مقالة منهجية

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

12.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51255

⸱

أبريل 30, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Neurobiology, German Cancer Research Center (DKFZ)

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول التعديلات الضرورية من polyribosome تجزئة من أجل دراسة translatome في الجسم الحي من عينات الجهاز العصبي المركزي. لأنها تتيح تقييم عالمي للترجمة والنسخ التنظيم من خلال العزلة ومقارنة الحمض النووي الريبي مجموع الكسور إلى الريبوسوم الحمض النووي الريبي ملزمة.

الملخص

وتشارك عدة عمليات في التعبير الجيني بما في ذلك النسخ والترجمة واستقرار mRNAs والبروتينات و. وينظم كل من هذه الخطوات بإحكام، مما يؤثر على ديناميكية النهائية من وفرة البروتين. وجود آليات تنظيمية مختلفة في الخطوة الترجمة، تقديم مستويات مرنا وحدها مؤشرا يمكن الاعتماد عليها في التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، التنظيم المحلية الترجمة مرنا تورطت ولا سيما في وظائف الخلايا العصبية، وتحويل "translatomics 'إلى محور الاهتمام في علم الأعصاب. طريقة عرض يمكن استخدامها لtranscriptomics الجسر والبروتينات.

نحن هنا وصف التعديلات الضرورية لأسلوب polyribosome تجزئة، والتي يستجوب وtranslatome على أساس رابطة mRNAs وتترجم بنشاط لريبوسوم متعددة والترسيب التفاضلية في التدرجات السكروز. تقليديا، والعمل مع عينات في الجسم الحي، وخاصة من سنترال الجهاز العصبي (CNS)، وقد ثبت تحديا نظرا لكميات محدودة من المواد ووجود مكونات الأنسجة الدهنية. من أجل معالجة ذلك، هو الأمثل لبروتوكول صفها خصيصا للاستخدام مع كمية ضئيلة من المواد CNS، كما يتضح من استخدام الماوس واحد الحبل الشوكي والدماغ. لفترة وجيزة، يتم استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي ويجمد ريبوسوم ترجمة على mRNAs ومع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم تنفيذ المايلين التعويم لإزالة الدهون المكونات الغنية. يتم تنفيذ تجزئة على التدرج السكروز حيث يتم فصل mRNAs وفقا لالريباسي التحميل الخاصة بهم. الكسور معزولة هي مناسبة لمجموعة من المقايسات المصب، بما في ذلك تكنولوجيات فحص الجينوم واسعة جديدة.

المقدمة

يتم تحديد الجين التعبير من خلال العمل المشترك من النسخ والترجمة واستقرار مرنا والبروتينات، مع ترجمة تحمل التأثير الأكثر الغالبة 1. ومن الواضح الآن أن كل خطوة من هذه الخطوات هو درجة عالية من التنظيم. الدقيقة الرنا، وتشكيل حبيبات الحمض النووي الريبي، وتذييل بعديد الأدينيلات بديل هيولي هي بعض الأمثلة من التنظيم بعد النسخي التعبير الجيني 2،3. كل من هذه الآليات uncouples النسخ من ترجمة ويؤثر على بروتيوم في النظام البيولوجي في المصالح. وبالتالي، لا يثير الدهشة، ومستويات مرنا وحدها هي قراءات الكمال من مستويات البروتين 4. يوفر البروتينات الكمي التقييم الأكثر مباشرة في التعبير الجيني، ولكن على الرغم من التطورات الأخيرة، لا تزال هناك قيود كبيرة على حساسية ودقة تسلسل البروتين. ولمعالجة translatome، وذخيرة من mRNAs وترجمة، ويقدم حلا وسطا ممتازا بين دراسةTranscriptome على وبروتيوم. وهو أكثر دقة من transcriptomics في تقييم التعبير الجيني النهائي، ويوفر كل من أعلى التغطية والقرار تسلسل من البروتينات.

