قياس التغيرات في حساسية اللمس في المخلب الخلفي للفئران باستخدام جهاز فون فراي الإلكتروني

ملخص

تعد قياسات فون فراي الإلكترونية بديلا فعالا ومحسنا لخيوط فون فراي الكلاسيكية ، لأنها تسمح بقياس سريع ودقيق للتغيرات في عتبات الانسحاب الميكانيكي للقوارض لمحفزات الضغط المطبقة باستمرار قبل وبعد حدث التهابي.

الملخص

يعد قياس التغيرات الناجمة عن الالتهاب في عتبات انسحاب المخلب الخلفي من الضغط الميكانيكي أسلوبا مفيدا لتقييم التغيرات في إدراك الألم في القوارض. يمكن قياس عتبات الانسحاب أولا عند خط الأساس ثم بعد الدواء أو السم أو الإصابة أو مسببات الحساسية أو الالتهاب المستحث عن طريق تطبيق قوة دقيقة على مناطق محددة جدا من الجلد. يسمح جهاز فون فراي الإلكتروني بتقييم دقيق لعتبات انسحاب مخلب الخلفي للفأر التي لا تقتصر على أحجام الخيوط المتاحة على عكس قياسات فون فراي الكلاسيكية. تسمح سهولة وسرعة القياسات بدمج تقييم نتائج الحساسية اللمسية في نماذج متنوعة من الألم الالتهابي والأعصاب سريع الظهور حيث يمكن إجراء قياسات متعددة في غضون فترة زمنية قصيرة. يمكن التحكم في القياسات التجريبية لموضوعات القوارض الفردية داخليا مقابل استجابات خط الأساس الفردية ومعايير الاستبعاد التي يتم وضعها بسهولة لتوحيد استجابات خط الأساس داخل المجموعات التجريبية وعبرها. وبالتالي ، فإن القياسات التي تستخدم جهاز فون فراي الإلكتروني تمثل تعديلا مفيدا للمقايسات الكلاسيكية الراسخة القائمة على خيوط فون فراي للقوارض الميكانيكية التي يمكن تطبيقها أيضا على نماذج الثدييات غير البشرية الأخرى.

المقدمة

الأمراض المزمنة غير السارية مسؤولة عن حصة غير متناسبة من الأعباء البشرية للوفيات والمراضة¹. يتم التعرف على الألم المزمن بشكل متزايد كعنصر مهم في العبء العالمي للمرض². وقد وفر هذا زخما كبيرا للابتكارات في الوقاية من الألم وإدارته وعلاجه. في الوقت نفسه ، هناك أدلة وفيرة على أن البيولوجيا الأساسية للألم معقدة³. تشير الآليات الكامنة وراء الألم الوقائي وكذلك الألم غير القابل للتكيف والمزمن إلى تفاعل معقد بين الجهاز المناعي والجهاز العصبي^3،4. يتطلب توضيح هذه الآليات مناهج تجريبية كمية صارمة وقابلة للتكرار من التشريح الجزيئي إلى التحليل السلوكي.

كانت نماذج القوارض لا تقدر بثمن في توصيف اللاعبين الجزيئيين للألم الالتهابي والاعتلال العصبي⁵. يتم استخدام تقليل الوقت والشدة للاستجابات المحددة مسبقا للمنبهات الضارة لقياس حالات الألم في هذه حيث لا تستطيع القوارض الإبلاغ عن الإحساس بالألم⁶. تستخدم الاستجابات المتغيرة لدرجة الحرارة والضغط بشكل شائع كمقاييس لحساسية الأنسجة في نماذج القوارض من الألم الالتهابي الذي يمكن أن يكون ناتجا عن العدوى^7،8 ، والتعرض الكيميائي^{6 ، 9،10} ، والشق^{الجراحي 11} ، وكذلك ألم الاعتلال العصبي الناجم عن ربط الأعصاب¹².

