قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

ملخص

تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D.

الملخص

وقد تبين المكروية الميكانيكية ليكون بمثابة منظم حاسمة للسلوك نمو الورم والإشارات، التي هي في حد ذاتها تشكيلها وتعديلها كجزء من مجموعة معقدة، والتفاعلات في اتجاهين mechanosensitive. في حين أن تطوير نماذج 3D بيولوجيا الورم ذات الصلة سهلت الدراسات الآلية على أثر مصفوفة الريولوجيا على نمو الورم، والمشكلة معكوس التغييرات رسم الخرائط في البيئة الميكانيكية الناجمة عن الأورام يظل تحديا. هنا، نحن تصف تنفيذ تتبع الجسيمات microrheology (PTM) بالتزامن مع نماذج 3D من سرطان البنكرياس كجزء من نهج قوية وقابلة للحياة لرصد التغيرات الجسدية طوليا في المكروية الورم، في الموقع. المنهجية الموصوفة هنا يدمج نظام إعداد نماذج 3D في المختبر جزءا لا يتجزأ من نموذج مصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالة من النوع الأول الكولاجين مع تحقيقات fluorescently المسمى موزعة بشكل متجانس لحماماتsition والقياسات microrheology تعتمد على الوقت في جميع أنحاء العينة. ومطلي الأورام في المختبر وبحث في ظروف موازية باستخدام لوحات التصوير multiwell. بالاعتماد على الأساليب المتبعة، يتم تحويل أشرطة الفيديو من الحركات التحقيق التتبع عبر علاقة المعمم ستوكس اينشتاين (GSER) تقديم تقرير مجمع تعتمد على تردد معامل القص اللزجة، G (ω) *. لأن هذا النهج هو القائم على التصوير، ويتم تعيين توصيف الميكانيكية أيضا على حقول المكانية التي تنتقل عن طريق الضوء كبيرة أن يقدم تقريرا في وقت واحد تغييرات نوعية في 3D حجم الورم والنمط الظاهري. ، يتم عرض نتائج التحقق من صحة البيانات المتناقضة ممثل تظهر استجابة الميكانيكية في المناطق الفرعية المرتبطة المترجمة الناجم عن الغزو تدهور المصفوفة وكذلك نظام المعايرة. وتعرض أيضا نتائج غير مرغوب فيها من أخطاء التجريبية المشتركة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه القضايا. ال 96 جيدا 3D شكل الطلاء ثقافة تنفيذها في هذا البروتوكول هو جonducive لارتباط القياسات microrheology مع المقايسات فحص العلاجية أو التصوير الجزيئي لاكتساب رؤى جديدة في تأثير العلاج أو المنبهات البيوكيميائية على المكروية الميكانيكية.

المقدمة

يبدو واضحا من مجموعة متزايدة من الأدلة في الأدب أن الخلايا السرطانية، كما هو الحال مع الخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة، هي حساسة للغاية إلى الخواص الميكانيكية والفيزيائية الحيوية المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومكونات أخرى المكروية ^1-9. وقد وفرت الدراسات الآلية أنيقة نظرة ثاقبة لدور صلابة خارج الخلية كشريك إشارات mechanosensitive المعقدة التي تنظم السلوك نمو خبيث والتشكل ^{2،3،10،11.} وقد تيسر هذا العمل ولا سيما من خلال تطوير نماذج 3D في المختبر أن الورم استعادة بيولوجيا هندسة الأنسجة ذات الصلة، ويمكن زراعتها في المواد السقالة مع الميكانيكا الانضباطي والتقط بواسطة المجهر الضوئي ^12-19....

البروتوكول

1. الأجسام الشبه الكروية التثقيف ورم

1. خلط 10 مل من الماء خلية ثقافة الصف مع 0.1 غرام من الاغاروز للحصول على حل الاغاروز 1٪.
2. الحرارة الحل الاغاروز إلى فوق 70 درجة مئوية (حوالي 14 ثانية في الميكروويف القياسية أو باستخدام لوحة التسخين) قبل aliquoting 40 ميكرولتر من الحل الاغاروز في بئر في لوحة 96 جيدا.
3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل في حين حصاد الخلايا باستخدام التقنيات القياسية.

النتائج

للتحقق من صحة G * (ω) القياسات على مواقع محلية داخل المجمع المكروية نموذج الورم، أجريت تجربتين التحقق من صحة الأولية. أولا، وسعى للتحقق من صحة القياسات لدينا ضد "المعيار الذهبي" من الجزء الأكبر متذبذبة القص rheometry. نحن على استعداد عينات مماثلة من الكولاجين مصفوفة (بدون الخلايا) بتركيز 1.0 ملغ / مل الكولاجين. كما تم بحث هذه العينات مع مقياس غلفاني الأكبر (TA الأدوات AR-G2، وذلك باستخدام 40 مم موازية الهندسة لوحة) وPTM (باستخدام نفس المعلمات في جميع انحاء هذا ا.......

المناقشة

في هذا البروتوكول نقدم استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع التغيرات المحلية طوليا في ECM صلابة في نماذج ورم 3D. ونحن نتصور أن هذه المنهجية يمكن أن تعتمدها علماء الأحياء السرطان وفيزيولوجيون المهتمين في السلوك mechanosensitive المتورطين في مصفوفة إعادة عرض خلال نمو الورم وعمليات الغزو. الكمي الدقيق للمصفوفة حركية تدهور يمكن أن تكون ذات قيمة خاصة لأولئك الذين يدرسون نشاط metalloproteases المصفوفة، الليزيل أوكسيديز أو الأنواع الكيميائية الحيوية الأخرى ذات الصلة في نماذ.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكولاجين البقري من النوع 1	BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا	354231
PANC-1	ثقافة الخلايا من النوع الأمريكي ، ماناساس ، فيرجينيا	CRL1469	أو أي نوع آخر مناسب
من الخلايا Fluorescent Microspheres	Life Technologies ، Carlsbad ، CA	906906
Matrigel	BD Biosciences ، بيدفورد ، ماساتشوستس	354230
Agarose	Fisher الكواشف الحيوية ، والثام ، ماساتشوستس	C12H18O9
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر Bioreagents ، والثام ، ماساتشوستس	NC0480985
لوحات التصوير 96 بئر Corning	Inc. ، Corning ، NY	3904
DMEM	Hyclone ، Waltham ، MA	SH30243.01	أو وسائط زراعة الخلايا
المناسبة Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا		تتضمن كاميرا عالية السرعة وبرامج التصوير
برنامج MATLAB	The Mathworks و Natick و MA