في نظم الثدييات، فإن غالبية الأحداث تبدأ الترجمة عبر تعتمد على غطاء البدء. مجموعة من العوامل بدء حقيقية النواة مع 40S الوحيدات الريباسي صغيرة التجمع في سقف 5 'من مرنا. المجمع ثم يمسح مرنا وعند الوصول إلى بداية أغسطس كودون، تجند 60S الوحيدات الريباسي كبيرة لتشكيل 80S كاملة الريبوسوم. عائدات مرحلة الاستطالة مع الريبوسوم تتحرك على طول مرنا، مع عوامل استطالة مساعدة إدماج الأحماض الأمينية من tRNAs تحميل لسلسلة ببتيد الوليدة. يمكن ريبوسوم متعددة المضي قدما على طول مرنا واحد في وقت واحد، ولقد ثبت في عدد من الريبوسومات المرتبطة بها لربط مع معدل تخليق البروتين 5،6. وهذا يجعل التحميل الريباسي مؤشرا يمكن الاعتماد عليها لترانslation ويسمح الفصل بين ترجمة بنشاط mRNAs وعلى أساس معدل الترسيب. بالإضافة إلى التحديد الكمي للترجمة mRNAs و، ويمكن الحصول على المعلومات لتحديد تسلسل الزخارف المشاركة في التنظيم الترجمة. الحمض النووي الريبي أيضا البروتينات ملزمة والعوامل الترجمة الأخرى يمكن أن تكون معزولة من كسور مختلفة، وتسهيل دراسة واكتشاف البروتينات التنظيمية ذات الصلة.

في الجهاز العصبي، وقد تم ربط السيطرة متعدية إلى العمليات مثل تخزين مرنا والنقل وتخليق البروتين المحلية. وقد ثبت مخاريط النمو لإيواء بركة محددة المترجمة من mRNAs ومتميزة عن بقية محوار 7. بالإضافة إلى ذلك، محاور امتلاك القدرة على تجميع البروتينات 8،9 محليا. ونتيجة لذلك، السيطرة المحلية على ترجمة أصبح موضوعا حاسما من الدراسة في علم الأعصاب. وقد بينت إمكانية polyribosome من تجزئة للتصدي لهذا في العديد من الدراسات، والتي كانت تستخدم هذه التقنية لالتحقيق في التوجيه محوار في التنمية النخاع الشوكي، وبرهنت على الترجمة التي تعتمد على النشاط من عامل التغذية العصبية في الدماغ 10،11.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للDKFZ.
الحذر: من أجل منع التلوث ريبونوكلياز العينات، واتخاذ الاحتياطات الأساسية لتجنب التلوث ريبونوكلياز وإعداد جميع مخازن بالماء المعالجة DEPC.

1. إعداد السكروز التدرجات

  1. إعداد 17.5، 25.6، 33.8، 41.9 و 50٪ الحلول السكروز (أنظر الجدول 1). البدء في إعداد التدرجات بإضافة ببطء 2 مل من محلول السكروز 50٪ إلى أسفل أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة. تجميد طبقة عن طريق وضع أنابيب لمدة 20 دقيقة في -80 درجة مئوية.
  2. إضافة طبقات اللاحقة في خفض نسب السكروز مع تجميد الخطوات في بين، تنتهي إلى 17.5٪ سكروز. إبقاء التدرجات على الجليد خلال إضافة حلول السكروز من أجل منع ذوبان طبقات الأساسية.
  3. إعداد التدرجات السكروز الطازجة قبل استخدامها يوم واحد وتبقي على 4 درجات مئوية. Alternativelذ، وإعداد التدرجات مقدما، مخزن في -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية ليلا قبل التجربة.