غالبا ما يتم قياس >jove_content<الحساسية الميكانيكية ، أو الاستجابة لمنبهات الضغط ، باستخدام خيوط فون فراي الكلاسيكية (CvF) - سلسلة (على سبيل المثال 0.4-15 جم¹³) من الأطراف الموزونة المطبقة يدويا لاختبار الأنسجة بزيادات تسلسلية حتى يتم تحفيز سلوكيات الألم في الضوابط مقابل الأشخاص التجريبيين. هناك طرق مختلفة لاستخدام هذه النصائح أو الشعر لتقييم الحساسية الميكانيكية^6،13; الطريقة الأكثر استخداما هي كما يلي. نصيحة بضغط معين (داخل السلسلة ؛ على سبيل المثال ، 2 ز¹³) كنقطة انطلاق ، ويتم تحديد عتبة انسحاب الفئران أو الفأر بنسبة 50٪ (شدة التحفيز المطلوبة لإنتاج استجابة 50٪ من المرات التي يتم فيها تطبيق الطرف على الأنسجة) عن طريق التحرك لأعلى ولأسفل في وزن الطرف بناء على عرض سلوكيات الاستجابة المحددة^{مسبقا 13}. ثم تتم مقارنة عتبات الانسحاب المطلقة بنسبة 50٪ لمجموعات العلاج بين النقاط الزمنية الأساسية وما بعد العلاج. هذه التقنية اليدوية تستغرق وقتا طويلا. بالإضافة إلى زيادة الوقت الذي يقضيه كل موضوع محبوس في غرفة فون فراي ، فإن هذا يزيد أيضا من عدد المرات التي يتم فيها تطبيق أطراف الاختبار ذات الأوزان المختلفة على الأنسجة الملتهبة مما يتسبب في إزعاج أكبر للقوارض في الدراسة. علاوة على ذلك ، يتم حساب عتبات السحب بنسبة 50٪ ومقارنتها بين مجموعات القوارض. عادة لا يتم تطبيع الاستجابات الفردية للموضوعات التجريبية مع استجاباتهم الأساسية الفردية غير المعالجة ، على حد علمنا ، استثناء واحد⁶. نتيجة لذلك ، لا يتم الإبلاغ عادة عن موضوعات القوارض على أنها مخصصة لمجموعات العلاج على أساس استجابات خط الأساس المتسقة ضمن نطاق محدد مسبقا ولا يتم تقييم الأشخاص الفرديين على أساس مجموعة مطبقة باستمرار من معايير الاستبعاد التي تسمح بتوحيد استجابات خط الأساس لأي مجموعة معينة من الدراسات والمقايسات.

هنا ، نقدم طريقة بديلة لقياس حساسية اللمس لمخلب الفأر الخلفي بعد التعرض لسم Bothrops jararaca باستخدام جهاز فون فراي الإلكتروني (EvF). كان كونها وزملاؤه⁶ رائدين في استخدام تقنيات EvF في القوارض وقارنوا بشكل منهجي فعالية CvF و EvF لإثبات أن EvF يوفر مقياسا "أكثر حساسية وموضوعية وكمية" لحساسية اللمس في نماذج القوارض للألم الالتهابي. باختصار ، في قياسات EvF ، يتم إرفاق طرف بولي بروبيلين فون فراي غير استرطابي بقطر موحد (0.8 مم) من الصلابة المناسبة للأنسجة التي يتم اختبارها بمسبار إلكتروني وقراءات تعرض القوة / الوزن الذي يتراجع عنده القوارض عن الحافة. هناك العديد من الاختلافات المهمة بين قياسات CvF و EvF. أولا ، يتم تبسيط عملية قياس كل من الاستجابات الأساسية والتجريبية باستخدام EvF إلى حد كبير حيث يمكن تطبيق الضغط على المخلب الخلفي بقوة متزايدة حتى تكون هناك استجابة ولا داعي لتغيير النصائح كما في CvF. تقضي وقتا أقل محصورة في غرف الفحص ، وبالتالي فهي أقل توترا وأكثر راحة أثناء التجربة. ثانيا ، يسمح EvF بالسهولة النسبية لتنفيذ معايير الاستبعاد العقلاني لموضوعات الدراسة في شكل نطاقات من عتبات خط الأساس المقبولة. وهذا يسمح بتوحيد الاستجابات الأساسية داخل مجموعات العلاج وعبرها. ثالثا ، تتم دائما مقارنة استجابة الشخص بعد العلاج التجريبي باستجابة خط الأساس الفردية الخاصة به مما يخلق ضوابط داخلية مهمة للقياسات. رابعا ، يتم تسجيل دقة عتبات السحب عند مستوى أعلى من الدقة حيث يمكن تطبيق الضغط بشكل مستمر بدلا من الزيادات المتاحة في شكل أوزان من الخيوط اليدوية. كما هو الحال مع فحوصات CvF المصممة جيدا ، يتم إجراء التجارب المستندة إلى EvF أيضا مع نفس الباحث (أعمى عن العلاج) يطبق القوة ويسجل سلوكيات الاستجابة. من المهم ملاحظة أن هذه التقنية تتطلب وقتا وجهدا من جانب الباحثين لتأسيس الاتساق الداخلي للقياسات وتتطلب التخطيط للتجارب بحيث يتم إجراء بدلات مناسبة للفئران التي قد يتعين استبعادها بسبب استجابات خط الأساس غير المتسقة.

