Method Article

فرز المتسلسلة الكريات الخلية باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز

DOI:

10.3791/51178

⸱

February 13th, 2014

 ,  ,  , 
1Microbial Biotechnology, Institute Biology Leiden, Leiden University, 2Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Utrecht University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتميز الثقافات المتسلسلة نابعة من السائل بواسطة الكريات أفطوري التي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والفرز مثل الكريات بطريقة عالية الإنتاجية. هذه الكريات يمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات، التي ستوفر يؤدي إلى فهم والسيطرة على تجانس النمو.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي تستخدم في الصناعة لانتاج الانزيمات والمضادات الحيوية. عندما نمت في المفاعلات الحيوية، وهذه الكائنات تشكل شبكات من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم الكريات، والتي هي غير متجانسة في الحجم. نحن هنا تصف طريقة لتحليل والكريات أفطوري الفرز باستخدام كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). يتم إعطاء تعليمات مفصلة للاستعمال الصك والتحليل الإحصائي للبيانات الأساسية. وصفنا وعلاوة على ذلك كيف يمكن فرز الكريات وفقا للإعدادات المعرفة من قبل المستخدم، والتي تمكن معالجة المصب مثل تحليل الحمض النووي الريبي أو محتوى البروتين. باستخدام هذه المنهجية يمكن معالجتها آلية النمو غير متجانسة الأساسية. وسوف يكون هذا مفيدا لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية، نظرا لكون الإنتاجية يرتبط حجم بيليه.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptomycetes هي البكتيريا الخيطية التربة التي هي معروفة جيدا لكفاءتهم لجعل المضادات الحيوية، وكذلك المركبات التي يمكن استخدامها بوصفها مناعة أو لمكافحة العدوى الفطرية أو 1،2 السرطان. بالإضافة إلى ذلك، هذه الكائنات تنتج الأنزيمات التي تهم لمجموعة واسعة من التطبيقات الصناعية 3. ويتم إنتاج معظم هذه المركبات للاهتمام تجاريا في المفاعلات الحيوية. ويتميز نمو streptomycetes في المفاعلات الحيوية عن طريق تشكيل هياكل معقدة من خيوط مترابطة، والمعروفة باسم كتل أو حبيبات. هذه الهياكل متعددة الخلايا غير متجانسة للغاية فيما يتعلق بحجم 4 ويمكن أن تصل إلى الأحجام التي هي أكثر من مليون مرة أكبر من البكتيريا وحيدة الخلية مثل الإشريكية القولونية أو العصوية الرقيقة. على الرغم من أن يعتبر عدم التجانس كصفة مفيدة في النظم البيولوجية الطبيعية 5، فهو يعتبر شرك الإنتاج في الصناعة. الحيويالزراعات مفاعل يجب أن تكون قابلة للتكرار ويمكن السيطرة عليها للحصول على أعلى العوائد الممكنة. وبالتالي، فإن فهم مفصل لدور كل نوع من أنواع بيليه في مفاعل حيوي هو أمر حاسم لتحسين streptomycetes كما ومصنع الخلية.

