نقدم توليف هيدروجيل تقسيم بوساطة intein البروتين. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من بوليمرات البروتين تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. خلط اثنين من بوليمرات بروتين يطلق رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هو غاية هيدروجيل درجة الحموضة ودرجة الحرارة مستقرة، ومتوافقة مع المذيبات العضوية، ويشتمل على البروتينات الكروية بسهولة وظيفية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التوليف من البروتين الاصطناعي Intein بوساطة هيدروجيل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقدم تخليق البروتين هيدروجيل درجة عالية من الاستقرار بوساطة تقسيم المحفزة intein البروتين رد فعل عبر الربط. اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل نوعان من البروتين كتلة بوليمرات تحتوي كل منها على حدة فرعية من البروتين مثلوثي التي هي بمثابة crosslinker ونصف من intein الانقسام. يتم إدخال اللولب عشوائي ماء غاية في واحدة من كتلة بوليمرات لاحتباس الماء. خلط اثنين من بوليمرات كتلة البروتين يؤدي رد فعل عبر الربط intein، مما أسفر عن وحدة ببتيد مع crosslinkers إما في نهاية بسرعة أن تتحول ذاتيا إلى هيدروجيل. هذا هيدروجيل مستقرة جدا في ظل الظروف الحمضية والأساسية على حد سواء، في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية، وفي المذيبات العضوية. هيدروجيل بسرعة بعد الإصلاحات التي يسببها تمزق القص. إدماج "الالتحام محطة الببتيد" في لبنة هيدروجيل تمكن من إدماج مريحة "بروتين الالتحام" الموسومة البروتينات المستهدفة.هيدروجيل متوافق مع وسائل الاعلام نمو زراعة الأنسجة، ويدعم نشر 20 كيلو دالتون جزيئات، وتمكن من تجميد البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا. وقد تجلى تطبيق هيدروجيل البروتين بوساطة intein-بمثابة حفاز بيولوجي العضوية المذيبات متوافق عن طريق التغليف أنزيم البيروكسيداز الفجل ومؤيدة نشاطها.
المقدمة
الهلاميات المائية مصنوع بالكامل من البروتينات تنطوي على إمكانية لتحقيق تقدم كبير حقول متنوعة مثل هندسة الأنسجة، والتسليم المخدرات وbiofabrication 1. أنها توفر مزايا أكثر من الهلاميات المائية الاصطناعية البوليمر التقليدية بما في ذلك توافق مع الحياة والقدرة على دعم noninvasively إدراج البروتينات الكروية النشطة بيولوجيا.
في هذا العمل، ونحن تصف وضع هيدروجيل البروتين الرواية شكلت عن طريق تقسيم بوساطة intein البروتين عبر الربط رد الفعل وتطبيقه كما سقالة البروتين الشلل (الشكل 1). اللبنات الأساسية لهذا هيدروجيل هما البروتين كتلة بوليمرات يت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. البلازميد البناء
ملاحظة: تم تضخيم كل الجينات في إطار تفاعلات PCR باستخدام معيار Phusion عالية الدقة البلمرة DNA فقا للمواصفات الشركة المصنعة. وقد وصفت الاشعال المستخدمة في الاستنساخ في السابق 9. يتم سرد كافة بنيات في الجدول 1.