2. تحضير الأنسجة (الحبل الشوكي و / أو المخ)

  1. تخدير الماوس عن طريق جرعة زائدة من Xylazin وKetamin في كلوريد الصوديوم ويروي transcardially مع 20 مل من أملاح الحل هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل فروج الذي يشل ريبوسوم على النصوص المرتبطة بها. تأكيد التخدير المناسبة من خلال عدم الاستجابة لالقرصات أخمص قدميه.
  2. استخراج الأنسجة بسرعة. فتح الجمجمة ظهريا واستخراج الدماغ. أداء الثقب من الصدر والعمود الفقري بأكمله القطنية واستخراج النخاع الشوكي. استخدام الدماغ كله (~ 400 ملغ) أو 4 سم قطعة من الحبل الشوكي (~ 90 ملغ)، على التوالي.
  3. نقل الأنسجة في الجليد الباردة التجانس العازلة A (انظر الجدول 1) (الحبل الشوكي: 1 مل؛ الدماغ: 4 مل) والنرد الى قطع صغيرة مع مشرط نظيفة للسماح زيادة امتصاص سيكلوهيكسيميد. Perfo RM جميع مزيد من الخطوات على الجليد.
  4. احتضان لمدة 15 دقيقة والتجانس الأنسجة ميكانيكيا باستخدام الخالط Dounce. التجانس تسيطر عليها بعناية أمر ضروري لضمان أن نوى لا تزال سليمة. علاج جميع العينات بنفس الطريقة تماما لضمان إمكانية المقارنة. ملاحظة: لأنسجة المخ: تعطيل الأنسجة بنسبة 5 السكتات الدماغية مع مدقة المناسب بإحكام. للأنسجة الحبل الشوكي: تعطيل السكتات الدماغية بنسبة 5 مع مدقة فضفاضة المناسب، تليها 5 ضربات أخرى مع مدقة المناسب بإحكام.
  5. اتخاذ مأخوذة (400 ميكرولتر للدماغ و 200 ميكرولتر عن الحبل الشوكي)، وتجميد فلاش وتخزينها في -80 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي مجموع.
  6. إزالة النوى والخلايا undisrupted وشظايا الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. انخفاض سرعة الطرد المركزي يمنع فقدان ريبوسوم.
  7. ليز شظايا غشاء في طاف نوى الحرة لمدة 30 دقيقة عن طريق إضافة NP-40 والمنظفات deoxycholate الصوديوم (كل لتركيز النهائي من 1٪).

"jove_title"> 3. المايلين التعويم

  1. هذه الخطوة يزيل المكونات الدهنية من العينة التي سوف تحجب إلا إشارة في الملف الشخصى polyribosome. أولا، قبل البرد دلاء نابذة فائقة السرعة والدوار عند 4 درجة مئوية، وإعداد 2 M، M 1.1 و 0.9 M حلول السكروز (أنظر الجدول 1).
  2. مزيج المحللة مع 1.22 حجم 2 M حل السكروز ونقل في أنبوب البولي اثيلين نابذة فائقة السرعة. تملأ جميع الأنابيب في المساواة في حجم 10 مل مع 1.1 M الحل السكروز، تراكب أنه بعد ذلك بعناية مع 0.9 M الحل السكروز.
  3. وضع أنابيب نابذة فائقة السرعة في دلاء نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ساعة على 100،000 XG في 4 درجات مئوية. أثناء هذه العملية ريبوسوم تصبح المودعة في حين بيليه المكونات الدهنية تعويم صعودا والبقاء في طاف.

