مقالة منهجية

مراقبة المنافسة داخل الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية عن طريق Cocultivation من السلالات المسمى Fluorescently

DOI:

10.3791/51196

⸱

يناير 18, 2014

 ,  ,  , 
1Department of General Microbiology, Georg-August University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا قد تتراكم إما الطفرات الضارة أو المفيدة خلال حياتهم. في مجموعة من الخلايا الأفراد التي تراكمت الطفرات المفيدة قد تفوق بسرعة زملائهم. هنا نقدم إجراء بسيط لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا بكتيرية مع مرور الوقت باستخدام الأفراد المسمى fluorescently.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا تتكاثر بسرعة كبيرة والسكان قد تصل إلى كثافات الخلايا العالية. الكسور الصغيرة من الخلايا في السكان لديها دائما الطفرات المتراكمة التي هي إما ضارة أو مفيدة للخلية. إذا كان تأثير اللياقة البدنية للطفرة يوفر للزم السكان الفرعيين ميزة نمو انتقائية قوية ، فقد يتفوق أفراد هذه الاكتظاظ السكاني الفرعي بسرعة وحتى القضاء التام على زملائهم المباشرين. وهكذا، فإن التغيرات الجينية الصغيرة والتراكم القائم على الاختيار للخلايا التي اكتسبت طفرات مفيدة قد يؤدي إلى تحول كامل في النمط الجيني لخلايا المجموعة. هنا نقدم إجراء لرصد التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة الخلايا البكتيرية مع مرور الوقت عن طريق cocultivation من الأفراد المسمى فلوريا من البكتيريا نموذج إيجابي غرام عصيات subtilis. طريقة سهلة الأداء وتوضيحية جدا لعرض المنافسة داخل الأنواع بين الأفراد في مجموعة خلايا بكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعادة ما تكون بكتيريا التربة مزودة بشبكات تنظيمية مرنة وقدرات استقلابية واسعة. كلا الميزتين تمكن الخلايا لضبط مساراتها تقويضي والابتنائية للتنافس مع زملائهم والكائنات الحية الدقيقة الأخرى للمغذيات, التي تتوفر في مكانة بيئية معينة1. ومع ذلك ، إذا كانت البكتيريا غير قادرة على التكيف مع بيئتها آليات أخرى قد تفسر بقاء الأنواع. في الواقع، كما العديد من البكتيريا تتكاثر بسرعة والسكان يمكن أن تصل إلى كثافة الخلايا العالية التجمعات السكانية الفرعية قد تراكمت تلقائيا الطفرات المفيدة التي توفر للخلايا مع ميزة النمو الانتقائي، وبالتالي زيادة لياقتهم البدنية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن النقاط الساخنة الطفرة وطفرات التكيف الناجمة عن الإجهاد تسهيل تطور بكتيريا غير معدلة2،3. وهكذا، فإن تراكم الطفرات والنمو في ظل الاختيار المستمر هو أصل التنوع الميكروبي الهائل، حتى داخل نفس الجنس4،5. كما هو الحال في الطبيعة ، فإن تشكيل الجينوم البكتيري يحدث أيضا في المختبر بسبب الزراعة المستمرة قيد الاختيار. ويتجلى ذلك في تدجين البكتيريا الفرعية B. إيجابية الغرام، والتي تستخدم في جميع أنحاء العالم في البحوث الأساسية وفي الصناعة. في 1940s B. تم التعامل مع subtilis الحمض النووي الضارة الأشعة السينية تليها زراعة تحت شرط نمو محدد6. الطفرات التي تراكمت في البكتيريا خلال تدجينها مسؤولة عن فقدان العديد من خصائص النمو ، أي سلالة مختبر B. subtilis 168 فقدت القدرة على تشكيل مستعمرات معقدة7،8.