يسهل التقييم سهل التنفيذ والفعال والخاضع للرقابة الجيدة للحساسية الميكانيكية إضافة التقييم السلوكي إلى نماذج الأحداث الالتهابية مثل التسمم - المثال الذي استخدمناه هنا لتوضيح قدرات وقوة قياسات EvF في قياس التغيرات في حساسية اللمس. وجدنا أن ذكور الفئران السويسرية ND4 أظهرت حساسية ميكانيكية معززة بعد حقن السم المشتق من أفعى الحفرة في أمريكا الجنوبية Bothrops jararaca في المخلب الخلفي. كانت الاستجابات السلوكية مصحوبة بوذمة وتدفق العدلات وتحلل الخلايا البدينة في الأنسجة المصابة.

البروتوكول

وافقت لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) التابعة لكلية ماكاليستر على جميع البروتوكولات. تم استخدام الفئران السويسرية الذكور ND4 البالغة من العمر 8-12 أسبوعا في هذه التجارب.

< p class = "jove_title" >1. Bothrops jararaca تحضير السم وحقن

1. تحذير: سم B. jararaca سام. ارتد القفازات والقناع وواقي العين عند التعامل مع البودرة وتحضير المحاليل.
2. يجب تطبيق 45 ميكروغرام/كغ B. jararaca سم (نظام يحدده تجارب الاستجابة للجرعة السابقة) أو 0.9٪ مركبة ملحية (10 ميكرولتر) عن طريق الحقن داخل الأخمص في كلا الكفوف الخلفية باستخدام محاقن الأنسولين 3/10 مل مع 29 جم × 1/2 في الإبر. ملاحظة: اعتمادا على التصميم التجريبي ، يمكن حقن حلول العلاج والتحكم بشكل منفصل في كل مخلب خلفي على التوالي لتوفير ضوابط داخلية داخل كل موضوع.

فئة

2. إعداد وتشغيل جهاز فون فراي الإلكتروني

1. ضع وحدة von Frey الإلكترونية على حامل المسبار. تأكد من توصيل المسبار والكابل بشكل مناسب بوحدة العرض ، وقم بتشغيل الجهاز. اضبط القراءة على صفر (0.00 جم) في وضع الإعداد ، ضع وزن الاختبار المقدم (5.00 جم) برفق على مخروط مسبار فون فراي.
2. سجل القراءة في دفتر المختبر ، وكرر هذا الإجراء عند الانتهاء من جلسة الاختبار. إذا كان هناك تناقض أكبر من 0.20 جم بين قراءات وزن الاختبار قبل جلسة الاختبار وبعدها، أو إذا تذبذبت القراءات بمجرد تطبيق وزن الاختبار، فقد تكون إعادة معايرة الجهاز (من قبل الشركة المصنعة) ضرورية.
3. لتقييم عتبة الانسحاب من مخلب الفأر الخلفي ، استخدم طرف البولي بروبلين المناسب من بين تلك المزودة بالمسبار. يعتمد اختيار الطرف على الأنسجة التي يتم فحصها. تعمل الأطراف الصلبة بشكل جيد مع أنسجة المخلب الخلفية الأقل حساسية والأكثر صلابة بينما قد تكون الأطراف شبه المرنة خيارا أفضل لمنطقة أكثر رقة مثل التلال التناسلية (Chatterjea ، غير منشورة). قم بتركيب الطرف الصلب برفق على مخروط المسبار.
4. لتسجيل الحد الأقصى للضغط المطبق ، قم بتبديل وضع التشغيل من الإعداد إلى التشغيل بحيث يتم تسجيل الحد الأقصى للضغط المطبق على الشاشة. في هذا الوضع ، سيتم حفظ الحد الأقصى لقراءة الضغط المطبق على شاشة العرض عند سحب المسبار.