4. السكروز التدرج تجزئة

  1. إزالة طاف وحل بيليه في المخزن التجانس B (انظر الجدول 1 ). قياس الامتصاصية في 260 نانومتر لكل عينة باستخدام معمل NanoDrop أو جهاز ما يعادل وتطبيع مبالغ لتحميل وفقا لقيمة الامتصاصية.
  2. وضع التدرجات السكروز (يوصف إعداد في المقطع السابق) في دلاء نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. عينات طبقة بعناية على أعلى من التدرج. إضافة واحد التدرج السكروز فارغة الرقابة الفنية.
  3. ضبط وزن كل دلو مع العازلة التجانس. عينات الطرد المركزي لمدة 1.5 ساعة على 285،000 XG في 4 درجات مئوية.
  4. البدء في التحضير لاسكو المجزئ 30 دقيقة قبل نهاية الطرد المركزي. إذا تم استخدام نموذج آخر من المجزئ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
    1. تعيين حساسية المناسبة (0.2 AUFS عن الدماغ أو 0.05 AUFS عن الحبل الشوكي) لمصباح الأشعة فوق البنفسجية وتشغيله لالاحماء. تجميع أنبوب ثاقبة، توصيله عن طريق مضخة المتداول إلى 60٪ محلول السكروز من خلال أنبوب ثاقبة.
    2. اختبار الإعداد عن طريق ضخ الفئران السكروز (تدفقه: 1 مل / دقيقة)، ولا سيما التأكد من عدم وجود تسرب في الأنابيب التي سوف أعرض فقاعات في التدرج.
    3. امتصاص الخلفية فارغة عن طريق ضخ يدويا عازلة التدرج في الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وتصحيح خط الأساس.
  5. إزالة بعناية دلاء نابذة فائقة السرعة تحتوي على التدرجات السكروز مع عينات الرسوبية من الدوار ووضعها على الجليد. تجنب أي ارتطام من التدرجات لمنع فقدان القرار.
  6. التدرجات تعمل على المجزئ. تشغيل التدرجات فارغة الأولى لتقييم امتصاص الخلفية وضمان الإعداد الفني السليم.
    1. نعلق التدرج إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية ويخترق الجزء السفلي من أنبوب مع أنبوب ثاقبة. بدء ضخ 60٪ سكروز، والتي سوف تحل محل التدرج مع عينات الرسوبية صعودا من خلال كاشف الأشعة فوق البنفسجية والى انخفاض موزع.
    2. تم توثيقه الامتصاصية في 260 نانومتر إلى توليد الشخصى لامتصاص العينة، مع وجود قمم تشير إلى sedimentaنشوئها من mRNAs والمرتبطة مفارز الريباسي، monosomes، وعدد متزايد من ريبوسوم في وقت لاحق.
  7. جمع العينات في 20 الكسور عن طريق موزع قطرة (600 ميكرولتر لكل منهما، في 2 مل أنابيب).

5. عزل الحمض النووي الريبي من الفردية الكسور

  1. إضافة 10٪ SDS إلى تركيز النهائي من 1٪ إلى كسور الفردية وتخلط جيدا لكي تتكشف البروتينات وفصل ريبوسوم. في هذه المرحلة يمكن تجميد العينات في -80 درجة مئوية. اعتمادا على السؤال الذي يتعين معالجتها، والكسور يمكن المجمعة وفقا لملف الامتصاصية.
  2. عزل الحمض النووي الريبي مع الحمضية استخراج الفينول / كلوروفورم، الذي يزيل أيضا آثار تلوث من الحمض النووي.
    1. إضافة مجلد واحد من حمضية الفينول / الكلوروفورم (prewarmed لRT) لكل عينة، والحرارة لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية وضغط الإفراج تحت غطاء الدخان بعد ذلك.
    2. عينات الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 17،000 XG في RT. نقل بعناية المرحلة المائية إلى 1.5 مل جديدةالأنبوب. يكون على بينة من مرحلة انقلاب في الكسور السكروز أكثر كثافة، حيث قد تكون المرحلة المائية في أسفل بعد الطرد المركزي.
    3. إضافة مجلد واحد من الأيزوبروبانول، 1/9 حجم خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 1 ميكرولتر GlycoBlue لكل عينة من أجل ترسيب الحمض النووي الريبي. الاحتفاظ بعينات لا يقل عن 1 ساعة عند -80 درجة مئوية.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 17،000 XG و4 درجات مئوية. يوفر GlycoBlue التصور من بيليه. إزالة طاف، ويغسل مرة واحدة مع بيليه الجليد الباردة الايثانول 80٪ والهواء الجاف بيليه. حل بيليه في ريبونوكلياز المياه مجانا.
  3. قياس كمية الحمض النووي الريبي التي كتبها معمل NanoDrop وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي من قبل رقاقة Bioanalyzer. الحمض النووي الريبي التي يتم الحصول عليها بواسطة بروتوكول المعروضة هي مناسبة لجميع الدولة من الفن المقايسات إنتاجية عالية بما في ذلك ميكروأري وتسلسل عميق.