في الوقت الحاضر، لأفضل دراسة نموذج البكتيريا Escherichia القولونية وB. subtilis، مجموعة متنوعة من الأدوات القوية المتاحة للتلاعب وراثيا الجينوم من أجل معالجة مسائل علمية محددة. في بعض الأحيان يسبب تعطيل جين الفائدة عيبا حادا في النمو ، والذي يظهر بوضوح على متوسط النمو القياسي9. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما يتم تجاهل الطفرات التي تسبب عيبا ضعيفا في النمو وبالتالي تؤثر بشكل طفيف على لياقة السلالة. ومع ذلك ، في كلتا الحالتين الحضانة المطولة و passaging من سلالات متحولة لعدة أجيال وعادة ما يؤدي إلى تراكم المسوخ القامع التي استعادت النمط الظاهري للسلالة الأم2،9. إن توصيف المسوخ القامعة وتحديد الطفرات التي أعادت عيب نمو السلالة المتحولة الأم هو نهج مفيد للغاية يسمح بجلاء العمليات الخلوية الهامة والجديدة في كثير من الأحيان10،11.

نحن مهتمون في السيطرة على التوازن الغلوتامات في B. subtilis12. على غرار الإشريكية القولونية، يستجيب B. subtilis لاثارة الغلوتامات التوازن(أيكتلة في تدهور الغلوتامات2)من خلال تراكم المسوخ القامعة. وتبين أن التعديلات الجينومية في هذه المسوخ القامعة التي تم الحصول عليها عن طريق طفرة عفوية لاستعادة الغلوتامات التوازنبسرعة 9,13. لذلك ، ليس من المستغرب أن التكيف مع B. subtilis إلى حالة نمو محددة أثناء تدجين البكتيريا ينعكس في تخليق الإنزيم وفي الأنشطة الأنزيمية المتطورة ، والتي تشارك في استقلاب الغلوتامات12. وقد اقترح أن عدم وجود الغلوتامات الخارجية في المتوسط النمو خلال عملية التدجين كان القوة الدافعة لظهور تثبيت خفي الغلوتامات ديهيدروجيناز (GDH) gudBCR الجينات في سلالة المختبر 1682,14. ويدعم هذه الفرضية ملاحظتنا أن انخفاض كمية نشاط GDH في سلالة المختبر يوفر البكتيريا مع ميزة النمو الانتقائي عندما الغلوتامات الخارجية نادرة2. وعلاوة على ذلك، فإن زراعة سلالة B. subtilis، توليف GDH GudB، في غياب الغلوتامات الخارجية يؤدي إلى تراكم المسوخ القامعة التي أدت إلى تعطيل الجين gudB 2. من الواضح أن وجود GDH نشط تقويضيا غير مؤات للخلية لأن الغلوتامات المنتجة داخليا التي يمكن استخدامها لولا ذلك للتأيض تتحلل إلى الأمونيوم و 2-oxoglutarate (الشكل 1). وعلى النقيض من ذلك، عندما يتم توفير الغلوتامات عن طريق الوسط، فإن سلالة B. subtilis المجهزة بنشاط GDH عالي المستوى لها ميزة نمو انتقائية على سلالة تجمع GDH وظيفية واحدة فقط. من المعقول افتراض أن نشاط GDH عالي المستوى يسمح للبكتيريا باستخدام الغلوتامات كمصدر كربون ثان بالإضافة إلى مصادر الكربون الأخرى التي يوفرها الوسيط2 (انظر الشكل 1). وبالتالي، يؤثر نشاط GDH بقوة على لياقة البكتيريا، اعتمادا على توافر الغلوتامات الخارجية.

هنا نقدم طريقة توضيحية جدا لرصد وتصور المنافسة داخل الأنواع بين اثنين من سلالات subtilis B. التي تختلف في مكان واحد على الكروموسوم(الشكل 2). وصفت سلالات اثنين مع الجينات yfp وcfp ترميز YFP الفلوروفوريس وCFP، و cocultivated في ظل ظروف غذائية مختلفة. عن طريق أخذ العينات مع مرور الوقت والطلاء المخففات المناسبة على لوحات أجار يمكن رصد الناجين في كل من الثقافات بسهولة باستخدام المجهر مضان ستيريو المشتركة. الإجراء الموصوف في هذه الورقة سهل الأداء ومناسب لتصور التوسع اللاستنساخي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة ، على التوالي ، في مجموعة خلايا بمرور الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد لوحات أجار، وسائل الإعلام الثقافية، Cryostocks، والثقافات المسبقة