التدفق الخلوي يستخدم عادة لتحليل الخلايا الفردية في عدد السكان 6. يمكن الحصول على معلومات أجهزة قياس التدفق الخلوي multiparametric عن طريق قياس الخصائص في وقت واحد من الخلايا (مثل الحجم، والكثافة، ومتعدد الألوان مضان). في هذه الطريقة، خصائص الخلية يمكن ربط مما يسهم في فهمنا لعدم التجانس داخل ثقافة ووجود السكان متميزة من الخلايا 6. جعلت أدوات أكثر تخصصا من الممكن لفرز الخلايا وفقا لمعايير المعرفة من قبل المستخدم. على سبيل المثال، يمكن فحص المسوخ. بعد الفرز، مثل خلايا متحولة يمكن زراعتها لمزيد من التوصيف. وقد ثبت هذا بالفعل أن تكون مفيدة، من بين أمور أخرى،لتحسين إنتاجية سلالات 7،8. الفتحات من أجهزة قياس التدفق الخلوي تسمح عادة لمرور الخلايا التي يبلغ قطرها القصوى من ما يقرب من 10 ميكرون. وبالتالي، الكريات من streptomycetes لا يمكن تحليلها مع أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية. هم، ومع ذلك، يمكن تحليلها مع كائن مجمع حدودي محلل وفارز (COPAS). مثل أجهزة قياس التدفق الخلوي العادية، ويمكن الحصول على البيانات COPAS multiparametric الجسيمات بطريقة إنتاجية عالية. اعتمادا على نوع من COPAS يمكن تحليلها 10-1،500 ميكرون الحجم. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح للفرز من الجزيئات الفردية التي يمكن استخدامها للزراعة أو التحليلات المصب، مثل عزل DNA، RNA، أو البروتينات. وقد تم تصميم COPAS البداية لتحليل وفرز الكائنات متعددة الخلايا الصغيرة، مثل الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس 9، والأجنة واليرقات ذبابة الفاكهة 10. كما تم استخدام الصكوك لالزرد 11 لالثانية للفطريات خيطية 12،13. كما تشكل الكائنات الحية الأخير الكريات أفطوري التي هي أكبر من تلك التي شكلتها البكتيريا الخيطية. لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن استخدام COPAS هي أيضا مجدية لstreptomycetes 4. نحن هنا وصف الإجراء التجريبي لاستخدام COPAS لتقييم بيليه عدم التجانس في المتسلسلة coelicolor، بما في ذلك تفاصيل عن منهجية لفرز وفقا لحجم الكريات. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل أخرى streptomycetes تشكيل بيليه.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجراء لتحليل والفرز المتسلسلة الكريات من ثقافة نابعة من السائل القديم لمدة يومين، يتم تمثيل تخطيطي في الشكل 1. وفيما يلي تفاصيل عن هذه الطريقة.

1. النمو (بما في ذلك إعداد وسائل الإعلام والمخازن المؤقتة)

  1. تحضير 1 لتر من 10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS؛ 80 غ كلوريد الصوديوم، 2 ز بوكل، 14.4 ز نا 2 هبو 4، 2.4 غ KH 2 PO 4 في 1 لتر من الماء المقطر تعديلها لدرجة الحموضة 7.4). في وقت الاستخدام إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني 10X إلى 900 مل من الماء المقطر للحصول على 1 لتر من برنامج تلفزيوني.
  2. تحضير 1 لتر من YEME المتوسطة (3 ز Difco خلاصة الخميرة، 5 ز Bacto ببتون، 3 ز OXOID استخراج الشعير، و 10 ز الجلوكوز، والسكروز 340 غرام، الماء المقطر تصل إلى 1 L) و 100 مل من 2.5 M MgCl 2. تعقيم بواسطة التعقيم الحلول على حد سواء. نلاحظ أن وسائل الإعلام الأخرى أيضا المتسلسلة يمكن استخدامها 4،14.
  3. إضافة 100 مل المتوسطة YEME و 0.2 مل 2.5 M MgCl 2 لمعقم 250 مل دورق مخروطي سعة مجهزة معدنية ملفوف الينابيع. إعداد العديد من قوارير كعينات البكتيرية للدراسة.
  4. تطعيم كل قارورة مع 10 8 أبواغ المتسلسلة للحصول على تركيز بوغ من 10 6 جراثيم / مل. تنمو البكتيريا لمدة 2 أيام في 30 درجة مئوية في حين تهتز في 180 دورة في الدقيقة.