3. اعتبارات عامة لتقييم عتبة سحب مخلب الهند

1. من الناحية المثالية ، هناك حاجة إلى محققين لقياس عتبة انسحاب المخلب الخلفي (الحساسية الميكانيكية) باستخدام جهاز EvF - أحدهما لتشغيل الجهاز وإجراء القياسات ، والآخر لنسخ القياسات المسجلة والتعامل مع الفئران.
2. من أجل تقليل التحيز ، يجب أن يكون المحقق الذي يقوم بتشغيل الجهاز أعمى عن العلاجات وقيم عتبة الانسحاب المسجلة. علاوة على ذلك ، لضمان الاتساق بين القياسات ، يجب على نفس الفرد تقييم جميع عتبات السحب الأساسية والتجريبية.
3. قم بإجراء جميع القياسات في غرفة هادئة يتم التحكم في درجة حرارتها ، وفي نفس الوقت من اليوم¹⁴.
4. يجب أن يضع المجرب الذي يسجل قياسات كل فأر في غرف فردية من مبيت بولي ميثيل ميثاكريلات متعدد الوحدات (PMMA) الموضوعة على حامل أرضي شبكي. قم بتغطية الغرف بأغطية PMMA مثقبة ، وضع جسما ثقيلا في الأعلى لمنع الفئران من الهروب. ضع مادة ماصة أسفل الحامل لامتصاص / جمع النفايات المفرزة. اسمح للفئران بالتأقلم لمدة 15 دقيقة في الغرف قبل تقييم خط الأساس أو التقييم التجريبي لعتبة ^{الانسحاب 6،7،10}.
يجب الوصول
5. بسهولة إلى الكفوف الخلفية للفئران من خلال فتحات الأرضية الشبكية ؛ لذلك ، ضع حامل الأرضية الشبكي على ارتفاع مريح على عربة مع الفرامل ، أو على منضدة ثابتة يمكن الوصول إليها من جميع الجوانب.
6. أثناء القياسات ، قد يتعين تشتيت انتباه الفئران بحبيبات طعام¹⁵ موضوعة خارج غرفة القياس مباشرة أو ضوضاء طفيفة جدا ناتجة عن النقر أو تشغيل قلم على طول الشبكة السلكية لأرضية الغرفة قبل القياس ، ولكن ليس أثناءه. هذا يحفز الفأر على الاستمرار لتمكين المجرب من البدء في أخذ القياسات بسهولة أكبر.

< p class = "jove_title" >4. تقييم عتبة سحب مخلب الخلف الأساسي

1. يجب إجراء المجموعة الأولى من قياسات خط الأساس قبل 48 ساعة من إعطاء العلاج. صفر المسبار عند تركيب الطرف الصلب. باستخدام يديك ، ارفع المسبار ببطء لتحفيز الوسط (منطقة وسادة القدم) من المخلب الخلفي الأيسر أو الأيمن (إذا تلقى كلا الكفبان نفس العلاج).
2. قم بزيادة الضغط تدريجيا حتى يتم ملاحظة سلوكيات الاستجابة المؤلمة المحددة مثل تراجع المخلب الخلفي أو لعق المخلب الخلفي أو القفز بأربعة مخالب^6،10. اطلب من الباحث الآخر نسخ الضغط الذي أثار السلوك المرصود.
3. قم بقياس عتبة انسحاب الماوس الموجودة في الغرفة المجاورة. استمر حتى تقوم بتقييم حدود السحب لكل ماوس مرة واحدة. كرر أربع مرات أخرى ، بحيث يتم قياس كل ماوس 5x كما هو موضح سابقا¹⁰.
4. لكل ماوس، احسب القيمة المتوسطة للقياسات الخمسة، ثم احسب مقدار انحراف كل قيمة عن المتوسط. حدد 3 قيم تنحرف على الأقل ، وقم بمتوسطها للحصول على حد سحب أساسي كما هو موضح سابقا¹⁰. في هذا العرض التوضيحي ، تم توحيد القياس باستخدام 3 من أصل 5 قيم. في حين أن الأعداد المحددة من القياسات يمكن أن تختلف حسب التصميم التجريبي ، فمن المهم التأكد من أن جميع الفئران يتم وخز عدد متساو من المرات لتقييم خطوط الأساس.
5. كرر القياسات الأساسية بعد 24 ساعة. خذ 5 قياسات لكل ماوس ، ومتوسط 3 الأقرب إلى الوسيط للحصول على عتبة سحب أساسية.
6. لحساب متوسط عتبة الانسحاب الأساسية للماوس ، قم بحساب متوسط عتبات الانسحاب الأساسية التي تم أخذها في 48 و 24 ساعة قبل العلاج. إذا كان متوسط حد السحب الأساسي أقل من 3.50 جم ، أو إذا كان الحد الأساسي مختلفا بمقدار 2.00 جم أو أكثر ، فاستبعد الماوس من التجربة. تضمن هذه المعايير أن جميع الفئران في التجربة لديها استجابات أساسية متسقة ، وعتبات انسحاب أساسية عالية بما فيه الكفاية تسمح بمراقبة عتبات أقل بعد العلاج.
7. ملاحظة: تعتمد عتبة الاستبعاد على الأنسجة التي يتم فحصها ، وسلالة المدروسة ، ونوع الطرف المستخدم. على سبيل المثال ، وجدنا أن 3.5 جم هي معيار مفيد لأنسجة المخلب الخلفي ND4 ولكن المناطق الأكثر رقة مثل التلال التناسلية تحتاج إلى عتبة استبعاد أقل (Chatterjea ، غير منشورة).
8. قم بتعيين الفئران في مجموعات العلاج بحيث يكون متوسط خط الأساس للانسحاب للمجموعات التجريبية متشابها قدر الإمكان قبل إعطاء العلاجات.

