يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

11.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51302

⸱

يونيو 10, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تتبع الجسيمات microrheology يمكن استخدامها لقياس غير المدمر والتغيرات في الخريطة مكانيا خارج الخلية مصفوفة الخواص الميكانيكية في نماذج ورم 3D.

الملخص

وقد تبين المكروية الميكانيكية ليكون بمثابة منظم حاسمة للسلوك نمو الورم والإشارات، التي هي في حد ذاتها تشكيلها وتعديلها كجزء من مجموعة معقدة، والتفاعلات في اتجاهين mechanosensitive. في حين أن تطوير نماذج 3D بيولوجيا الورم ذات الصلة سهلت الدراسات الآلية على أثر مصفوفة الريولوجيا على نمو الورم، والمشكلة معكوس التغييرات رسم الخرائط في البيئة الميكانيكية الناجمة عن الأورام يظل تحديا. هنا، نحن تصف تنفيذ تتبع الجسيمات microrheology (PTM) بالتزامن مع نماذج 3D من سرطان البنكرياس كجزء من نهج قوية وقابلة للحياة لرصد التغيرات الجسدية طوليا في المكروية الورم، في الموقع. المنهجية الموصوفة هنا يدمج نظام إعداد نماذج 3D في المختبر جزءا لا يتجزأ من نموذج مصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالة من النوع الأول الكولاجين مع تحقيقات fluorescently المسمى موزعة بشكل متجانس لحماماتsition والقياسات microrheology تعتمد على الوقت في جميع أنحاء العينة. ومطلي الأورام في المختبر وبحث في ظروف موازية باستخدام لوحات التصوير multiwell. بالاعتماد على الأساليب المتبعة، يتم تحويل أشرطة الفيديو من الحركات التحقيق التتبع عبر علاقة المعمم ستوكس اينشتاين (GSER) تقديم تقرير مجمع تعتمد على تردد معامل القص اللزجة، G (ω) *. لأن هذا النهج هو القائم على التصوير، ويتم تعيين توصيف الميكانيكية أيضا على حقول المكانية التي تنتقل عن طريق الضوء كبيرة أن يقدم تقريرا في وقت واحد تغييرات نوعية في 3D حجم الورم والنمط الظاهري. ، يتم عرض نتائج التحقق من صحة البيانات المتناقضة ممثل تظهر استجابة الميكانيكية في المناطق الفرعية المرتبطة المترجمة الناجم عن الغزو تدهور المصفوفة وكذلك نظام المعايرة. وتعرض أيضا نتائج غير مرغوب فيها من أخطاء التجريبية المشتركة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه القضايا. ال 96 جيدا 3D شكل الطلاء ثقافة تنفيذها في هذا البروتوكول هو جonducive لارتباط القياسات microrheology مع المقايسات فحص العلاجية أو التصوير الجزيئي لاكتساب رؤى جديدة في تأثير العلاج أو المنبهات البيوكيميائية على المكروية الميكانيكية.

المقدمة

يبدو واضحا من مجموعة متزايدة من الأدلة في الأدب أن الخلايا السرطانية، كما هو الحال مع الخلايا الظهارية الثديية غير الخبيثة، هي حساسة للغاية إلى الخواص الميكانيكية والفيزيائية الحيوية المحيطة بها المصفوفة خارج الخلية (ECM) ومكونات أخرى المكروية 1-9. وقد وفرت الدراسات الآلية أنيقة نظرة ثاقبة لدور صلابة خارج الخلية كشريك إشارات mechanosensitive المعقدة التي تنظم السلوك نمو خبيث والتشكل 2،3،10،11. وقد تيسر هذا العمل ولا سيما من خلال تطوير نماذج 3D في المختبر أن الورم استعادة بيولوجيا هندسة الأنسجة ذات الصلة، ويمكن زراعتها في المواد السقالة مع الميكانيكا الانضباطي والتقط بواسطة المجهر الضوئي 12-19. ومع ذلك، فإن الجانب الآخر من هذا الحوار mechanoregulatory بين الورم والمكروية، وسرطان الخلايا بدوره من خلالها تعديل الريولوجيا من محيطهم، لا يزال إلى حد ماأكثر صعوبة للدراسة. على سبيل المثال، أثناء عمليات الغزو، والخلايا في محيط الورم قد يخضع الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) وزيادة التعبير عن metalloproteases مصفوفة (تقوم ال MMPs) التي تسبب تدهور المحلية من ECM 20-22، والذي بدوره يؤثر على سلوك نمو mechanosensitive من الخلايا السرطانية القريبة الأخرى. من خلال مجموعة متنوعة من العمليات البيوكيميائية، وسرطان الخلايا الهاتفي باستمرار صلابة بيئتهم المحلية صعودا وهبوطا لتناسب عمليات مختلفة في أوقات مختلفة. والدافع وراء هذه المنهجية الموصوفة هنا بسبب الحاجة إلى الأدوات التحليلية التي تبلغ عن التغيرات المحلية في صلابة والامتثال للECM خلال النمو، والتي يمكن دمجها مع نماذج 3D والورم المترابطة طوليا مع التغيرات البيوكيميائية والمظهرية دون إنهاء ثقافة.

