يوضح هذه الورقة استخدام المجهر متحد البؤر المسح السريع إلى سلوك الخلية صورة مباشرة من خلال puparium. من خلال ترك حالة العذراء سليمة، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة وقياس العمليات الحيوية في الخلية مرحلة من مراحل التنمية ذبابة الفاكهة التي يصعب دراسة مباشرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استخدام منذ فترة طويلة من ذبابة الفاكهة نموذجا لخلية والبيولوجيا التطورية قد حقق مجموعة من الأدوات. معا، وقد مكنت هذه التقنيات تحليل الخلية والبيولوجيا التطورية من مجموعة متنوعة من الزوايا المنهجية. التصوير الحي هو أسلوب الناشئة لمراقبة عمليات الخلية الحيوية، مثل انقسام الخلية أو الخلايا المنوية على الحركة. بعد أن الطفرات معزولة في uncharacterized المفترضة البروتينات دورة الخلية أصبح من الضروري أن نلاحظ الانقسام في الموقع باستخدام التصوير الحي. وقد ركزت معظم الدراسات التصوير الحي في ذبابة الفاكهة على المراحل الجنينية التي يمكن الوصول إليها للتلاعب والمراقبة بسبب صغر حجمها وضوح بصري. ومع ذلك، في هذه المراحل دورة الخلية غير عادي من حيث أنه يفتقر إلى واحدة من مراحل الفجوة أو كليهما. على النقيض من ذلك، خلايا الجناح العذراء ذبابة الفاكهة لديها دورة الخلية النموذجية والخضوع لفترة من الانقسام السريع الذي يمتد حوالي 20 ساعة للتنمية العذراء. فمن السهل أن طdentify وعزل الشرانق من المرحلة المناسبة للقبض على الانقسام في الموقع. قدمت تصاعد الشرانق سليمة أفضل مزيج من معرفة منشأ والمتانة أثناء التصوير، مما يسمح للتجارب لتشغيل لعدة ساعات مع تأثير ضئيل على الخلايا الحيوانية وقدرتها على البقاء. الأسلوب يسمح للمراقبة من الميزات صغيرة مثل، أو أصغر من، ويطير الكروموسومات. تعديل إعدادات المجهر وتفاصيل تصاعد مستمر، ويسمح بتمديد إعداد تصور ديناميات غشاء الخلايا المجاورة والبروتينات fluorescently المسمى مثل تويولين. يعمل هذا الأسلوب لجميع البروتينات الفلورية اختبارها ويمكن التقاط ملامح نطاق submicron على مجموعة متنوعة من النطاقات الزمنية. بينما تقتصر على 20 ميكرومتر الخارجي للخادرة مع المجهر متحد البؤر التقليدية، قد يكون هذا النهج لمراقبة البروتين وديناميات الخلوية في أنسجة العذراء في الجسم الحي مفيدة عموما في دراسة الخلية والبيولوجيا التطورية في هذه الأنسجة.
المقدمة
ذبابة الخل، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، هو نموذج راسخة لدراسة جوانب كثيرة من علم الأحياء. البحوث ذبابة الفاكهة لديها تاريخ غني من التجارب الجينية التي تسمح أشكال متطورة من التلاعب الجيني بما في ذلك التعبير، ضربة قاضية والطفرة. مع ظهور علامات بروتين فلوري، وسعت هذه الدراسات لتشمل ذخيرة من الخلايا والبروتينات في الحيوانات الحية. الجنين ذبابة هو نظام ممتاز لمثل هذه الدراسات كما هو واضح بصريا الصغيرة والسماح العميق، وارتفاع القرار التصوير في الجسم الحي 1-3. وقد أثبتت المراحل الأخرى للتنمية ذبابة إلى أن تكون أقل لين العريكة، والتي تتطلب تخدير 4، تشريح والثقافة على المدى القصير 5،6، أو إنشاء النوافذ في إهاب للتصوير 7،8. هذه المناورات عادة تنازلات التنمية الحيوانية على المدى الطويل أو تؤثر على الحيوانات في الطرق التي تحد من التصوير لفترات قصيرة.