ملاحظة: يمكن إجراء قياسات خط الأساس قبل 48 ساعة قبل التجربة. ومع ذلك ، يجب إكمال مجموعتين على الأقل من قياسات خط الأساس على فترات منتظمة قبل بدء العلاج.

< p class = "jove_title" >5. التقييم التجريبي لعتبة سحب مخلب الخلف

1. تقييم عتبة انسحاب المخلب الخلفي (الحساسية الميكانيكية) بعد العلاج في النقاط الزمنية المناسبة التي يحددها تصميم التجربة. أعد الفئران إلى أقفاصها مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء على الفور بعد اكتمال القياسات.
2. اتبع الخطوات الموضحة أعلاه ؛ خذ 3 بدلا من 5 قياسات لتقليل احتمالية الإفراط في تحفيز أنسجة المخلب الخلفي (المعالجة) خاصة إذا كان سيتم تقييم الحساسية في نقاط زمنية متعددة. إذا كان أي قياسين من القياسات الثلاثة المأخوذة مختلفين بأكثر من 2.00 جم ، فقم بإجراء قياس رابع.
3. احسب متوسط 3 قياسات للحصول على عتبة الانسحاب التجريبية لكل ماوس. بالنسبة لأي فئران تم أخذ 4 قياسات لها ، احسب متوسط ثلاثة تنحرف على الأقل عن المتوسط ، من أجل الحصول على عتبة الانسحاب التجريبية.
4. للحصول على عتبة سحب دلتا لكل فأرة في نقطة زمنية معينة ، اطرح خط الأساس من عتبة السحب التجريبية. كرر لجميع الفئران وجميع النقاط الزمنية^{التجريبية 9}.
5. إجراء التحليل الإحصائي المناسب للبيانات التي تم جمعها. استخدمنا هنا JMP 9.0 (SAS ، Cary ، NC) لإجراء تحليل ANOVA أحادي الاتجاه و Tukey HSD اللاحق.

النتائج

Local B. jararaca يسبب إعطاء السم تغيرات في حساسية اللمس في المخلب الخلفي ووذمة الأنسجة في الفئران السويسرية الذكور ND4.

بعد

1.5 ساعة من إعطاء 45 ميكروغرام / كجم B. jararaca سم ، سحبت ND4 ذكور الفئران السويسرية أقدامها الخلفية عند ضغط أقل بمقدار 3.0 جم من خط الأساس (الشكل 1 أ). حدث الانسحاب الأساسي لجميع المجموعات عند ~ 4.5 غرام من الضغط المطبق. بعد العلاج بالسموم ، سحبت الفئران التجريبية أقدامها الخلفية عند 1-1.5 جم من الضغط المطبق (البيانات غير معروضة). أظهرت الفئران الضابطة المعالجة بالمحلول الملحي انخفاضا طفيفا أو معدوما في الاستجابة للضغط مقارنة بخط الأساس في جميع النقاط الزمنية التي تم اختبارها. تم الحفاظ على عتبات الاستجابة المنخفضة في الفئران المعالجة بوضوح في 3 و 6 ساعات بعد التسمم (الشكل 1 أ) ولا يمكن تمييزها عن الضوابط بحلول 24 ساعة (البيانات غير معروضة). أظهرت الكفوف الخلفية للفئران المسمومة وذمة نسيجية مميزة للالتهاب. في 1.5 ساعة بعد إعطاء السم ، كانت الكفوف الخلفية المعالجة ، المقاسة كما هو موضح^{سابقا 10} ، أكثر سمكا بمقدار 1.5 مم مما كانت عليه عند خط الأساس. استمرت الوذمة خلال 3 و 6 ساعات (الشكل 1 ب). في المقابل ، لم تظهر الكفوف المعالجة بالمحلول الملحي أي تورم أو تغيير في السماكة خلال الفترة التجريبية. بالنسبة للتجربة التمثيلية الموضحة هنا ، تم استخدام ما مجموعه 21 فأرا لقياسات خط الأساس و 14 تم اختيارها لإدراجها في التجربة. تم تخصيصها لمجموعات العلاج بحيث كان متوسط استجابات الانسحاب عند خط الأساس حوالي 4.5 غرام لكل مجموعة ككل.

B. jararaca التغيرات التي يسببها السم في حساسية اللمس مصحوبة بتحلل الخلايا البدينة وتدفق العدلات إلى الكفوف الخلفية للفئران السويسرية الذكور ND4.

