البكتيريا قد تتراكم إما الطفرات الضارة أو المفيدة خلال حياتهم. في مجموعة من الخلايا الأفراد التي تراكمت الطفرات المفيدة قد تفوق بسرعة زملائهم. هنا نقدم إجراء بسيط لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا بكتيرية مع مرور الوقت باستخدام الأفراد المسمى fluorescently.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة المنافسة داخل الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية عن طريق Cocultivation من السلالات المسمى Fluorescently
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا تتكاثر بسرعة كبيرة والسكان قد تصل إلى كثافات الخلايا العالية. الكسور الصغيرة من الخلايا في السكان لديها دائما الطفرات المتراكمة التي هي إما ضارة أو مفيدة للخلية. إذا كان تأثير اللياقة البدنية للطفرة يوفر للزم السكان الفرعيين ميزة نمو انتقائية قوية ، فقد يتفوق أفراد هذه الاكتظاظ السكاني الفرعي بسرعة وحتى القضاء التام على زملائهم المباشرين. وهكذا، فإن التغيرات الجينية الصغيرة والتراكم القائم على الاختيار للخلايا التي اكتسبت طفرات مفيدة قد يؤدي إلى تحول كامل في النمط الجيني لخلايا المجموعة. هنا نقدم إجراء لرصد التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة الخلايا البكتيرية مع مرور الوقت عن طريق cocultivation من الأفراد المسمى فلوريا من البكتيريا نموذج إيجابي غرام عصيات subtilis. طريقة سهلة الأداء وتوضيحية جدا لعرض المنافسة داخل الأنواع بين الأفراد في مجموعة خلايا بكتيرية.
المقدمة
وعادة ما تكون بكتيريا التربة مزودة بشبكات تنظيمية مرنة وقدرات استقلابية واسعة. كلا الميزتين تمكن الخلايا لضبط مساراتها تقويضي والابتنائية للتنافس مع زملائهم والكائنات الحية الدقيقة الأخرى للمغذيات, التي تتوفر في مكانة بيئية معينة1. ومع ذلك ، إذا كانت البكتيريا غير قادرة على التكيف مع بيئتها آليات أخرى قد تفسر بقاء الأنواع. في الواقع، كما العديد من البكتيريا تتكاثر بسرعة والسكان يمكن أن تصل إلى كثافة الخلايا العالية التجمعات السكانية الفرعية قد تراكمت تلقائيا الطفرات المفيدة التي توفر للخلايا مع ميزة النمو الانتقائي، وبالتالي زيادة لياقتهم البدنية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن النقاط الساخنة الطفرة وطفرات التكيف الناجمة عن الإجهاد تسهيل تطور بكتيريا غير معدلة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد لوحات أجار، وسائل الإعلام الثقافية، Cryostocks، والثقافات المسبقة
- إعداد وسائط النمو والكواشف المطلوبة (انظر جدول المواد والكواشف).
- خط سلالات B. subtilis (على سبيل المثال. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) معبرا عن واحد واثنين من GDHs النشطة ، على التوالي) 2 التي سيتم استخدامها في تجربة المنافسة على لوحات أجار متوسطة SP للحصول علىمستعمرات واحدة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 °C.