الأنف والحنجرة "> دراسة الطفرات في الجينات الرواية التي تشبه المنظمين دورة الخلية، كان من الضروري العثور على إعداد المناسب لدراسة توقيت والإخلاص من دورة الخلية. منذ يتم اقتطاع معظم دورات الخلايا الجنينية (SM أو S-G2-M) والمسوخ قيد الدراسة لا تظهر العيوب حتى مراحل لاحقة، كان من المهم أن نلاحظ دورة الخلية في الأنسجة مرحلة العذراء. الخلايا الظهارية في خادرة لها دورة الخلية G1-S-G2-M أكثر نموذجية والشرانق من هذه المرحلة هي غير قادرة على حركات العضلات 9. تضمنت نقطة الانطلاق الأولي للتلاعب الشرانق كلها سليمة معربا عن Histone2AV-GFP. وعلى الرغم من التعتيم على ما يبدو من حالة العذراء، وثبت هذا التحضير سليمة لتكون ممتازة على المدى الطويل في مجال التصوير الجسم الحي. هذه التقنية بسيطة يكفي أن الباحثين الجامعيين بشكل روتيني استخدامها لدراسة جوانب الخلية والبيولوجيا التطورية في ذبابة الفاكهة وبعد هذا القرار على ما يرام بما يكفي للسماح التمييز من الميزات مقياس ميكرومتر. مع هذا الأسلوب، والملاحظات من الأحداث على مدى الساعات والدقائق أو الثواني من الممكن ببساطة من خلال تعديل معايير السلاسل الزمنية. أشرطة الفيديو باستخدام الأزرق والأخضر والأصفر والبرتقالي، والأحمر البروتينات الفلورية، أو مزيج من هذه، بذلت. الأهم من ذلك، إذا أخذ الرعاية للحد من كثافة الليزر، حتى التصوير على المدى الطويل ليس له تأثير على التنمية أو بقاء الحيوانات.الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. يطير العمل
- الحفاظ على الذباب على مستوى متوسطة دقيق الذرة، دبس أجار الخميرة في درجة حرارة الغرفة 10.
- لالصلبان، وعزل العذارى في غضون 6 ساعة من eclosion. بعد عبور إلى الذكور من النمط الجيني المطلوب، والذباب تغيير في قارورة جديدة كل 3-4 أيام.
ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، تم استخدام خط GAL4 A9 لدفع التعبير عن الجينات المحورة في الجناح. ويمكن الحصول على الأسهم تطير من مركز الأسهم في بلومنجتون. الأسهم المستخدمة في هذه التجارب تشمل A9-GAL4 (أز # 8761)، His2Av-GFP (أز # 5941)، اسكتلندا / CYO HsCre (أز # 1092)، UAS-ChRFP-حوض (أز # 25773)، lollibow 11.
2. اختيار وتركيب شرانق
- مرحلة الشرانق إما عن طريق جمعها كما prepupae الأبيض (WPP) وابقائها عند 25 درجة مئوية حتى بلوغهم سن مناسبة أو باستخدام معايير مورفولوجية 12.
- لمراقبة انقسامات الخلية، حدد خادرة التي خضعت مؤخرا رئيس انقلاب للخارج.من هذا الوقت حتى قبل eclosion (في> 96 ساعة)، الشرانق يتم السماح متحرك المراقبة الموسعة مرور الزمن.
- إزالة الشرانق من القنينات عن طريق لمس الأولى لهم مع الفرشاة مبللة بالماء، والانتظار لمدة دقيقة للسماح للمياه لتخفيف لاصقة ثم بلطف والحث لهم على الفرشاة.
- غسل بلطف الشرانق التي اختارتها والحث عليها مع الفرشاة في الماء لإزالة اللاصق الغدة اللعابية والغذاء الجسيمات.
- نقل الشرانق نظيفة إلى طبق بتري 25 ملم مع قاع ساترة (رقم 1 ½ coverslips).
- باستخدام شرائح رقيقة إما الصلصال أو الشمع الأسنان كوسيلة لدعم، جبل الشرانق بحيث الأنسجة من الاهتمام هو الأقرب إلى ساترة.
ملاحظة: في الدراسات وصفها هنا، وقد لوحظ أجنحة العذراء والساقين والبطن histoblasts أو الظهرية notum. في الممارسة العملية، أي نوع من الأنسجة في غضون 20 ميكرون من سطح حالة العذراء هو ملاحظتها. - الشرانق توجيه بعناية بحيث TISSU(ه) من الفائدة موازية لسطح الزجاج ساترة.
- مرة واحدة هي التي شنت الشرانق، واستخدام الفرشاة لنقل طبقة رقيقة من thiodiethylene غليكول (المعنية بنقل البضائع الخطرة) إلى الفضاء بين خادرة وساترة.
ملاحظة: TDG يقلل نثر السطح، يطابق معامل الانكسار من النفط، ويسمح الأكسجين إلى أنسجة تتخلل 13. لا ينصح استخدام الزيوت، كما أنها تميل إلى حرمان الأنسجة من الأوكسجين، مما تسبب في وقف السريع للسلوكيات الخلية.
3. التصوير
ملاحظة: للحصول على التصوير، ومن المرجح أن يكون أساسيا كما confocality يزيل معظم خلفية التعتيم الناجمة عن الإضاءة الشديدة من حالة العذراء المجهر متحد البؤر.