  1. إعداد وسائط النمو والكواشف المطلوبة (انظر جدول المواد والكواشف).
  2. خط سلالات B. subtilis (على سبيل المثال. BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP52 (rocG+ gudB+ amyE::PgudB-cfp) معبرا عن واحد واثنين من GDHs النشطة ، على التوالي) 2 التي سيتم استخدامها في تجربة المنافسة على لوحات أجار متوسطة SP للحصول علىمستعمرات واحدة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 °C.
  3. خذ مستعمرات واحدة وأنابيب زراعة معقمة تلقيح تحتوي على 4 مل LB السائل المتوسط. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
  4. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية لتجنب أن الخلايا lyse أو sporulate.
  5. قياس الكثافة البصرية للثقافات على طول موجي من 600 نانومتر (OD600)باستخدام مطياف قياسي.
  6. إذا كانت الثقافات قد وصلت إلى OD600 من 2.0, مزيج 0.75 مل من الثقافات مع 0.75 مل من محلول الجلسرين 50٪ معقمة في أنابيب رد الفعل 1.5 مل. يجب أن يكون OD600 النهائي 1.0 للحصول على cryostocks تحتوي على حوالي 108 خلايا / مل.
  7. تخزين الأنابيب في -80 درجة مئوية.
  8. جعل ثلاثة ثقافات مسبقة من كل سلالة وصفت مع cfp وyfp ترميز جينات الفلوروفور. تلقيح الثقافات المسبقة (أنابيب زراعة معقمة تحتوي على 4 مل LB السائل المتوسط) مع 1 ميكرولتر من خلايا التبريد -80 درجة مئوية. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.

2. Cocultivation من البكتيريا، وجمع العينات، وتخزين العينات

  1. إعداد طازجة 100 مل C-Glc و CE-Glc الحد الأدنى المتوسط (انظر الجدول من الكواشف والمواد), ونقل 20 مل من كل وسيط في العقيمة 100 مل يهز قوارير.
  2. خذ 0.1 مل من الثقافات المسبقة التي نمت بين عشية وضحاها، وتمييعها مع 0.9 مل LB المتوسطة في cuvette 1.5 مل، وتحديد OD600.
  3. لتجربة المنافسة، خذ تلك الثقافات المسبقة من السلالات المختلفة التي لديها OD600 مماثلة بين 1.0-1.5.
  4. للحصول على مجموعات الخلايا المختلطة، تمييع خلايا الثقافات المسبقة التي كان OD600 المناسبة إلى OD600 من 0.05 في 20 مل C-Glc و CE-Glc الحد الأدنى المتوسط تكملها في 100 مل يهز قوارير. لتجربة المنافسة يجب أن تكون مختلطة بين سلالة اثنين في نسبة 1:1.
  5. خذ عينات 10 مل من القوارير، ونقلها إلى أنابيب بلاستيكية 15 مل، وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 4000 × غرام في جهاز طرد مركزي أعلى الجدول القياسي، والتخلص من supernatant.
  6. Resuspend الخلايا في 0.5 مل من المتوسطة LB الطازجة, ونقل الخلايا إلى معقمة 1.5 مل كوب رد الفعل. إضافة 0.5 مل من 50٪ الجلسيرول العقيمة, خلط تعليق دوامة صارمة, وتخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية حتى مزيد من العلاج.
  7. احتضان الخلايا التي تترك في قوارير اهتزاز لمدة تصل إلى 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة. الحفاظ على قوارير يهز في الظلام لمنع تبييض الصور من الفلوروفوريس.
  8. خذ عينات أخرى من 0.1 مل بعد 7 ساعات و 24 ساعة من النمو. قياس وملاحظة OD600 من 1:10 التخفيف (في C-Glc أو CE-Glc الحد الأدنى المتوسط) من العينات.
  9. خذ الكمية المناسبة من الخلايا من كل ثقافة لجعل cryostocks التي لديها OD600 من 1.0. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من العلاج.

3. عينة العلاج، والطلاء، واحتضان للتحليلات الكمية

  1. بعد جمع جميع العينات، إذابة المبردات، وتمييع الخلايا في محلول ملحي 0.9٪ (انظر جدول الكواشف والمواد) تصل إلى10-3.
  2. لوحة 0.1 مل من تخفيف10-3 على لوحات أجار متوسطة SP وتوزيع الخلايا باستخدام ماصة الزجاج العقيم.
  3. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الظلام حتى ظهرت مستعمرات واحدة.

