ويصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسريعة من داخل القراب ثقب إبرة لترنسفكأيشن المترجمة من سيرنا في النخاع الشوكي القطني في الماوس تحت التخدير قصيرة ضوء دائم.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في فيفو سيرنا ترنسفكأيشن والجينات ضربة قاضية في الحبل الشوكي عن طريق السريع موسع قطني داخل القراب الحقن في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ويصف هذا التقرير دليل خطوة بخطوة لأسلوب الحقن داخل القراب إبرة حادة بطريقة موسع، أي مستقلة عن القسطرة زرع. الحد التقنية لهذه التقنية الجراحية تكمن في براعة من اليدين. حقن سريع، وخاصة بالنسبة للمجرب المدربين، ومنذ تعطل الأنسجة مع هذه التقنية هو الحد الأدنى، تكرار الحقن ممكنة؛ لا يحدث رد فعل وعلاوة على ذلك في مأمن من الأدوات الخارجية (مثل القسطرة.)، وبالتالي إعطاء محددة أفضل وأكثر من قراءة التشكيل الحبل الشوكي. منذ تطبيق هذه المادة يقتصر إلى حد كبير في المنطقة المستهدفة من الحبل الشوكي، والمخدرات، لا تحتاج إلى أن تطبق في جرعات كبيرة، والآثار غير المرغوب فيها الأهم على الأنسجة الأخرى، كما لوحظ مع التسليم النظامية، يمكن التحايل 1، 2. علاوة على ذلك، فإننا نقوم بدمج هذه التقنية في الجسم الحي مع ترنسفكأيشن من الحمض النووي بمساعدة polyethylenimالمعهد الوطني للإحصاء (PEI) كاشف 3، التي تنص على براعة هائلة لدراسة وظائف العمود الفقري عن طريق تسليم كلاء الدوائية وكذلك الجينات، والجيش الملكي النيبالي، وجهري البروتين.
المقدمة
الحبل الشوكي هو مركز مهم جدا في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية الأساسية والوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك تجهيز ونقل مؤلمة (مسبب للألم) المدخلات 4-7. وقد تم تطوير تقنيات تجريبية مختلفة لتسهيل التشكيل الدوائية من الحبل الشوكي، مثل زرع المزمنة القسطرة داخل القراب 8، حقن مكروي الحبل الشوكي، وحقن إبرة داخل القراب 9. كل تقنية مزاياه وعيوبه، واعتمادا على نموذج التجربة أسلوب واحد قد يكون أكثر ملاءمة من غيرها. في حين زرع المزمنة القسطرة داخل القراب هو ممكن بسهولة في الفئران، وهذه الطريقة من الصعب جدا في الماوس، ونظرا حجم القيود. نسبة نجاح منخفضة جدا والعجز الحركي وغالبا ما تحدث بسبب وجود ضخمة من قسطرة في الفضاء تحت الجافية تقتصر بشدة في الماوس. وعلاوة على ذلك، يتم تقديم التسليم على المدى الطويل من الأدوية بسبب تخثر المتكررةمن مزروع مزمنة القسطرة. أخيرا، وردود الفعل المناعي شائعة.
يمكن التحايل هذه المشاكل باستخدام طريقة الحقن داخل القراب الحادة عن طريق إبرة في غياب قسطرة preimplanted، والتي تمكن التطبيق السريع وتشريحيا محدودة من الأدوية والكواشف إلى النخاع الشوكي لدى الفئران. هذا الأسلوب يحتفظ بالكامل فوائد التسليم داخل القراب على طرق أخرى النظامية التسليم (على سبيل المثال عن طريق الفم، في الوريد، داخل الصفاق، الخ) مثل خصوصية التشكيل الشوكي، والذي يسمح تخفيض الجرعات والآثار الجانبية الحد، وكذلك القدرة على تقديم المواد لا عادة لا عبور حاجز الدم في الدماغ منذ خلال حقن داخل القراب، يتم إدخال الإبرة بين الأم الجافية والحبل الشوكي. ولكن الأهم من ذلك، بالمقارنة مع غيرها من أساليب التسليم داخل القراب، وطريقة الحقن داخل القراب إبرة هو أقل الغازية، مما يتيح العديد من التطبيقات فينفس الحيوان دون أن تسبب أي تلف الأنسجة كبيرة أو إثارة رد فعل جهاز المناعة بسبب زرع المواد الأجنبية. ومع ذلك، فإنه يتطلب المهارات الفنية لاستهداف دقيقة جدا من الإبرة للسماح فعالية.