< p class = "jove_content">بالإضافة إلى زيادة حساسية اللمس ووذمة الأنسجة ، قمنا أيضا بتقييم تدفق العدلات (الأشكال 2 أ - ب) وتحلل الخلايا البدينة (الأشكال 2 ج-د) في الكفوف الخلفية للفئران المسمومة مقابل الفئران المعالجة بالمياه المالحة. العدلات هي أول خلايا التهابية يتم تجنيدها في آفة من الدورة الدموية ومن المعروف أنها تتوسط استجابات الألم الالتهابية^10،16،17. الخلايا البدينة هي خلايا خارسة مقيمة في الأنسجة¹⁸ وقد ارتبط تحلل الخلايا البدينة باستجابات آلام في المخلب الخلفي للفئران¹⁰ والأم الجافية للفئران¹⁹. < p class = "jove_content">هنا ، وجدنا أن تدفق العدلات إلى الكفوف الخلفية المسمومة قد زاد بمقدار 1,000 مرة تقريبا مقارنة بالكفوف الخلفية المعالجة بالمحلول الملحي (الشكل 3 أ) كما تم تقييمها عن طريق حساب الهيماتوكسيلين يوزين الملون بالبارافين 4 ميكرومتر من أقسام الأنسجة الأخمصية السهمية المضمنة¹⁰ التي تم حصادها بعد 1.5 ساعة من إعطاء السم من الفئران القتل الرحيم. < p class = "jove_content" > في الكفوف المعالجة بالمحلول الملحي ، كانت الخلايا البدينة الأخمصية في أنسجة المخلب الخلفي سليمة إلى حد كبير أو أظهرت تحبيبا خفيفا (الشكل 3 ب). في المقابل ، أظهرت الكفوف الخلفية المسمومة تحلل معتدل وواسع النطاق بنسبة 15-20٪ للخلايا البدينة (الشكل 3 ب). تم تلطيخ أقسام الأنسجة الموصوفة أعلاه باللون الأزرق التولويدين وعدد الحبيبات المرئية التي تم حسابها لكل خلية بدينة لوحظت للتأكد من حالة التحلل كما هو موضح^{سابقا 10}. < p class = "jove_content" >
الشكل 1. يتسبب إعطاء السم الموضعي B. jararaca في حدوث تغيرات في الحساسية الميكانيكية للمخلب الخلفي ، ووذمة الأنسجة في الفئران السويسرية الذكور ND4. تم تقييم عتبات الانسحاب الأساسية وعرض مخلب خط الأساس عند 48 و 24 ساعة قبل علاج سم B. jararaca داخل الأخمص (Bjv ؛ 45 ميكروغرام / كغ) أو المركبة (المحلول الملحي) (10 ميكرولتر). تم تقييم عتبات الانسحاب عند 1.5 و 3 و 6 ساعات بعد العلاج (A). تم تقييم عرض مخلب الفيرج (متوسط عرض المخلب الأيسر والأيمن للفأر) في المنطقة الأخمصية الوسطى باستخدام الفرجار الرقمي عند خط الأساس ثم 1.5 و 3 و 6 ساعات بعد العلاج لتحديد وذمة الأنسجة كما هو موضح سابقا¹⁰ (ب). تتم مقارنة الدلالات بالفئران المعالجة ب Sal (* = p < 0.05 ، ** = p < 0.01 ، *** = p < 0.001 على التوالي). ن = 10-11 فأرا لكل مجموعة علاج. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 2. B. jararaca الحساسية الميكانيكية الناجمة عن السم مصحوبة بتحلل الخلايا البدينة وتدفق العدلات إلى الكفوف الخلفية للفئران السويسرية الذكور ND4. تم القتل الرحيم ل 3 فئران / علاج بواسطة ثاني أكسيد الكربون₂ بعد 1.5 ساعة من العلاج وتم استئصال أقدامهم الخلفية ، وتخزينها في 10٪ فورمالين لمدة 24 ساعة ، ونقلها إلى 70٪ من الإيثانول ، وإزالة الكلس لمدة 1-2 أسابيع في 15٪ EDTA ، وغرسها في البارافين. تم تلطيخ المقاطع السهمية بحجم 4 ميكرومتر بالهيماتوكسيلين يوزين (A-B) والأزرق تولويدين (C-D) لتصور العدلات (A-B) والخلايا البدينة (C-D) ، على التوالي. تم الحصول على الصور بمعدل 400X و 1,000X كما هو مشروح. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