4. عد الناجين من قبل مجسم مضان المجهر للتحليل الكمي

  1. تقسيم الجزء السفلي من لوحة أجار مع قلم أسود في أربعة أجزاء للحصول على اتجاه أفضل في حين عد الناجين تحت المجهر مضان ستيريو.
  2. ضع اللوحة رأسا على عقب تحت المجهر واجلب المستعمرات إلى التركيز باستخدام مصدر الضوء البارد.
  3. مرة واحدة في المستعمرات هي في التركيز، والتحول إلى مجموعة مرشح المناسبة لCFP لتصور الخلايا المتبقية من سلالة cfpالمسمى. عد الناجين من هذه السلالة عن طريق وضع علامة على المستعمرات بقلم وملاحظة الرقم.
  4. إزالة التسميات مع الإيثانول والتحول إلى مرشح YFP تعيين لتصور الخلايا المتبقية من سلالة yfpالمسمى. عد الناجين مرة أخرى عن طريق وضع علامة على المستعمرات بقلم وملاحظة الرقم.

5. عينة العلاج والتنظير المجهري للتحليلات شبه الكمي

  1. للاطلاع على الأرقام التوضيحية، بقعة 10 ميكرولتر من تخفيف10-4 (حوالي 100 خلية) من الخطوة 3.1 على لوحة أجار SP (انظر الشكل 3).
  2. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الظلام حتى ظهرت مستعمرات واحدة.
  3. ضع طبق بيتري دون غطاء تحت المجهر واجلب البقعة إلى التركيز باستخدام مصدر الضوء البارد.
  4. التقاط صور للبقع لشخصيات توضيحية. اختيار وقت التعرض المناسب لالتقاط صور المستعمرات مع مصدر الضوء البارد.
  5. دون تحريك لوحة، وتغيير إلى مجموعة مرشح CFP، وضبط وقت التعرض واتخاذ صورة. افعل الشيء نفسه مع مجموعة فلتر YFP وحفظ الصور لإجراء مزيد من التحليلات.

6. تحليل البيانات

  1. استخدام برامج مثل Excel لتحليل البيانات الكمية. استنادا إلى المستعمرات التي تم عدها، احسب النسبة المئوية للمستعمرات الصفراء والزرقاء فيما يتعلق بعدد المستعمرات بالكامل، والتي تم تعيينها إلى 100٪.
  2. استخدم الأرقام المحسوبة لإنشاء مخطط شريطي مكدس (انظر الشكل 4 والشكل 5). استخدم برنامج معالجة الصور مثل Adobe Photoshop لإنشاء صور مدمجة للصور الملتقطة من مواقع مختلفة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام برنامج ImageJ المتاح مجانا ، القابل للتنزيل من http://rsbweb.nih.gov/ij/ لمعالجة الصور.
  3. افتح الصور من بقعة واحدة تم التقاطها باستخدام مجموعة فلتر CFP ومجموعة مرشح YFP. تحسين التباين والسطوع للحد من أي مضان الخلفية من وسائل الإعلام.
  4. انتقل إلى إحدى الصور وحدد الكل. نسخ الصورة ولصقها على الصورة الأخرى.
  5. إما استخدام وظيفة "دودج اللون" لدمج الصور أو تراكب الصور الفلورية باستخدام علامة التبويب القنوات. الصور المدمجة للمستعمرات من وسائل الإعلام المختلفة ونقاط زمنية مختلفة تمثل نمو سلالات مختلفة داخل الثقافة السائلة.

7. نصائح محددة: صبغ التبديل التجربة و Cocultivation من سلالات Isogenic المسمى مع cfp وyfp

التعبير عن أي من اثنين من الجينات ترميز الفلوروفوري في B. subtilis قد تؤثر على اللياقة البدنية، وبالتالي معدل نمو البكتيريا. لذلك ، يوصى بإجراء التجارب التالية لاستبعاد أن القضاء على سلالة منافس واحد من مجموعة الخلايا أثناء الزراعة يرجع ببساطة إلى تأثير سلبي للفلوروفور:

