ>
  3. وضع البرمائيات الفردية في تطهير الحاويات 50 مل مع 35 مل من محلول العلاج.
  4. يتم تغطية ضمان الحيوانات تماما لمدة خمس دقائق قبل يحوم بلطف الحاوية.
  5. العودة إلى الحيوانات terraria تطهيرها. أكرر لمدة ستة أيام.
  • ضمان نجاح العلاج
    1. حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني على العلاج اليوم تبدأ.
    2. حيوانات الاختبار للعدوى دينار بحريني بعد أسبوع واحد التشطيبات العلاج، ومرة واحدة في الأسبوع وتطهيرها لمدة أربعة أسابيع لضمان العدوى.

    • 4. دينار بحريني لعائلة السلمان

    1. الأسبوعية terraria الفردية تطهير.
      1. يستحم الحاويات terraria والعلاج في 10٪ التبييض حمام الحل.
      2. شطف كل حاوية المبيضة مرتين مع المياه الجارية.
      3. تسمح الحاويات لتجف لمدة 24 ساعة قبل إعادة استخدامها.
    2. ارتداء القفازات عند التعامل مع النتريل نظيفة الحيوانات لمنع التلوث المتبادلدينار بحريني الممرض. تغيير القفازات بين التعامل مع كل حيوان.
    3. تطهير جميع النفايات السائلة قبل التخلص منها من خلال جلب حل التبييض 10٪.
    4. الأوتوكلاف جميع النفايات الصلبة التي من المحتمل ان تعرض لدينار بحريني قبل التخلص منها.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    واعتبر العلاج الايتراكونازول ناجحة إذا كانت جميع الحيوانات BD-سلبية بعد أربعة أسابيع انتهت العلاج. قبل العلاج بدأت، بعد أسبوعين من التلقيح، وأصيب جميع الحيوانات الملقحة دينار بحريني، مع حمولة بوغ حرك متوسط ​​1،121.7 (± 17.34)، بينما بعد أربعة أسابيع انتهت العلاج، وكان الحيوانات السيطرة BD-الإيجابية الحمل وسيلة من بوغ حرك 16،765.12 ( ± 14643.08).

    وكان علاج Incilius nebulifer (ن ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    باستخدام هذا البروتوكول تمكنا من خفض بأمان وفعالية جرعة العلاج ووقت العلاج الايتراكونازول للدينار بحريني في البرمائيات. كان أقل جرعة العلاج والوقت (0.0025٪ لمدة ستة أيام) لعلاج ناجح لإصابة دون سريريا أولا nebulifer. فعالية كل جرعة أقل ووقت العلاج تدليل على الحاجة إلى إجراء تجارب العلاج السريري لعلاج العدوى دينار بحريني، كما أن هناك حاليا أي علاجات آمنة وفعالة لاستخدامها لجميع الأنواع والفئات العمرية من البرمائيات.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    يعلن المؤلف لا المصالح المالية المتنافسة.

    شكر وتقدير

    وأود أن أشكر CL-ريتشاردز Zawacki لمساعدة تصور التصميم التجريبي والمساعدة مع المواد، A. Pessier لمساعدة إنشاء نظام العلاج والتشريح ويحلل، MWH شاتفيلد، MJ Robak، K. تاسكر وD. Lenger للمساعدة في المختبرات والدعم وM. مكفادين وP. هارلو في حديقة حيوان تارونغا لاستخدام الفضاء أثناء التصوير. وقد تم تمويل المشروع جزئيا من قبل وزارة ولاية لويزيانا من الحياة البرية والثروة السمكية من خلال منحة لجنة التعليم البيئي لويزيانا منحت لLA Brannelly وتقنيات الحياة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    0.1٪ إيتراكونازول مائي ، SporonoxJanssen Pharmaceutica Inc.
    كلوريد الصوديومفيشر العلميS640-500
    KClفيشر ScientificBP366-1
    CaCl2< / sub>فيشر ScientificBP510-100
    NaHCO3< / sub>Fisher ScientificBP328-500
    مسحات قطنية معقمةطبية وأسلاكMW113
    1.5 مل أنابيب دقيقةSarstedt73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue KitQiagen69581
    7500 أنظمة حيوية تطبيقية في الوقت الحقيقي PCR4351104
    VIC IPCالأنظمة الحيوية التطبيقية4308323
    BSAالأنظمة الحيوية التطبيقيةAM2618
    AgarInvitrogen30391023
    تريبتونإنفيتروجينQ10029
    البنسلين الستربتومايسينإنفيتروجين15070-063
    طبق بتريسيجما ألدريتشCLS430589
    معدات

    المراجع

    1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
    2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
    3. Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
    4. Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
    5. Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
    6. McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
    7. Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
    8. Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
    9. Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
    10. Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
    11. Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
    12. Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
    13. Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
    14. Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
    15. Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
    16. Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
    17. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
    18. Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
    19. Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
    20. Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    QPCR

    مقالات ذات صلة