هنا، علينا أن نظهر بصريا طريقة لتحقيق المعدل الأمثل لنجاح تستهدف على وجه التحديد الحبل الشوكي القطني. موقع الحقن الذي يتم اختياره في هذه التجربة هو الأخدود بين L5 L6 وعمود فقاري، وبالقرب من حيث ينتهي الحبل الشوكي، للتقليل من إمكانية الإضرار العمود الفقري. علاوة على ذلك، ونحن لشرح استخدام هذه التقنية لنهدم الجينات في النخاع الشوكي باستخدام الرناوات siRNAs.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وكانت جميع الإجراءات استخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعتها هيئة الإدارة المحلية (Regierungspräsidium كارلسروه، كارلسروه، ألمانيا).
1. إعداد مجمع سيرنا / جزيرة الأمير إدوارد
يتم إعداد الحل سيرنا / PEI معقدة باستخدام توجيهات المصنع على النحو التالي:
- الحل ج: تمييع المبلغ المطلوب من سيرنا مع الماء المعقم (إذا لزم الأمر) ما يصل الى ربع حجم نهاية وتمييع هذا أيضا مع 10٪ محلول الجلوكوز تصل إلى نصف حجم النهاية. دوامة بلطف أو مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. كمية الأمثل للسيرنا يحتاج إلى أن تحدد تجريبيا ولكن 1 ميكروغرام سيرنا في 10 ميكرولتر حل معقد للحيوان الواحد هو نقطة انطلاق جيدة لتعظيم الاستفادة.
- الحل ب: تمييع حجم الحاجة من PEI كاشف مع الماء المعقم تصل إلى ربع حجم نهاية وتمييع هذا أيضا مع 10٪ محلول الجلوكوز تصل إلى نصف حجم النهاية. دوامة جنرال الكتريكntly أو مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
ملاحظة: كمية PEI كاشف يحدد التوازن الأيوني في المجمع الذي يؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن. كذلك كمية الأمثل للحل PEI لابد من تحديد تجريبيا. في أيدينا، فإن المبلغ الأمثل هو 0.12 ميكرولتر من PEI الحل لكل 1 ميكروغرام سيرنا. - مزيج الحل A B مع الحل في كل مرة، دوامة بلطف.
- احتضان الحل مختلطة لمدة 15 دقيقة في RT قبل الاستخدام. هذا المجمع هو مستقر لمدة 2 ساعة على RT ولمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
2. حقن داخل القراب
- تخدير الفأر مع 3٪ isoflurane و، حتى لا يظهر أي علامات على المقوم منعكس. بالإضافة إلى ذلك، تحقق من وجود الذيل و / أو قرصة مخلب العاكسة لضمان مزيد من حالة التخدير.
- يحلق حوالي 2 سم 2 من الفراء في نهاية الخلفي من الحيوان بالقرب من قاعدة الذيل لتسهيل التصور أفضل أثناء غرز الإبرة.
- وضع الماوس فيمخروط الأنف لإدارة isoflurane واستمرت أثناء الإجراء، والحد من isoflurane وإلى 1.5٪، وتغطية عيون الماوس مع زيوت التشحيم العين.