النتائج

ويبين الشكل 2 لمحات polyribosome ممثل بعد تجزئة. لمحات من الدماغ والحبل الشوكي تظهر منحنيات الامتصاص مميزة كما هو موضح من قبل لخطوط الخلايا. mRNAs وبد أن مفارز الريباسي صغيرة (40S) الرواسب في أجزاء أخف وزنا وتظهر أولا باعتبارها ذروة على الوضع، تليها الوحيدات الريباسي كبيرة (60S) وصبغي جنسي أحادي (80S) mRNAs وملزمة. mRNAs وملزمة لريبوسوم متعددة الرواسب في الكسور أثقل، مع قمم في وقت لاحق مشيرا إلى عدد متزايد من ريبوسوم منضمة. يمكن تقييم الترجمة العالمي من التشكيل الجانبي. كمثال على ذلك، أنسجة المخ لديه polyribosome أعلى لصبغي جنسي أحادي نسبة من أنسجة الحبل الشوكي، مما يدل على مزيد من الترجمة النشطة.

تم تقييم الحمض النووي الريبي المستخرج من كسور الفردية Bioanalyzer، والتي تبين توزيع 18S 28S الرنا الريباسي و. 18S الرنا الريباسي يبدو في وقت سابق من الوضع، وفقا للمفارز الريباسي الصغيرة المترسبة في أخف sucr الكسور بيئة نظام التشغيل. عائدات نموذجية من الحمض النووي الريبي مجموع هي 10-20 ميكروغرام للدماغ و2-4 ميكروغرام عن الحبل الشوكي. غلة الحمض النووي الريبي من كسور الفردية ما يصل إلى 4 ميكروغرام و 0.8 ميكروغرام للدماغ والحبل الشوكي على التوالي، وهذا يتوقف على الكسر. A التدرج السكروز فارغة يظهر بالفعل بعض امتصاص خلفية في 260 نانومتر، وذلك بسبب وجود التلفزيون الرقمي الأرضي. يمكن طرح هذه الخلفية خلال تحليل البيانات من أجل تطبيع القيم العينة. انهارت العلاج EDTA القمم polyribosome، مما يدل هو ملف الترسيب بسبب الترجمة.

figure-results-1

الشكل 1. سير العمل والتطبيقات المحتملة في الجسم الحي من polyribosome تجزئة.> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
ملامح الشكل 2. (A) لمحات polyribosome نموذجية من الدماغ والحبل الشوكي، مع تقييم الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة Bioanalyzer. (B) توزيع GAPDH مرنا أكثر الكسور التي كتبها QRT-PCR. (C) Polyribosome من التدرج فارغة والدماغ مع وبدون العلاج EDTA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1.1 2X العازلة التدرج 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 30 ملي MgCl 2، 600 ملي مول كلوريد الصوديوم، 200 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد (فروج)، 2mm و dithiothreitol (DTT)
1.1 حل السكروز 17.5٪ 8.67 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0
1.1 حل السكروز 25.6٪ 12.8 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0
1.1 حل السكروز 33.8٪ 16.9 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0
1.1 حل السكروز 41.9٪ 20.95 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0
1.1 حل السكروز 50٪ 25 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0
2.3 التجانسالعازلة A 0.25 M السكروز، و 50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، pH7.4)، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل 200 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1MM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)، و 100 U / مل RNAsin
3.1 2M حل السكروز 68.4٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF
3.1 1.1M حل السكروز 38.5٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF
3.1 0.9M حل السكروز 30.8٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF
4.1 حomogenization العازلة B 0.25 M السكروز، و 50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25MM بوكل، 1٪ NP-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم 200 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1MM DTT، 1 ملم PMSF، 100 U / مل RNAsin

الجدول 1. قائمة مخازن والحلول.