2. أخذ العينات

  1. نقل عينة 5 مل من كل ثقافة إلى 15 مل فالكون الأنبوب باستخدام 5 مل ماصة معقمة. بلطف يهز الثقافة في حين أخذ عينة للتأكد من أن العينة ممثلة لثقافة بأكملها.
  2. عندما يتم تحليل العينات على الفور مع COPAS ضرورية أية خطوات إعداد العينات. الحفاظ على عينة على الجليد وانتقل إلى الخطوة 3.1 من هذا البروتوكول. عندما يتم تحليل العينات في نقطة وقت لاحق، وتحديد الكريات كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،5 من هذا البروتوكول. لاحظ أن التثبيت أيضا يمنع نمو البكتيريا في نظام الأنابيب عندما لم تنظف بشكل صحيح بعد analysوفاق. ضمان أن التثبيت مع الفورمالديهايد لا يعيق التحليلات المصب. على سبيل المثال، الحمض النووي الريبي لا يمكن أن تكون معزولة عن الكريات الفطرية بعد التثبيت مع الفورمالديهايد. في المقابل، تم عزل الحمض النووي الريبي بنجاح بعد التثبيت مع الايثانول 70٪ 12.
  3. إضافة 600 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ إلى 5 مل من العينة وتخلط بواسطة قلب و3X الأنبوب. إصلاح العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. الطرد المركزي العينات في 2،500 x ج في الدوار ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف وغسل الكريات مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. كرر الخطوة 2.4 بحيث الكريات يتم غسلها 2X مع برنامج تلفزيوني. ويمكن تخزين العينات في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.

3. تحليل COPAS

  1. تأكد من تشغيل COPAS زائد، ومضخة، الكمبيوتر و488 نانومتر ليزر الأرجون وعلى بدء البرنامج Biosort. على الرغم من تحول، والليزر لا يزال في عمل الاستعداد.
  2. معرفة ما اذا كان زجاجة السائل غمد مليء وزجاجة فارغة النفايات.
  3. انقر على "ستارت" ثم "RUN" لتبديل 488 نانومتر ليزر الأرجون من الاستعداد ليوم. بعد حوالي 60 ثانية، وعندما ليزر على، انقر فوق "تم".
  4. تحقق من أجهزة قياس الضغط. الضغوط ل 'غمد'، 'نموذج'، 'فارز' و 'نظيف' يجب قراءة حول 4.0، 0.5، 2.7، و 10.9 على التوالي.
  5. انقر على مربع الاختيار بجوار "موافق الضغط '. النظام ثم يعبي الخلية التدفق وجاهز للاستخدام.
  6. ويفترض الإعدادات القياسية مع 'تأخير' في 11 و 'العرض' 7. يتم تعيين عتبات في 50 ل 'الإشارة' و 40 ل 'TOF الحد الأدنى "، مع TOF تمثل الرحلة من الوقت. (للاكتمال: يتم تعيين كافة "الأرباح" في 1، يتم تعيين على الزناد في EXT (الانقراض)، وفي علامة التبويب "تكوين" ضمن "حدد معدل المسح" يتم اختيار 2.50 ميغاهيرتز تم تعيين الصدفة إلى 'تعزيز').
  7. إزالة المياه المتبقية من عينة الكأسد إضافة 0.1 مل من عينة المتسلسلة من الخطوة 2.2 أو 2.5 في الكأس معا مع برنامج تلفزيوني (حوالي 50 مل). تأكد من إغلاق كوب العينة بشكل صحيح.
  8. انقر على "اكتساب" إلى البدء في جمع البيانات. إدارة سرعة تدفق للحصول على ما بين 30-50 الأحداث في الثانية الواحدة. إذا كان تدفق عالية جدا، إضافة إلى برنامج تلفزيوني كأس العينة. إذا كانت سرعة تدفق منخفض جدا، إضافة المزيد من العينة.
  9. عندما يتم جمع ما لا يقل عن 2،500 الأحداث النقر على "إيقاف". لحفظ كافة البيانات انقر 'مخزن' وحفظ الملف للتحليل الإحصائي لاحقة. يقوم البرنامج Biosort حفظ البيانات في الملفات الأربعة، والتي سيتم استخدامها فقط على ملف txt. لتحليلها لاحقا.
  10. تنظيف كوب عينة عن طريق إزالة عينة مع حقنة 50 مل وغسل 2X مع الماء.
  11. كرر الخطوات 3،7-3،10 حتى يتم تحليل جميع العينات.