  1. كرر التجربة بأكملها و cocultivate سلالات وصفت عكسيا(على سبيل المثال، في وقت سابق cfpالمسمى سلالة الآن مع الجين yfp والعكس بالعكس). وعلى الرغم من عكس ذلك، ينبغي أن تكون النتائج التي تم الحصول عليها مماثلة للملاحظة السابقة بأن إحدى السلالات تتمتع بميزة نمو انتقائية على السلالة الأخرى.
  2. كرر التجربة بأكملها وسلالات cocultivate isogenic المسمى مع yfp وcfp (على سبيل المثال BP40 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-yfp) و BP41 (rocG+ gudBCR amyE::PgudB-cfp)). تقدير التأثير السلبي لأي من الفلوروفوريس اثنين على اللياقة البدنية للبكتيريا باتباع تكوين السكان الخلية مع مرور الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق الطريقة الموصوفة هنا بنجاح لتصور المنافسة داخل الأنواع في مجموعة خلايا تتكون من سلالات B. subtilis التي تم تصنيفها بجينات cfp و yfp لترميز الفلوروفوريس CFP و YFP ، على التوالي. كما هو مبين في الشكل 3، يمكن استخدام هذه الطريقة لتصور المنافسة داخل الأنواع بطريقة توضيحية للغاية. من خلال اكتشاف العينات على مناطق صغيرة ، تم جعل التكوين اللاستنساخي تجمعات الخلايا مرئيا في لمحة. وعلى الرغم من أن هذا النهج غير مناسب للتحليلات الكمية، إلا أنه مفيد لتقدير تأثير معلمات النمو المخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت عدة طرق لتحليل اللياقة التنافسية للبكتيريا16. في كثير من الحالات وصفت البكتيريا مع أشرطة مقاومة المضادات الحيوية المختلفة17. على غرار نهجنا ، فإن وضع العلامات على الخلايا باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيوية يسمح بتقييم اللياقة التنافسية للبكتيريا أثناء cocultivation في ظل ظروف نمو محددة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد اللياقة التنافسية للخلايا التي تختلف عن بعضها البعض في مكان معين على الكروموسوم17. ومع ذلك، هناك بعض العيوب باستخدام أشرطة مقاومة المضادات الحيو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم العمل في مختبر المؤلفين دويتشه فرانشونجسجيمينشافت (http://www.dfg.de؛ CO 1139/1-1)، ومؤسسة دير شيمشين للصناعات (http://www.vci.de/fonds)، ومركز غوتنغن للبيولوجيا الجزيئية (GZMB). ويود المؤلفون أن يعترفوا بيورغ ستولكي لتعليقاته المفيدة وقراءة المخطوطة النقدية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