- لتوليد CutA-NpuN (N، الجدول 1):
- PCR تضخيم CutA وNpuN الجينات من البلازميدات pET30-CutA-Tip1 10 و Kan....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد التخطيطي للتوسط intein-تكوين البروتين هيدروجيل في الشكل 1A. لبنات بناء هيدروجيل هي البروتين الاسهامية CutA-NpuN (N) وNpuC-S-CutA (C) (الشكل 1A، الجدول 1). NpuN / C هي N-/C-fragments من DnaE تقسيم طبيعي intein من نوستوك punctiforme (NPU). CutA هو بروتين مثلوثي مستقرة من Pyrococcus horikoshii 4،5. اختلاط المنقى N و C في وجود عامل مختزل DTT الحث على تشكيل البروتين الثالث - المنتج ligated (J: CutA-S-CutA) (أرقام 1A
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا العمل، أثبتنا تركيب مستقر للغاية بوساطة intein البروتين هيدروجيل. استخدام انقسام تمكن intein هيدروجيل التي سيتم تشكيلها مشروط في استجابة لخلط اثنين من مكونات السائل المرحلة. على وجه التحديد، وانقسام يربط intein تساهميا اثنين من اللبنات السائل المرحلة عن طريق تفاعل عبر الربط، مما أسفر عن وحدة ببتيد يحيط بها وحدات يشابك هذا بدوره بتجميع الذاتي في هيدروجيل. تشكيل الناجم عن اختلاط هيدروجيل يتجاوز الصعوبات التقنية في تركيب مكون واحد الهلاميات المائية البروتين حيث يمكن أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا توجد المصالح المالية المتنافسة.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه الدكتور ديفيد Tirrell (كالتك) لله هدية نوع من البلازميد pQE9 AC 10 Atrp 12، والدكتور توم موير (جامعة برينستون) لله هدية نوع من البلازميد KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11، الدكتور تاكيهيسا ماتسودا (معهد كانازاوا للتكنولوجيا، Hakusan، إيشيكاوا، اليابان) لله هدية نوع من البلازميد pET30-CutA-Tip1 10، والدكتور جاي D. كسيلينغ (UC بيركلي) لله هدية نوع من البلازميد pJD757 13 . وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم المهنية، الولايات المتحدة القوات الجوية بييب ونورمان هاكمان برنامج البحوث المتقدمة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| < ص > فوسيون بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة < / ص > | نيو إنجلاند بيولابيس | < ص > M0530S < / ص > | < ص >< / ص |
| > < ص> المختص <م > الإشريكية القولونية < / م > BL21 (DE3) < / ص > | نيو إنجلاند بيولابيس | < > C2527I < / ص > | < ص >< / ص |
| > < ص > لوريا بيرتاني < / ص > | VWR | < ص > 90003-350 < ص> | |
| Bacto Agar Media | VWR | ||
Kanamycin sulfate | VWR | ||
| > IPTG | VWR | p>EM-5820 | |
| Imidazole | VWR | p>EM-5720 | < ص >< / ص > |
| Urea< / p> | VWR | p>EM-9510< / p> | < / p> |
| Dithiothreitol (DTT)< / p> | Fisher | BP172-5< / p> | < / p> |
| كوكتيل مثبط للبروتياز < / p> | Roche Applied | Science 11836153001< / p> | < / p> |
| DPBS< / p> | VWR | p>82020-066< / p> | < / p> |
| Brilliant Blue R< / p> | Acros Organics | A0297990< / p> | < / p> |
| Sodium Azide< / p> | Fisher | AC190380050< p> | الحذر، شديد السمية < / ص > |
| < ص > بيروكسيداز الفجل < / ص > | سيجما | < ص > P8125-5KU < / p > | < p >< / p > |
| < p > N ، N-dimethyl- p < / em > فينيلين ديامين < / p > | فيشر | < ص >AC408460250< / ص > | < ص > الحذر ، شديد السمية < / ص > |
| < ص > فينول < / ص > | فيشر | < ص >AC149340500< / ص > | < ص > الحذر ، شديد السمية < / ص > |
| < ص > ثلاثي بوتيل هيدروبيروكسيد < / ص > | فيشر | < ص >AC180340050< / ص > | < ص > الحذر ، شديد السمية < / ص |
| > < ص > n-heptane < / p > | Acros Organics | < p >120340010< / p > | < p> < / ص > |
| < p > شاكر / حاضنة < / ص > | فيشر العلمي | < ص > ماكس س 6000 < / ص > | < ص >< / ص > |
| < ص> الطرد المركزي < / ص > | سورفال | < ص > RC 6< / ص | > < ص >< / ص > |
| < ص > سونيكاتور < / ص > | كيو سونيكا | < ص > ميسونيكس 200 < / ص > | < ص >< / ص > |
| < ص>أنابيب الترشيح الفائق< / ع> | أميكون الترا | < ص >UFC903024< / ص > | < ص >< / ص > |
| < ص > nbsp ؛ عمود HisTrap عالي الأداء Ni Sepharose < / p > | Healthcare Life | Sciences < p > 17-5248-01 < / p > | < p >< / p |
| > < p >HiTrap SP Sepharose FF عمود التبادل الأيوني < / p > | GE Healthcare Life | Sciences < p> 17-5156-01 < / p > | < p >< / p |
| > < p > قارئ اللوحة < / p > | الأجهزة الجزيئية | < ص > SpectraMax Gemini EM < / p> | < ص >< / ص > |
المراجع
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