4. تحليل البيانات

  1. فتح ملف TXT. وتجاهل البيانات مع EXT أقل من 25 (على سبيل المثال باستخدام إكسل). هذايتوافق مع الحطام وشظايا خوطي فضفاضة (على النيجر الرشاشيات يتم تجاهل كافة البيانات مع EXT أقل من 150) 4،12. ثم، وتوفير جميع TOFs في عمود واحد في سهل ملف (للعديد من ملفات البيانات هذه يمكن أن يكون آليا في لغة البرمجة R، التي تتوفر من: 'النص'. http://www.r-project.org ).
  2. تأكد SciLab (الإصدار 5.3.2 أو أحدث من http://www.scilab.org/) يتم تثبيت جنبا إلى جنب مع مكتبة "fittools '، والذي يتوفر، جنبا إلى جنب مع الدليل، من:
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/fittools.zip
    http://web.science.uu.nl/microbiology/images/fung/manual٪ 20fittools.pdf
  3. بدء تشغيل SciLab والوظائف اللازمة للمكتبة fittools لنمذجة البيانات. باختصار: تثبيت مكتبة fittools كما هو موضح في دليل (يحتاج فقط مرة واحدة).
    1. تحميل مكتبة fittools.
    2. قراءة البيانات (. النص 'ملف) في SciLab.
    3. تسجيل تحويل البيانات (سجل الطبيعية هي وظيفة السجل الافتراضي).
    4. تناسب نموذج 2 السكان إلى البيانات.
    5. رسم بياني مع الرسم البياني ونموذج (اختياري).
    6. ألبس الحذاء البيانات (1،000 مكررات).
    7. تناسب نموذج لقواعد البيانات ألبس الحذاء.
    8. الحصول على ثقة فترات تقديرات المعلمات 5. هذا وسوف توفر معلومات عن الكسر المشاركة (ع) من السكان، وبها 2 يعني (μ μ 1 و 2) والانحرافات المعيارية المرفقة (α α 1 و 2). وعلاوة على ذلك، يتم تحديد فترات الثقة 95٪ من تجديدها مع النموذج بعد إلباس الحذاء (1،000 مكررات) 12،13،15. عندما فترات الثقة من وسائل لا تتداخل وفترة الثقة ع ما بين 0،025-0،975 مجموعة البيانات يمكن تفسيره على أنه مزيج من اثنين من السكان من التوزيع الطبيعي. (لاحظ الفي جزء مشاركة الكريات الصغيرة هو ع، في حين أن مشاركة الكريات الكبيرة هي 1 - ص) العلاقة بين TOF وقطر بيليه المتسلسلة يساوي 0.57 × 159 ميكرون TOF + 4.
  4. في حالة تم العثور على اثنين من السكان استخدام متوسط ​​TOFs كما الفرز المعلمات في COPAS كما العلوي والسفلي ملزمة لفرز الكريات الصغيرة والكبيرة في وقت لاحق. لاحظ أنه يمكن أيضا أن يتم اختيار المعلمات الفرز الأخرى تبعا لمتطلبات المستخدم.