المناقشة

على الرغم من polyribosome تجزئة ليست تقنية جديدة، إلا أنها تبقى واحدة تحديا من نوع خاص. استنادا إلى المواد المدخلات، ويمكن تحسين كبير يكون ضروريا. هذا هو الحال في الجسم الحي CNS العينات، حيث كمية المواد وغالبا ما يكون القيد ومكونات الأنسجة الدهنية تعوق عزلة mRNAs وترجمة خاصة. البروتوكولات نشرت معظم تجزئة التعامل مع الخميرة أو خطوط خلايا الثدييات، وهناك بروتوكولات المعمول بها للدماغ 12،13،14. في المقابل، هناك بالكاد أي منشورات تصف التجزئة من النخاع الشوكي، والبروتوكولات السابقة تتطلب الحبل الشوكي من عدد كبير من الحيوانات لتكون مجمعة 15. لهذه الأسباب، قدمت عدة تعديلات ضرورية للتكيف مع بروتوكول تجزيء لأنسجة الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك واحدة الماوس الحبل الشوكي. يتم تنفيذ تجميد الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد خلال نضح الحيوانية لتجنب تفكك ريبوسوم الزيتوز عملية طويلة من استخراج الأنسجة. في وقت لاحق، يتم استخراج الرنا polysomal بطريقة محددة لتعظيم العائد polyribosome. الأولى، التي تسيطر عليها تجانس الأنسجة التي كتبها douncing، تحافظ على النواة سليمة ويمنع التلوث الحمض النووي. ثم تتم إزالة نواة موثوق بواسطة الطرد المركزي. مزيج من المنظفات NP-40 و deoxycholate الصوديوم يضمن تحلل من الشبكة الإندوبلازمية والإفراج عن غشاء المرتبطة ريبوسوم لها. بالإضافة إلى ذلك، المكونات التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية داخل المايلين الدهنية الغنية طمس ملامح polyribosome. لذا المايلين تعويم أمر ضروري، حيث يتم مكعبات المركبات الكثيفة مثل polyribosomes ومركبات أخف وزنا مثل المايلين تعويم وتتم إزالة 16. ثم يتم الرسوبية Polyribosomes أكثر من 17.5٪ إلى 50٪ سكروز التدرج. بدلا من طبقات يدويا وتجميد كل طبقة السكروز، التدرجات يمكن أيضا أن تكون مستعدة باستخدام خلاط التدرج. استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور باستخدام حمضية الفينول / الكلوروفورم يسمح DNA المراد إزالتها مع فقدان الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، قد تحدث مرحلة انقلاب في الكسور السكروز كثيفة (فوق جزء 16).

يوفر هذا البروتوكول من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب التقليدية التي تعالج مستوى الترجمة. على سبيل المثال، فإن كلا من قياس فسفرته S6 (علامة بارزة الترجمة)، وكذلك وضع العلامات سلاسل الوليدة مع النظائر المشعة إعطاء معلومات عن مستويات الترجمة العالمية ولكن تكشف قليلا على ما يجري على وجه التحديد ترجمتها. Polyribosome تجزئة، من ناحية أخرى، لا يسمح تقييم الترجمة العالمية، ولكن أيضا من هوية ترجمة mRNAs والبروتينات والتنظيمية ذات الصلة. في الوقت الحقيقي PCR الكمي لا يمكن أن يؤديها على الرنا المعزولة عن قراءة سريعة للخروج من mRNAs والمختارة، وميكروأرس والجيل القادم التسلسل الحمض النووي الريبي لا يمكن أن يؤديها للدراسات واسعة الجينوم. تحسينات المقدمة هنا تسمح هذه التقنية ليتم استخدامها مع كميات ضئيلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي يقللجي عدد الحيوانات اللازمة وتحسين نوعية التجريبية الشاملة من خلال تقليل الوقت اللازم لتجهيز الأنسجة. من ناحية أخرى، وهذا الأسلوب لا يمكن التمييز ريبوسوم المتعثرة من ترجمة تلك. والنصوص تحمل ريبوسوم المتعثرة الرواسب في الكسور الثقيلة، وهذا ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير البيانات.