- إعداد جاهزة للاستخدام سيرنا حل مختلطة باستخدام حقنة هاميلتون 25 ميكرولتر تعلق على 30 G 0.5 في الإبرة.
- تحديد موقع العملية الشائكة من L6، والتي ينبغي أن تكون واحدة من أبرز وإصلاح العمود الفقاريات حول هذه المنطقة عن طريق الضغط عليه برفق.
- إدراج بعناية الإبرة بين أخدود من L5 L6 وفقرات ومراعاة لنفض الغبار الذيل كما يشير هذا التوقيع إدخال الناجح للإبرة في الفضاء داخل الجافية.
تلميح: استخدام ظفر، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحديد موقع الأخدود أيضا. - مرة واحدة ويلاحظ الذيل نفض الغبار، وعلى الفور، ولكن بعناية، وتأمين موقف إبرة بيد واحدة وحقن حجم المطلوب من مادة مع جهة أخرى ببطء.
نصيحة: حجم بين 5-10 ميكرولتر هو الأمثل حيث حجم أقل من 5 و# 181؛ ل لا يمكن الاعتماد عليها، وبحجم أكبر من 10 ميكرولتر يؤدي إلى الكثير من الضغوط. - مرة واحدة يتم تنفيذ الحقن، وتحريك الماوس مرة أخرى إلى قفص للتعافي من التخدير.
- تكرار هذه الحقن لا يقل عن 2 مرات كل 24 ساعة لتحقيق downregulation المثلى من الجينات المستهدفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من أجل توضيح حقن ناجحة، أجرينا هذه التقنية باستخدام سريع الخضراء FCF الصبغة في الفئران الكبار C57BL6 (8-10 أسابيع من العمر). سمح للحيوان لاسترداد لبضع دقائق بعد الحقن لتوفير ما يكفي من الوقت للصبغة لنشر ثم قتل مع جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2. في وقت لاحق، تم تشريح العمود الفقارية وتعرض الحبل الشوكي. ونقاط والأزرق المقابلة لصبغ منتشرة، شهد موقع الحقن. يمكن أن ينظر أي علامة على إصابة الحبل الشوكي، مما يؤكد الطبيعة الغازية الحد الأدنى من هذه التقنية (ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وبالتالي، فإن تقنية المبين أعلاه حقن إبرة داخل القراب هو فعال وسريع، مترجمة على وجه التحديد، وغير تدميري. من الناحية الفنية، فإن الجانب الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو نقطة الإدراج الإبرة في الأخدود. فمن الأهمية بمكان أن يتم هذا الإجراء مع أيدي هادئة جدا والصبر. مثل العديد من العمليات الجراحية، والتدريب يحسن من معدل حقن ناجحة. وهذا هو أيضا مهم جدا لأنه خلال التجربة الفعلية، وهذه التقنية لا توفر مؤشرا واضحا لتأكيد ما إذا كان حقن مباشرة هي ناجحة أم لا. المؤشر مرئية فقط من غرز الإبرة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| In Vivo< / em>-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | سانتا كروز | sc-36832 | |
| التحكم siRNA-A | سانتا كروز | sc-37007 | ؛ |
| الأجسام المضادة المضادة للتوبولين III | Sigma | T2200 | ؛ |
| الأجسام المضادة المضادة ل WAVE1 | R & D Systems | AF5514 | |
| صبغة خضراء سريعة | Sigma | F-7252 | ؛ |
| Isoflurane | Baxter | ||
| إعداد Isoflurane | Drä ger Lü beck | ||
| ماكينة حلاقة | Wella | ||
| حقنة هاميلتون Gastight 1702 | Hamilton | ||
| 30 جم 1/2 في 13 مم إبرة | BD Microlance | 304000 | & nbsp ؛ |
| مجهر لايكا MS5 | Leica | ||
| WAVE1 التمهيدي الأمامي ل qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggaggg | |
| WAVE1 التمهيدي المعكوس ل qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
المراجع
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscience. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