lb متوسط < / قوي >الخميرةالصوديوم LB غلوتاماتL-Glutamic50٪

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(NH4)2SO4 روث ، ألمانيا3746
أجارديفكو ، الولايات المتحدة الأمريكية214010
سترات الحديديك الأمونيوم (CAF)سيجما ألدريتش ، ألمانيا9714
CaCl2  < / sub>Roth ، ألمانيا5239
GlucoseApplicem ، ألمانياA3617
GlycerolRoth ، ألمانيا4043
K2< / sub>HPO4< / sub>& bull ؛ 3H2ORoth, Germany6878
KClApplichem, GermanyA3582
KH2PO4Roth, Germany3904
KOHRoth, Germany6751
MgSO4& bull; 7H2O Roth, GermanyP027
MnCl2 روث ، ألمانياT881
MnSO4< / sub>& bull ؛ 4H2< / sub>OMerck Millipore ، ألمانيا102786
NaClRoth ، ألمانيا9265
مرق المغذياتRoth ، ألمانياX929
غلوتامات البوتاسيومApplicem ، ألمانياA3712
TryptoneRoth ، ألمانيا8952
TryptophanApplichem ، ألمانياA3445
مستخلص الخميرةروث ، ألمانيا2363
1.5 مل أنابيب التفاعلSarstedt ، ألمانيا72،690،001
2.0 مل أنابيب التفاعلSarstedt ، ألمانيا72،691
15 مل أنابيب بلاستيكية مع غطاء لولبيSarstedt ، ألمانيا62،554،001
أطباق PetriSarstedt ، ألمانيا82.1473
1.5 مل من البوليسترين كوفيتSarstedt ، ألمانيا67،742
15 مل أنابيب زراعة زجاجية   ؛العلامة التجارية, ألمانيا7790 22
100 مل قوارير رج مع أغطية من الألومنيومالعلامة التجارية, ألمانيا928 24
ماصات زجاجية معقمة 10 ملالعلامة التجارية, ألمانيا278 23
حاضنة (28 و 37 درجة ; ج)مجموعة الماصات القياسية New BrunswickM1282-0012
(2-20 & mu; ل, 10-100 & لتر ، 100-1,000 مو ؛ ل)Eppendorf ، ألمانيا4910 000.034 ، 4910 000.042 ،
جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لأنابيب تفاعل 1.5 و 2 ملThermo Scientific ، Heraeus Fresco 21 ، ألمانيا75002425
جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة لأنابيب بلاستيكية سعة 15 ملHeraeus Biofuge Primo R ، ألمانيا75005440
مقياس الطيف الضوئي القياسيAmersham Biosciences Ultrospec 2100 pro ، ألمانيا80-2112-21
المجهر التجسيم Zeiss SteREO Lumar V12 ، ألمانيا495008-0009-000
فريزر (-20 و -80 درجة ؛ ج)-
ثلاجة (4 درجة ؛ C)-
الأوتوكلافZirbus ، LTA 2x3x4 ، ألمانيا-
مقياس الأسالهيدروجيني 766 ، Calimatic ، Nick ، ألمانيا766
VortexVortex 3 ، IKA ، ألمانيا3340000
BalanceCP2202S ، Sartorius ، ألمانياتم استبدالها بقلم
أسود (علامة دائمة)Staedler ، ألمانيا317-9
برنامج Powerpointمايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكية-
برنامج Excel، مايكروسوفت ، الولايات المتحدة الأمريكية-برنامج لمعالجة البيانات
Adobe Photoshop CS5Adobe ، الولايات المتحدة الأمريكيةاستبداله ب CS6 ، تنزيلبرنامج الكمبيوتر لمعالجة الصور
الكمبيوترالشخصي أوMac-ZEN
pro 2011 برنامج المجهرالتجسيميزايس ، ألمانيا410135 1002 110AxioCam MRc Rev. تم الحصول عليها من خلال Zeiss
وصفات محلول محددة< / strong>
SP متوسط< / قوي>
8 جم مرق
0.25 مجم MgSO4< / sub>& bull ؛ 7H2O
1 جم KCl
15 جم أجار لوسطالصلب إذا لزم الأمر
أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف H2Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
1 مل CaCl 2< / sub > (0.5 M) ، معقم بالترشيح
1 مل MnCl 2< / sub > (10 م) ، معقم بالترشيح
2 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح
10 جم تربتون
5 جم مستخلص
10 جم كلوريد
15 جم أجار لوسطالصلب إذا لزم الأمر
أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف H2< / sub>Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
<قوي>C-Glc الحد الأدنى من المتوسط< / قوي
>200 مل 5 × C أملاح
10 مل L-Tryptophan (5 مجم / مل) ، معقم بالترشيح
10 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح
10 مل III 'أملاح
25 مل جلوكوز (20٪)تعقيم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
أضف 1 لتر مع H2< / sub>O
CE-Glc الحد الأدنى المتوسط < / قوي
>200 مل 5 × C أملاح
10 مل L-Tryptophan (5 مجم / مل) ، معقم بالترشيح
10 مل سترات الحديديك الأمونيوم (CAF ، 2.2 مجم / مل) ، معقم بالترشيح
10 مل III’ أملاح
20 مل غلوتامات (40٪)
25 مل جلوكوز (20٪) ، معقمة لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
أضف 1 لتر مع أملاح H2< / sub>O
5 × C أملاح   ؛
20 جم KH2PO4
80 g K2HPO4• 3H2O
16.5 g (NH4)2SO4
add 1 L مع الأوتوكلاف H2Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة; C
III' أملاح
0.232 جم MnSO4& bull; 4H2O
12.3 g MgSO4& bull; 7H2< / sub>O
إضافة 1 لتر مع H2< / فرعي >O ، الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
40٪ محلول
200 جم حمض
اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 عن طريق إضافة ما يقرب من 80 جم KOH
أضف 0.5 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
<قوي>0.9٪ محلول ملحي (كلوريد الصوديوم) < / قوي >