هناك تقنيات حديثة عنها، وهي RiboTaq وفخ، والتي وصفت ريبوسوم مع العلامات حاتمة أو صحفيين على التوالي بطريقة محددة نوع من الخلايا وmRNAs ومعزولة بسبب مناعي 17،18 المرتبطة بها. يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لpolyribosome تجزئة لتقديم دقة عالية تلا للسكان خلية معينة. الريبوسوم القدم الطباعة هو أسلوب آخر الرواية التي ينطوي نوكلياز الهضم لتوليد شظايا صغيرة، أو "أقدام"، من mRNAs والتي تحميها ريبوسوم. ثم يتم إنشاء مكتبات من هذه البصمات ومتسلسلا. طريقة هذا الأقليمايديس تحليل الجينوم كله كودون محددة على الترجمة وغير قادرة على تحديد ريبوسوم المتعثرة، غير AUG-بدء الكودونات والمنبع إطارات القراءة المفتوحة الصغيرة، والتي لا يمكن أن يتحقق عن طريق تجزئة polyribosome 19. ومع ذلك، يمكن أن يقترن polyribosome تجزئة إلى التنميط الريبوسوم لعزل شظايا تحتوي على ريبوسوم هضمها واحدة، مما يثري للأنواع الجزيئية اللازمة لإعداد المكتبة التي كثيرا ما هو مطلوب عينة عالية النقاء. أخذت معا، polyribosome تجزئة هي طريقة مرنة مع أهمية دائمة ويمكن أن يقترن لمختلف التطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات واسعة الجينوم مثل الجيل التالي من التسلسل.

الإفصاحات

أعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF)، وعلم الأحياء نظم في اشارة الى السرطان (هيلمهولتز التحالف على بيولوجيا الأنظمة) ومركز أبحاث السرطان الألماني (DKFZ).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هانك s محلول أملاح متوازنGibco14170-138
أنبوب ، Thinwall ، Polyallomer ، 14 مل ، 14 × 95 ممبيكمان كولتر331374
ثنائي إيثيل بيروكربوناتي   ؛تحذير سيجماD5758
CycloheximideSigmaC7698خطر
DithiothreitolSigma43815تحذير
أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الكاملة Roche11697498001
محلول فلوريد فينيل ميثان سولفونيلSigma93482خطر
RNasin Plus RNase مثبطPromegaN2611
Nonidet P-40Roche11332473001خطر
تحذير ديوكسيكولات الصوديومSigmaD6750
حمض الفينول: الكلوروفورم ، درجة الحموضة 4.5 (مع IAA ، 125: 24: 1)AmbionAM9722
GlycoBlueInvitrogenAM9516
معدات
Dounce Tissue مطحنة ، 1 مل / 7 ملWheaton357538 / 357542
Nanodrop 2000Thermo Scientific
SW 40 Ti Rotor ، دلو متأرجح ، تيتانيوم ، 6 × 14 مل ، 40،000 دورة في الدقيقة ، 285،000 x & nbsp ؛ زبيكمان كولتر331302
تجزئة التدرج الكثافةTeledyne Isco
2100 BioanalyzerAgilent Technologies
خطر

المراجع

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Lau, A. G., et al. Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
  3. Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. A combinatorial code for CPE-mediated translational control. Cell. 132 (3), 434-448 (2008).
  4. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  5. Grolleau, A., et al. Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics. The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).
  6. Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes. Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).
  7. Zivraj, K. H., et al. Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs. The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).
  8. Brittis, P. a, Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110 (2), 223-235 (2002).
  9. Tcherkezian, J., Brittis, P. a, Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141 (4), 632-644 (2010).
  10. Colak, D., Ji, S. -J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).
  11. Lau, A. G., et al. Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).
  12. Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., Müllner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments. RNA. 13 (3), 414-421 (2007).
  13. Esposito, A. M., et al. Eukaryotic polyribosome profile analysis. J. Vis. Exp. (40), (2010).
  14. Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation. Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).
  15. Chiu, F. C., Smith, M. E. Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination. Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).
  16. Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. Current Protocols in Cell Biology. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).
  17. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135 (4), 738-748 (2008).
  18. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  19. Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.