الشكل 3. B. jararaca الحساسية الميكانيكية الناجمة عن السم مصحوبة بزيادات كبيرة في مستويات تحلل الخلايا البدينة وتدفق العدلات إلى الكفوف الخلفية للفئران السويسرية الذكور ND4. تم حساب العدلات والخلايا البدينة على أقسام الأنسجة الملطخة باستخدام مجهر أوليمبوس CX21LED. تم حساب العدلات في 3 كفوف خلفية لكل علاج من الكعب إلى أصابع القدم في مجالات الرؤية المجاورة بتكبير 400X (A). تم حساب الخلايا البدينة في 3 وسادات قدم / علاج وتم تسجيل حالة تحللها بناء على عدد الحبيبات المرئية خارج حدود الخلية: سليمة (0) ، خفيفة (0-10) ، معتدلة (10-20) ، واسعة (21+) ، كما هو موضح سابقا¹⁰ (ب).  لتجنب عد نفس الخلايا مرتين ، استخدم الباحثون الذين قاموا بتقييم أعداد العدلات ومستويات تحلل الخلايا البدينة في أقسام المخلب الخلفية شبكة منقوشة في شبكية العدسة. تمت مقارنة الدلالات بالفئران المعالجة ب Sal (* = p < 0.05 ، ** = p < 0.01 ، *** = p < 0.001 على التوالي). ن = 3 فئران لكل مجموعة علاج. انقر هنا لعرض صورة أكبر.

المناقشة

يعد قياس التغيرات في استجابات الانسحاب أداة مهمة تستخدم لتقييم التغيرات في حساسية اللمس في نماذج القوارض للألم والالتهاب. نوضح هنا فائدة جهاز فون فراي الإلكتروني لإجراء هذا التقييم. هناك العديد من المزايا لهذه التقنية: أنا) يمكننا تقييم استجابات الانسحاب بسرعة للضغط المطبق لفئران متعددة في نقاط زمنية متعددة قريبة إلى حد ما من بعضها البعض ، ب) يمكننا استخدام طرف واحد لتطبيق ضغط مستمر ومحدد على مساحة صغيرة من الأنسجة ، ج) يمكننا قياس الضغط الدقيق المطبق بدقة للحصول على استجابة الانسحاب ، و رابعا) يمكننا بسهولة تنفيذ قطع أساسية قوية ومعايير استبعاد وضوابط داخلية لضمان أن تكون التقييمات السلوكية دقيقة وموضوعية قدر الإمكان.

تتمثل الخطوات الحاسمة لضمان أفضل النتائج لمقايسة EvF في المعايرة المسبقة للأداة وممارسات القياس المتسقة. كما هو مفصل في قسم البروتوكول ، يجب التعامل مع الجهاز بعناية وضمان المعايرة المناسبة قبل الاستخدام وأثناءه. قبل إجراء أي قياسات ، يجب تأكيد قراءات وزن الاختبار لضمان وظيفة الماكينة المثلى. إذا تذبذبت القراءات بشكل كبير أو إذا كانت قراءات وزن الاختبار غير دقيقة ، فيجب الاتصال بالشركة المصنعة على الفور لمعايرة الجهاز. مع وضع ذلك في الاعتبار ، ينصح بوجود جهاز إلكتروني احتياطي من فون فراي ، إن أمكن ، حتى لا يضر بالتجارب الحساسة للوقت بسبب الحاجة غير المتوقعة لمعايرة الجهاز. علاوة على ذلك ، يجب على الباحث الفردي المدرب جيدا أن يأخذ جميع القياسات الأساسية والتجريبية لدراسة معينة أو سلسلة من التجارب بينما يظل أعمى عن مجموعات العلاج. يجب تقييم الفئران في غرفة هادئة ، والاحتفاظ بها عند درجة حرارة ثابتة ، وتتأقلم مع غرف EvF لمدة 15 دقيقة على الأقل ولكن لا يتم تقييدها في الغرفة لفترة أطول من اللازم (خاصة إذا تم أخذ قياسات متعددة في غضون يوم واحد) لتقليل التوتر والاختلافات السلوكية الناجمة عن الانزعاج.

تقدم قياسات EvF تحسينات كبيرة فيما يتعلق بتقنيات CvF الحالية. يمكن للباحثين تطبيق ضغط مستمر ولا يتعين عليهم التبديل بين أطراف الأوزان المختلفة كما هو الحال في تجارب خيوط CvF⁶. هذا يؤدي إلى عدد أقل من الوخز على الأنسجة ، وهو أمر مهم بشكل خاص في حالة الأنسجة الملتهبة أو المصابة. يمكن قياس الضغط الدقيق الذي يحدث عنده الانسحاب مقابل استخدام قياسات سحب بنسبة 50٪ والتي تقتصر أيضا على أوزان الفتيل المتاحة المستخدمة في قياسات CvF¹³. نظرا لأنه يمكن تنفيذ معايير الاستبعاد العقلانية والموحدة (كما تمت مناقشته أعلاه) ، يمكن تعيين الفئران إلى مجموعات تجريبية بحيث يكون لجميع المجموعات متوسط خطوط أساس متشابهة في بداية التجربة. تقيم قياسات EvF التغييرات في الاستجابة السلوكية لمحفز معين ، وليس الاستجابات المطلقة نفسها. لذلك ، يتم قياس تغيير كل فأر في استجابة الألم على أنه الفرق بين عمليات السحب الفردية والتجريبية والأساسية ، وبالتالي توفير ضوابط داخلية لكل قياس يتم إجراؤه.