أضف 1 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
محلول الجلسرين
295 مل الجلسرين (87٪)
أضف 0.5 لتر مع الأوتوكلاف المعقم H2< / sub>Oلمدة 20 دقيقة عند 121 درجة ؛ C
البكتيريا (تعتمد جميع السلالات على سلالة Bacillus subtilis< / em> سلالة 168)
Bacillus subtilis< em> BP40 (rocG+< / sup> gudBCR amyE: :P gudB-yfp)  مختبر سلالة جمع
<م > العصيات الرقيقة < م > BP41 (rocG < sup> + < / sup> gudB CR < / sup> amyE: :P gudB-cfp)   ؛
Bacillus subtilis< / em> BP52 (rocG+< / sup> gudB+< / sup> amyE: :P gudB-cfp)
Bacillus subtilis< / em> BP156 (rocG+ gudB+ amyE: :P gudB-yfp)
المغذيات SP < td colspan = "4" >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buescher, F. I., et al. Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science. 335, 1099-1103 (2012).
  2. Gunka, K., Stannek, L., Care, R. A., Commichau, F. M. Selection-driven accumulation of suppressor mutants in Bacillus subtilis: the apparent high mutation frequency of the cryptic gudB gene and the rapid clonal expansion of gudB+ suppressors are due to growth under selection. PLoS One. 8, (2013).
  3. Al Mamum, A. A. M., et al. Identity and function of a large gene network underlying mutagenic repair of DNA breaks. Science. 338, 1344-1348 (2012).
  4. Koeppel, A. F., Wertheim, J. O., Barone, L., Gentile, N., Krizanc, D., Cohan, F. M. Speedy speciation in a bacterial microcosm: new species can arise as frequently as adaptations within a species. ISME J. 7, 1080-1091 (2013).
  5. Maughan, H., Nicholson, W. L. Increased fitness and alteration of metabolic pathways during Bacillus subtilis evolution in the laboratory. Appl. Environ. Microbiol. 77, 4105-4118 (2011).
  6. Burkholder, P. R., Giles, N. H. Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis. Am. J. Bot. 34, 345-348 (1947).
  7. McLoon, A. L., Guttenplan, S. B., Kearns, D. B., Kolter, R., Losick, R. Tracing the domestication of a biofilm-forming bacterium. J. Bacteriol. 193, 2027-2034 (2011).
  8. Zeigler, D. R., et al. The origins of 168, W23, and other Bacillus subtilis legacy strains. J. Bacteriol. 190, 6983-6995 (2008).
  9. Gunka, K., Tholen, S., Gerwig, J., Herzberg, C., Stülke, J., Commichau, F. M. A high-frequency mutation in Bacillus subtilis: requirements for the decryptification of the gudB glutamate dehydrogenase. 194, 1036-1044 (2012).
  10. Commichau, F. M., et al. Characterization of Bacillus subtilis mutants with carbon source-independent glutamate biosynthesis. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 12, 106-113 (2007).
  11. Beckwith, J. Genetic suppressors and recovery of repressed biochemical memory. J. Biol. Chem. 284, 12585-12592 (2009).
  12. Gunka, K., Commichau, F. M. Control of glutamate homeostasis in Bacillus subtilis: a complex interplay between ammonium assimilation, glutamate biosynthesis and degradation. Mol. Microbiol. 85, 213-224 (2012).
  13. Yan, D. Protection of the glutamate pool concentrations in enteric bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 9475-9480 (2007).
  14. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. Role and regulation of Bacillus subtilis glutamate dehydrogenase genes. J. Bacteriol. 180, 6298-6305 (1998).
  15. Commichau, F. M., Herzberg, C., Tripal, P., Valerius, O., Stülke, J. A regulatory protein-protein interaction governs glutamate biosynthesis in Bacillus subtilis: the glutamate dehydrogenase RocG moonlights in controlling the transcription factor GltC. Mol. Microbiol. 65, 642-654 (2007).
  16. Gordo, I., Perfeito, L., Sousa, A. Fitness effects of mutations in bacteria. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 21, 20-35 (2011).
  17. Rabatinová, A., et al. The δ subunit of RNA polymerase is required for rapid changes in gene expression and competitive fitness of the cell. J. Bacteriol. 195, 2603-2611 (2013).
  18. Capra, E. J., Perchuk, B. S., Skerker, J. M., Laub, M. T. Adaptive mutations that prevent crosstalk enable the expansion of paralogous signalling protein families. Cell. 150, 222-232 (2012).
  19. García-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (15), (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Bacillus subtilis

مقالات ذات صلة