- خذ مستعمرات واحدة وأنابيب زراعة معقمة تلقيح تحتوي على 4 مل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تطبيق الطريقة الموصوفة هنا بنجاح لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا تتكون من سلالات B. subtilis التي تم تصنيفها بجينات cfp و yfp لترميز الفلوروفوريس CFP و YFP ، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 3، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور المنافسة داخل الأنواع بطريقة توضيحية للغاية. من خلال اكتشاف العينات على مناطق صغيرة ، تم جعل التكوين اللاستنساخي تجمعات الخلايا مرئيا في لمحة. وعلى الرغم من أن هذا النهج غير مناسب للتحليلات الكمية، إلا أنه مفيد لتقدير تأثير معلمات النمو المخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وضعت عدة طرق لتحليل اللياقة التنافسية للبكتيريا16. في كثير من الحالات وصفت البكتيريا مع أشرطة مقاومة المضادات الحيوية المختلفة17. على غرار نهجنا ، فإن وضع العلامات على الخلايا باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيوية يسمح بتقييم اللياقة التنافسية للبكتيريا أثناء cocultivation في ظل ظروف نمو محددة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد اللياقة التنافسية للخلايا التي تختلف عن بعضها البعض في مكان معين على الكروموسوم17. ومع ذلك، هناك بعض العيوب باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
وقد دعم العمل في مختبر المؤلفين دويتشه فرانشونجسجيمينشافت (http://www.dfg.de؛ CO 1139/1-1)، ومؤسسة دير شيمشين للصناعات (http://www.vci.de/fonds)، ومركز غوتنغن للبيولوجيا الجزيئية (GZMB). ويود المؤلفون أن يعترفوا بيورغ ستولكي لتعليقاته المفيدة وقراءة المخطوطة النقدية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
lb متوسط < / قوي >الخميرةالصوديوم LB غلوتاماتL-Glutamic50٪
المغذيات SP < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (NH4)2SO4 | روث ، ألمانيا | 3746 | |
| أجار | ديفكو ، الولايات المتحدة الأمريكية | 214010 | |
| سترات الحديديك الأمونيوم (CAF) | سيجما ألدريتش ، ألمانيا | 9714 | |
| CaCl2 < / sub> | Roth ، ألمانيا | 5239 | |
| Glucose | Applicem ، ألمانيا | A3617 | |
| Glycerol | Roth ، ألمانيا | 4043 | |
| K2< / sub>HPO4< / sub>& bull ؛ 3H2O | Roth, Germany | 6878 | |
| KCl | Applichem, Germany | A3582 | |
| KH2PO4 | Roth, Germany | 3904 | |
| KOH | Roth, Germany | 6751 | |
| MgSO4& bull; 7H2O | Roth, Germany | P027 | |
| MnCl2 | روث ، ألمانيا | T881 | |
| MnSO4< / sub>& bull ؛ 4H2< / sub>O | Merck Millipore ، ألمانيا | 102786 | |
| NaCl | Roth ، ألمانيا | 9265 | |
| مرق المغذيات | Roth ، ألمانيا | X929 | |
| غلوتامات البوتاسيوم | Applicem ، ألمانيا | A3712 | |
| Tryptone | Roth ، ألمانيا | 8952 | |
| Tryptophan | Applichem ، ألمانيا | A3445 | |
| مستخلص الخميرة | روث ، ألمانيا | 2363 | |
| 1.5 مل أنابيب التفاعل | Sarstedt ، ألمانيا | 72،690،001 | |
| 2.0 مل أنابيب التفاعل | Sarstedt ، ألمانيا | 72،691 | |
| 15 مل أنابيب بلاستيكية مع غطاء لولبي | Sarstedt ، ألمانيا | 62،554،001 | |
| أطباق Petri | Sarstedt ، ألمانيا | 82.1473 | |
| 1.5 مل من البوليسترين كوفيت | Sarstedt ، ألمانيا | 67،742 | |
| 15 مل أنابيب زراعة زجاجية ؛ | العلامة التجارية, ألمانيا | 7790 22 | |
| 100 مل قوارير رج مع أغطية من الألومنيوم | العلامة التجارية, ألمانيا | 928 24 | |
| ماصات زجاجية معقمة 10 مل | العلامة التجارية, ألمانيا | 278 23 | |
| حاضنة (28 و 37 درجة ; ج) | مجموعة الماصات القياسية New Brunswick | M1282-0012 | |
| (2-20 & mu; ل, 10-100 & لتر ، 100-1,000 مو ؛ ل) | Eppendorf ، ألمانيا | 4910 000.034 ، 4910 000.042 ، | |
| جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لأنابيب تفاعل 1.5 و 2 مل | Thermo Scientific ، Heraeus Fresco 21 ، ألمانيا | 75002425 | |
| جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لأنابيب بلاستيكية سعة 15 مل | Heraeus Biofuge Primo R ، ألمانيا | 75005440 | |
| مقياس الطيف الضوئي القياسي | Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro ، ألمانيا | 80-2112-21 | |