ربما يكون أهم قيد ل EvF هو أنه ، على غرار نظيره اليدوي ، يجب على نفس الباحث أخذ جميع القياسات لسلسلة معينة من القياسات الأساسية والتجريبية. هذا يجعل توسيع نطاق التقنية أمرا صعبا من وجهة نظر الوقت والأفراد والمعدات. نجد أنه يمكن قياس ~ 20 فأرا في المرة الواحدة (اعتمادا على تكوين غرف الفحص) في 30-45 دقيقة أو أقل في نقاط زمنية متعددة بشرط أن يكون هناك 45 دقيقة على الأقل بين القياسات. أحد الاعتبارات ذات الصلة في هذا الصدد هو منحنى التعلم للمجربين الأفراد. يجب إنشاء الاتساق الداخلي قبل أن يتمكن الباحث الفردي من الشروع في تجربة واسعة النطاق وهذا يتطلب ساعات عديدة من الممارسة المخصصة التي تتضمن قياسات الاستجابة الأساسية المتكررة حتى يتم الوصول إلى الاتساق المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام القطع الأساسي يعني أنه لا يمكن تضمين جميع الفئران التي تم تحديدها على أساس للتجربة. نجد أن 25-30٪ من الفئران التي تم تحديدها على أساس لكل تجربة يتم استبعادها عادة.

فيما يتعلق بالتعديلات والتطبيقات المستقبلية ، تضيف القياسات السلوكية EvF بعدا قويا لمجموعة واسعة من نماذج الالتهاب لتحليل الألم الحاد و / أو المزمن المصاحب الذي يمكن أن يكمن وراء الأمراض الالتهابية. في التسمم ، وجدنا أن التغيرات الواضحة والسريعة في حساسية اللمس رافقت النتائج المتوقعة لتورم الأنسجة وتجنيد الكريات البيض وتحبيب الخلايا البدينة في الكفوف الخلفية للفئران الذكور ND4. تؤكد هذه النتائج الملاحظات السابقة حول مساهمات وسطاء الخلايا البدينة في الحساسية الحرارية في الفئران²⁰ والحساسية الميكانيكية الناجمة عن سم B. jararaca في ND4 الفئران السويسرية المقاسة باستخدام CvF²¹. يمكن بسهولة تعديل بروتوكول EvF لاستخدامه على أنسجة أخرى غير المخلب الخلفي ، على سبيل المثال البطن⁷ والتلال الشرجية^{التناسلية 8} حيث يتم استخدام CvF حاليا. يمكن تكييف نماذج القوارض من الحساسية والتئام الجروح والاعتلالات العصبية والأمراض الأخرى بسهولة لتشمل مقاييس الحساسية الميكانيكية في الأنسجة بما في ذلك وخارج المخلب الخلفي.

باختصار ، EvF هي تقنية مفيدة وفعالة تقوم بتحديث النهج الكلاسيكي لقياس الشعور بالألم في القوارض وهي أداة جديدة مهمة في استكشاف الآليات الكامنة المعقدة للألم في مجموعة واسعة من نماذج الأمراض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ND4 الفئران السويسرية الذكور	Harlan	0-32	الفئران المستخدمة هنا كانت تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا وتم إيواؤها واستخدامها وفقا لإرشادات IACUC الخاصة بكلية Macaleter.
3 مل / 100 حقنة أنسولين مع 29 جم 1/2 إبرة	BD	BD309301	تخلص منها بعد كل استخدام في الحاوية المناسبة.
B. jararaca< / em> سم	Sigma	V5625	الحذر: مادة سامة. ارتد واقيا للعين والجلد. يذوب في محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪.
جهاز فون فراي الإلكتروني ؛ المسبار = نطاق 90 جم	IITC	2394	تحرك برفق وتأكد من أنه أفقي دائما. لتصفير المسبار ، اضغط على "برنامج" و "مسح". للتبديل من الإعداد إلى وضع التشغيل ، اضغط على "وظيفة" (لقراءة "MH") أو "MAX".
حامل شبكي + غرف PMMA	IITC	410	ضعه على سطح مقعد ثابت أو عربة بأربع عجلات من أجل الوصول إلى جميع الجوانب.
أطراف صلبة إلكترونية فون فراي فقط ، نطاق 90 جم	IITC	2390	n / a