5. بيليه الفرز

  1. تحميل عينة المتسلسلة التي يتعين تسويتها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
  2. تعيين 'الفرز حدود' وتقديم تفاصيل عن الحد الأدنى (لو) والحد الأقصى (مرحبا) القيم TOF. بدلا من ذلك، وضع منطقة عن طريق تحديد "المناطق" ثم "تحديد بوابة منطقة 'لتحديد الكريات مع الأبعاد المطلوب أو الخصائص.
  3. وضع أنبوب 50 مل لجمع الكريات المتعددة التي تلبي معايير الفرز. بدلا من ذلك، لوحة عيار الصغيرة يمكن استخدامها لفرز الكريات الفردية. وهناك حاجة إلى الكريات متعددة (10 -10 4 5) لاستخراج الحمض النووي والبروتينات. A بيليه واحدة كافية لتحليل QPCR في التعبير الجيني، ولكن هناك حاجة الكريات متعددة لRNA التسلسل.
  4. تقرر وتعيين عدد من الكريات التي تحتاج إلى أن يتم فرز وانقر على "ترتيب يدويا" لفرز للمعلمات المحددة. عند الوصول إلى المبلغ المحدد من الكريات، وينتهي الفرز تلقائيا.
  5. إزالة خلفها العينة مع حقنة 50 مل من عينة كوب وغسل الكأس مع 2X المياه. كرر الخطوات من 5،1-5،5 إذا كان بحاجة إلى عينات أخرى ليتم فرزها.
  6. قبل اغلاق COPAS شطف كوب العينة مع الماء لإزالة الكريات المتبقية وتنظيف كوب عينة مع 70٪ ETOH و / أو 2٪ هيبوكلوريت في الماء. تشغيل عينة من المياه المعالجة بالكلور لتنظيف النظام بأكمله وكرر هذا مع الماء. ر فارغةوقال انه تجاوز الحاويات ونظيفة أو استبدال فلتر التي تتواجد في هذه الحاوية.
  7. عند الانتهاء، انقر فوق "إيقاف" للافراج عن الضغط من النظام. عندما يغلق توقف المحرك البرنامج وانقر فوق "إيقاف دون تطهير '. ثم إيقاف تشغيل الكمبيوتر، COPAS، ليزر، والمضخة.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قياسات COPAS الكريات المتسلسلة
Streptomycetes تشكيل الكريات أفطوري في الثقافات السائلة التي لديها مجموعة واسعة من الأحجام. لتحليل توزيع حجم بيليه، السائل 2 يوما من العمر تعرضت نمت المتسلسلة الثقافة coelicolor لتدفق الجسيمات الكبيرة الخلوي باستخدام COPAS بالاضافة الى التعريف مجهزة 1 مم فوهة. وخرج COPAS نموذجي هو مؤامرة مبعثر مثل تصور في الشكل 2A. يمثل المحور س الوقت من الطيران (TOF)، الذي يرتبط مع حجم بيليه (أي يستغرق وقتا أطول لكريات أكبر لتمرير شعاع الليزر). ويبين المحور الصادي انقراض، الذي يمثل الكثافة البصرية للكائن. كل نقطة في المؤامرة مبعثر يتوافق مع حدث واحد، أي بيليه واحد يمر شعاع الليزر. الأهم من ذلك، عندما يتركز العينة أيضا (أي عندما يكتشف الليزر أكثر من 100 الأحداث / ثانية)، يفشل COPAS في كثير من الأحيان للكشف ع الفرديةellets. وهذا يؤدي إلى القيم TOF كاذبة التي هي عالية جدا. تمييع العينة يقلل من متوسط ​​قيم TOF، وتصل إلى نقطة حيث لا مزيد من تمييع لم يعد تأثير TOF. يتم التوصل إلى هذه النقطة عندما تم تحليل حوالي 100 الكريات / ثانية.

التآمر نقاط البيانات في الرسم البياني يشير إلى أن أحجام ليست موزعة بشكل عادي (الشكل 2B). يظهر التوزيع أن تميل إلى اليمين. تسجيل تحويل مجموعة البيانات أيضا لم يؤدي إلى التوزيع الطبيعي (الشكل 2C). لتقييم ما إذا كان حجم التوزيع يمكن تفسيرها من خلال افتراض وجود مزيج من اثنين من التوزيع الطبيعي والبيانات غرار رياضيا 12،15. وأشار نمذجة الواقع أن حجم التوزيع يمكن تفسير ذلك على افتراض وجود اثنين من السكان متميزة من الكريات. يتألف سكان كريات صغيرة من 92٪ من جميع الكريات بمتوسط ​​حجم 248 ميكرون، في حين أن عدد سكان كبير ااايتيح زيارتها (8٪ من مجموع الكريات) بمتوسط ​​حجم 319 ميكرومتر (لاحظ أن يفترض اثنين من السكان في الوجود عندما الكسر المشاركة ما بين 2،5 حتي 97،5٪).
فرز الكريات المتسلسلة وفقا لحجم