- ضبط الإعدادات على متحد البؤر للحد من تأثير الإضاءة على التنمية العذراء وقدرتها على البقاء. للقيام بذلك، تحقق التوازن بين شدة الإثارة وحساسية المجموعة. تكوين نموذجي للواي التصويرال لايكا SP5 استخدام الماسح الضوئي الرنانة (8،000 هرتز)، قوة الليزر لتعيين 2٪ (10٪ النفاذية للسلطة 20٪)، ومجموعة ذات الثقب إلى 120 ميكرون، وتعيين خط المتوسط إلى 8. سوف تختلف اعتمادا على إعدادات الظروف التجريبية.
ملاحظة: لحل يتميز نطاق وغرامة 40X 63X العدسات والغمر النفط (0.1 ملم مسافة العمل) كما استخدمت بنجاح في هذه الطريقة، على الرغم من أنها تحد من عمق التركيز.
4. تحليل
لتحليل الأطر، ض المداخن أو الأفلام استيراد ملفات البيانات إلى فيجي، والتي لديها أدوات فعالة للعرض، وقياس، وتعديل ملفات للعرض 14. على سبيل المثال تم قياس الوقت لاستكمال الانقسام باستخدام الفاصل الزمني أخذ العينات ومتعددة الأبعاد ومتصفح الصور إلى الخطوة من خلال الأطر بينما يراقب خلية من الطور الأول إلى الطور النهائي. س، ويمكن قياس أبعاد ض ص، وباستخدام أداة القياس. للحصول على تعليمات مفصلة عن البرنامج واستخدامهانظر: http://fiji.sc/Fiji.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الخلايا في ظهائر كاذب، مثل ذبابة الفاكهة النامية العين، أو طبقة البطين للنظام العصبي المركزي الفقاريات النامية، الخضوع الحركات النووية، ووصف الهجرة النووية interkinetic، في الوقت المناسب مع دورة الخلية. يحدث تكرار الحمض النووي عندما نوى هي عند أو بالقرب من سطح الخلايا القاعدية وأدخل الانقسام عندما تصل نوى السطح القمي 15،16. الخلايا الجناح العذراء تشكيل تقسيم بسرعة أحادي الطبقة ظهارة خلال أول عدة ساعات بعد انقلاب للخارج الرأس. وقد تم جمع البيانات في وضع xy...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لتصور، وقياس، وتحديد ملامح تقسيم الخلايا، والتنمية المطلوبة لإعداد بسيطة لمراقبة الانقسام في الجناح العذراء تعيش ذبابة الفاكهة عن طريق تحليل متحد البؤر من His2AvGFP معربا عن الخلايا. وقد استخدم هذا الأسلوب لتوثيق أن دورة الخلية في الجناح العذراء تحمل أوجه التشابه القوية إلى الخلية دورات في ظهائر كاذب في ذلك نواة التحرك إلى السطح القمي من ظهارة حيث يدخلون الانقسام. بعد الطور النهائي، وانخفاض نوى الظهر في الطبقة الظهارية. وبالتالي، فإن خلايا هذا أحادي الطبقة، على ما يبدو ظه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
الكتاب نود أن نعترف أكيرا تشيبا للحصول على الدعم الفكري والدعم المادي، والمخزونات. بفضل جوليا Dallman للتعليق عليه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ذبابة الاشياء ذبابة وسادة | جينيسي العلمية | 59-114 | للتخدير ذبابة |
| CO2< / sub> غاز | Airgas South | CD50 | لمنظم تخدير الذباب |
| Airgas South | CO2< / sub> | ||
| منظم قوارير الذبابة | Genesee Scientific | 32-113RLBF | ثقافة |
| الذبابةذبابة الفاكهة< em> خطوط:A9-Gal4 (BL#8761), His2Av-GFP (bl#5941), sco/CyO HsCre (BL#1092), UAS-ChRFP-Tub (BL#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| أطباق القاع الزجاجي # 1 1/2 | WillCo Wells BV | للفحص المجهري | |
| ثيودي إيثيلين جلايكول | فلوكا | 88559 | حامل |
| نمذجة | متجر | دعم وضع الشرانق ضد | |
| متجر | فرش الرسم | للتلاعب بالذباب | |
| ملقط ناعم ، إينوكس # 5 | أدوات العلوم الدقيقة | 11252-20 | دومون # 5 |
| الكمبيوتر | أي | وصول عشوائي (RAM) بسعة 8 جيجابايت لتحليل الصور / | |
| الأفلام برامج | برامج مجانية http://fiji.sc/Fiji | ||
| تحليل الصور مجهر | يجب أن يكون أي مسح سريع متحد البؤر كافيا | ||
| 20X جافا ، و 40X أو 63X عدسات غمر الزيت | أي | لتصوير الأنسجة والميزات | |
| الخلوية وتحت الخلويةزيت الغمر (غير الفلورسنت) | |||
| مجهر مجسم | أي | للتلاعب بالذبابة |
المراجع
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