| المجهر التجسيم | Zeiss SteREO Lumar V12 ، ألمانيا | 495008-0009-000 | |
| فريزر (-20 و -80 درجة ؛ ج) | - | ||
| ثلاجة (4 درجة ؛ C) | - | ||
| الأوتوكلاف | Zirbus ، LTA 2x3x4 ، ألمانيا | - | |
| مقياس الأس | الهيدروجيني 766 ، Calimatic ، Nick ، ألمانيا | 766 | |
| Vortex | Vortex 3 ، IKA ، ألمانيا | 3340000 | |
| Balance | CP2202S ، Sartorius ، ألمانيا | تم استبدالها بقلم | |
| أسود (علامة دائمة) | Staedler ، ألمانيا | 317-9 | |
| برنامج Powerpoint | مايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكية | - | |
| برنامج Excel | ، مايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكية | - | برنامج لمعالجة البيانات |
| Adobe Photoshop CS5 | Adobe ، الولايات المتحدة الأمريكية | استبداله ب CS6 ، تنزيل | برنامج الكمبيوتر لمعالجة الصور |
| الكمبيوتر | الشخصي أو | Mac-ZEN | |
| pro 2011 برنامج المجهر | التجسيميزايس ، ألمانيا | 410135 1002 110 | AxioCam MRc Rev. تم الحصول عليها من خلال Zeiss |
| وصفات محلول محددة< / strong> | |||
| SP متوسط< / قوي> | |||
| 8 جم مرق | |||
| 0.25 مجم MgSO4< / sub>& bull ؛ 7H2O | |||
| 1 جم KCl | |||
| 15 جم أجار لوسط | الصلب إذا لزم الأمر | ||
| أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف H2O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| 1 مل CaCl 2< / sub > (0.5 M) ، معقم بالترشيح | |||
| 1 مل MnCl 2< / sub > (10 م) ، معقم بالترشيح | |||
| 2 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح | |||
| 10 جم تربتون | |||
| 5 جم مستخلص | |||
| 10 جم كلوريد | |||
| 15 جم أجار لوسط | الصلب إذا لزم الأمر | ||
| أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف H2< / sub>O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| <قوي>C-Glc الحد الأدنى من المتوسط< / قوي | |||
| >200 مل 5 × C أملاح | |||
| 10 مل L-Tryptophan (5 مجم / مل) ، معقم بالترشيح | |||
| 10 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح | |||
| 10 مل III 'أملاح | |||
| 25 مل جلوكوز (20٪) | تعقيم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| أضف 1 لتر مع H2< / sub>O | |||
| CE-Glc الحد الأدنى المتوسط < / قوي | |||
| >200 مل 5 × C أملاح | |||
| 10 مل L-Tryptophan (5 مجم / مل) ، معقم بالترشيح | |||
| 10 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح | |||
| 10 مل III’ أملاح | |||
| 20 مل غلوتامات (40٪) | |||
| 25 مل جلوكوز (20٪) ، معقمة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | |||
| أضف 1 لتر مع أملاح H2< / sub>O | |||
| 5 × C أملاح ؛ | |||
| 20 جم KH2PO4 | |||
| 80 g K2HPO4• 3H2O | |||
| 16.5 g (NH4)2SO4 | |||
| add 1 L مع الأوتوكلاف H2O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة; C | ||
| III' أملاح | |||
| 0.232 جم MnSO4& bull; 4H2O | |||
| 12.3 g MgSO4& bull; 7H2< / sub>O | |||
| إضافة 1 لتر مع H2< / فرعي >O ، الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | |||
| 40٪ محلول | |||
| 200 جم حمض | |||
| اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 عن طريق إضافة ما يقرب من 80 جم KOH | |||
| أضف 0.5 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| <قوي>0.9٪ محلول ملحي (كلوريد الصوديوم) < / قوي > | |||
| أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| محلول الجلسرين | |||
| 295 مل الجلسرين (87٪) | |||
| أضف 0.5 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>O | لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C | ||
| البكتيريا (تعتمد جميع السلالات على سلالة Bacillus subtilis< / em> سلالة 168) | |||
| Bacillus subtilis< em> BP40 (rocG+< / sup> gudBCR amyE: :P gudB-yfp) | مختبر سلالة جمع | ||
| <م > العصيات الرقيقة < م > BP41 (rocG < sup> + < / sup> gudB CR < / sup> amyE: :P gudB-cfp) ؛ | |||
| Bacillus subtilis< / em> BP52 (rocG+< / sup> gudB+< / sup> amyE: :P gudB-cfp) | |||
| Bacillus subtilis< / em> BP156 (rocG+ gudB+ amyE: :P gudB-yfp) |
المراجع
- Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
- Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