تم فرز المستعمرات الصغيرة من سكان كريات الكبيرة والصغيرة. تحقيقا لهذه الغاية، تم استخدام متوسط ​​أحجام بيليه السكان اثنين لتحديد حدود للفرز. واعتبرت الكريات أصغر من 248 ميكرون أن يكون من السكان بيليه صغيرة، في حين اعتبرت الكريات أكبر من 319 ميكرون أن يكون من السكان بيليه كبيرة (الشكل 3)، وذلك للحد من الفرز الكريات من الجزء تداخل حجم اثنين التوزيعات. وأظهر التحليل المجهري لفرزها أحجام الكريات المتميزة (الشكل 3). ويمكن جمع المزيد من الكريات المستخدمة في الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، أو العزلة البروتين.


الشكل 1. تمثيل تخطيطي من الإعداد التجريبية لقياس وتحليل الكريات المتسلسلة باستخدام COPAS. لمزيد من التفاصيل، راجع الإجراءات التجريبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

figure-results-1
الشكل 2. عدم التجانس في حجم بيليه نمت السائل الثقافات المتسلسلة. تحليل COPAS من S. القديمة 2 يوما ثقافة coelicolor YEME (A) يشير إلى أن أحجام بيليه (المشار إليها مع مرور الوقت من القيم الطيران) ليست عادة توزيعد (B)، وذلك عندما لا تصبح-حولت السجل (C). بدلا من ذلك، تم الكشف عن اثنين من السكان من الكريات التي تختلف في TOF (وبالتالي حجم). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

figure-results-2
الرقم 3. تجزئة الكريات المتسلسلة وفقا لحجم. الكريات مع حجم واعتبرت أصغر من 248 ميكرون (المشار إليها باللون الوردي) لتكون الكريات الصغيرة، في حين اعتبرت الكريات مع حجم أكبر من 319 ميكرون (المشار إليها باللون الأزرق) لتكون الكريات الكبيرة. وأكد التحليل المجهري الفرق في الحجم. لاحظ أنه تم حساب هذه الأحجام من البيانات تحولت سجل باستخدام العلاقة بين وصف TOF ودiameter من بيليه المتسلسلة، أي ما يعادل 0.57 × TOF + 159 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التدفق الخلوي وقد مكن تحليل عالية السرعة أعداد كبيرة من الخلايا واحد، الأمر الذي ساهم في فهمنا لعدم التجانس في السكان نسيلي 6. العادية التدفق الخلوي ليست مجدية لتحليل الكريات أفطوري متعددة الخلايا من streptomycetes والفطريات. وقد أظهرت عملنا أن تحليل الإنتاجية العالية من الكريات المتسلسلة هو ممكن باستخدام COPAS. الإجراء المذكورة هنا هي بسيطة وسريعة، وقابلة للتكرار للغاية. المعلمة الحرجة أن نأخذ في الاعتبار أثناء تشغيل الأداة هي سرعة تدفق، والتي يجب أن لا تتجاوز 100 الأحداث / ثانية (3.8 خطوة من هذا البروتوكول). إذا كان تركيز بيليه، وبالتالي أيضا سرعة التدفق، ويصبح عالية جدا، وسوف أخطأت القيم TOF بسبب فشل أداة للكشف عن الكريات الفردية. تمييع العينة بما فيه الكفاية من خلال إضافة برنامج تلفزيوني يتغلب على هذه المشكلة.

القيود
استخدام COPAS بلس د هنا له فوهة قطرها من 1 ملم، الذي هو مناسبة لقياس الجسيمات مع حجم تتراوح 30-700 ميكرون. ولهذا يمكن قياس فوهة الكريات التي شكلتها streptomycetes. في حالة الفطريات الخيطية قد تكون المستعمرات الصغيرة أكبر، مما يحد من مدى انطباق العام للCOPAS زائد. وCOPAS XL يمكن قياس الجسيمات يصل إلى 1،500 ميكرومتر في الحجم ولكن حساسيتها في نطاق أقل من قطرها أقل مقارنة بما كان عليه من COPAS زائد. كل من COPAS زائد وCOPAS XL لا يمكن تحليل جسيمات أصغر من 30 ميكرومتر. هذا يعني أن الجراثيم الميكروبية أو الخلايا الفردية لا يمكن تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، قد لا COPAS تحليل بدقة المجاميع الصغيرة من الجراثيم والخلايا أو المستعمرات الصغيرة الصغيرة جدا. لهذا، يجب استخدام تحليل الخلايا العادية. يتم التغلب على هذا القيد من قبل Biosorter من الاتحاد Biometrica، والتي يمكن تحليل الجزيئات في مجموعة من 1-1،500 ميكرون. لكن الجائزة الشراء هو أعلى من ذلك.

ر "> استكشاف الأخطاء وإصلاحها
وCOPAS هو أداة قوية التي من السهل أن تعمل. ومع ذلك، وأحيانا لا يتم الكشف عن الكريات بعد تحميل عينة في الكأس العينة والبدء في القياس. السبب هو عادة أنبوب دخول انسداد، والتي يمكن بسهولة أن تحل عن طريق الضغط على القيادة 'نظيفة'. وهذه القوة الكريات مرة أخرى من نظام أنابيب في الكأس العينة. قد يكون السبب البديلة التي لا غطاء وضعها بشكل صحيح على الكأس العينة. وهذا يؤدي إلى فقدان الضغط والفشل المصاحبة للكشف عن الكريات.

أهمية والاتجاهات المستقبلية
ركزنا هنا على تحليل حجم بيليه ولكن الإعداد COPAS هي أيضا قادرة على تحليل والفرز على أساس مضان والكثافة. الكشف عن مضان تمكننا من تحليل التعبير الجيني على أساس صحفيين مثل GFP. علاوة على ذلك، يمكن تقييم تكوين الخلايا. أكثر قوة هو الخيار لفصل الكريات وفقا لهذه parameالنسب. فرز الكريات يمكن استخدامها لتحليل المصب، بما في ذلك جميع OMICS-الدراسات. في الواقع، ونحن فرزها سابقا 60،000 الكريات الكبيرة والصغيرة 200،000، وأثبتت أن بروتيوم كانت مختلفة بشكل ملحوظ بين الكريات الكبيرة والصغيرة 4. وبالتالي توفر هذه التكنولوجيا خيوط جديدة لتحسين streptomycetes كمصانع الخلية.

الميزة الأساسية لتكنولوجيا COPAS هو الوقت. أجريت الدراسات السابقة على الكريات الخلايا باستخدام المجهر، وهذا يحد من عدد الكريات التي يمكن تحليلها تصل إلى عدة مئات 16. اقترحت الدراسات المجهري بالفعل وجود اثنين من السكان من الكريات في نمت السائل المتسلسلة الثقافات 16. في الواقع، تم الكشف عن اثنين من سكان كريات بغض النظر عن الظروف والثقافة في عدد كبير من streptomycetes مختلفة 4. لا يقتصر هذا الحجم إلى عدم التجانس streptomycetes الخيطية، ولكن لوحظ أيضا في الفطريات الخيطية 12 </ سوب>. في جميع الحالات، والآليات الكامنة وراء عدم التجانس ليست معروفة حتى الآن. إمكانية فرز الكريات وفقا لحجم ومضان تمكننا من كشف مثل هذه الآليات.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS PlusUnion BiometricaPLUSمقياس تدفق الجسيمات الكبير بما في ذلك الليزر والبرامج
NaClSigma AldrichS3014PBS مكون
KClSigma AldrichP9541PBS
مكون Na2< / sub>HPO4< / sub>Sigma AldrichS3264PBS
مكون KH2PO4< / sub> فرعيسيجما ألدريتشP9791مكون PBS
مستخلص الخميرة ديفكوBD Biosciences210933مكون وسائل الإعلام
باكتو الببتونBD Biosciencesوسائل الإعلام211677
مستخلص الشعير الأكسوديفيشر OXLP0039B العلممكون وسائل الإعلام
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270وسائل الإعلام مكون
السكروزسيجما ألدريتشS9378مكون وسائل الإعلام
MgCl2< / sub>& bull; 6H2OSigma AldrichM2670مكونات الوسائط. أضف بعد التعقيم.
محلول الفورمالديهايدSigma AldrichF8775تثبيت الكريات
محلول هيبوكلوريت الصوديوم  Sigma Aldrich71696لتنظيف الأداة
EtOHVWR20816.367لتنظيف الأداة
قارورة Erlenmeyer (250 مل)قارورة Fisher Scientific214-1132Culture for growing Streptomyces
SpringsVerenfabriek de Spiraalحسب الطلبالمستخدمة في قارورة الثقافة. RVS1.4401 / الطول 210 مم / القطر 17 مم / الملعب 5 مم
أنبوب الطرد المركزي المعقم (15 مل)Sarstedt62.554.002
محاقن (50 مل)سيجماZ683698
مكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , University Press. New York, Oxford. (2007).">Hopwood, D. A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. , University Press. New York, Oxford. (2007).
  2. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).">van Wezel, G. P., McDowall, K. J. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat. Prod. Rep. 28, 1311-1333 (2011).
  3. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).">Anné, J., Maldonado, B., Van Impe, J., Van Mellaert, L., Bernaerts, K. Recombinant protein production and streptomycetes. J. Biotechnol. 158, 159-167 (2012).
  4. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).">van Veluw, G. J., et al. Analysis of two distinct mycelial populations in liquid-grown Streptomyces cultures using a flow cytometry-based proteomics approach. Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1301-1312 (2012).
  5. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).">Veening, J. W., Smits, W. K., Bistability Kuipers, O. P. epigenetics, and bet-hedging in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).
  6. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).">Davey, H. M., Winson, M. K. Using flow cytometry to quantify microbial heterogeneity. Curr. Issues Mol. Biol. 5, 9-15 (2003).
  7. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).">Betz, J. W., Aretz, W., Härtel, W. Use of flow cytometry in industrial microbiology for strain improvement programs. Cytometry. 5, 145-150 (1984).
  8. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).">Bell, P. J., et al. A flow cytometric method for rapid selection of novel industrial yeast hybrids. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1669-1672 (1998).
  9. C. elegans: methods and applications. Strange, K. , Springer. 275-286 (2006).">Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. C. elegans: methods and applications. Strange, K. , Springer. 275-286 (2006).
  10. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).">Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
  11. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).">Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, (2011).
  12. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).">de Bekker, C., van Veluw, G. J., Vinck, A., Wiebenga, L. A., Wösten, H. A. B. Heterogeneity of Aspergillus niger microcolonies in liquid shaken cultures. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1263-1267 (2011).
  13. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).">van Veluw, G. J., et al. Heterogeneity in liquid shaken cultures of Aspergillus niger inoculated with melanised conidia or conidia of pigmented mutants. Stud. Mycol. 74, 47-57 (2013).
  14. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).">Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich. (2000).
  15. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).">Vinck, A., et al. Hyphal differentiation in the exploring mycelium of Aspergillus niger. Mol. Microbiol. 58, 693-699 (2005).
  16. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).">Reichl, U., King, R., Gilles, E. D. Characterization of pellet morphology during submerged growth of Streptomyces tendae by image analysis. Biotechnol. Bioeng. 39, 164-170 (1992).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Streptomyces PelletsCOPAS SorterFlow CytometryPellet Size AnalysisMycelial Pellet SortingTime of FlightExtinction MeasurementLarge Particle CytometryPellet HeterogeneityStreptomyces Culture

Related Articles