في البحث عن الطريقة الصحيحة لتنفيذ في هذا السياق، microrheology الجسيمات تتبع (PTM) يظهر كمرشح قوي.هذا الأسلوب، رائدة في الأصل من قبل ميسون ويتز 23،24، يستخدم حركة تحقيقات التتبع جزءا لا يتجزأ من السوائل المعقدة للإبلاغ عن معامل معقدة تعتمد على تردد اللزجة القص، G * (ω) في جداول طول ميكرون. وقد تم تطوير هذا النهج العام مع وجود اختلافات متعددة تناسب تطبيقات مختلفة في لينة مكثف المسألة، الغرويات، الفيزياء الحيوية والفيزياء البوليمر 25-31. PTM له بعض المزايا النسبية لأساليب أخرى، حيث يتم تقديم قراءات من زوجية المحلية من خلال التصوير الفيديو غير مدمرة تحقيقات التتبع غير نشط كيميائيا التي أدرجت في وقت إعداد الثقافة وتبقى في مكانها على مدى فترات طويلة من النمو. هذا هو على النقيض من القياسات معيار الذهب مع القص متذبذبة مقياس غلفاني بكميات كبيرة، الأمر الذي يتطلب بالضرورة إنهاء ثقافة والتقارير الريولوجيا العيانية الأكبر من عينة بدلا من القياسات نقطة داخل مجمع microenvir الورم 3Donment. في الواقع عددا من الدراسات قد بينت فائدة تفسير قياسات حركات التتبع التحقيق في أو حول الخلايا السرطانية أو غير السرطانية لقياس التشوهات المرتبطة بالهجرة خلية 32، إجهاد الناجم عن كروي توسيع 33، 34،35 الريولوجيا داخل الخلايا، و لرسم خريطة الضغوط الميكانيكية وهندسة الأنسجة سلالات في 36، والعلاقة بين حجم المسام وسرعة الغزو 37. تقنيات أخرى مناسبة لmicrorheology، مثل القوة الذرية المجهري (AFM) يمكن تنفيذها، ولكن في المقام الأول لبحث نقاط على سطح العينة وأيضا قد تشكل قضايا العقم الثقافة التي تعقد قياسات الطولية 38.

هنا، نحن تصف بروتوكول شامل يشمل أساليب لنمو الورم 3D الكروية مناسبة لنقل في ECM مع تحقيقات الفلورسنت المدمجة للفيديو الجسيمات تتبع وتحليل أساليب لرسم خرائط موثوق المكانيةالتغييرات في microrheology على مر الزمن في الثقافة. في تنفيذ الحاضر، تزرع نماذج 3D الورم في شكل multiwell بهدف نحو إدماج قياسات microrheology مع المقايسات التقليدية الأخرى (على سبيل المثال، السمسة) هذا الشكل الذي يفضي إلى. في هذا التوضيح ممثل هذه المنهجية أننا الثقافة في المختبر باستخدام الأجسام الشبه الكروية 3D-1 PANC الخلايا، وهو خط خلية سرطان البنكرياس أنشئت المعروفة لتشكيل الأجسام الشبه الكروية 39، ولكن جميع القياسات الموصوفة هنا تنطبق على نطاق واسع لدراسة الأورام الصلبة باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا مناسبة لثقافة 3D. لأنه يستند أصلا إلى التصوير هذه الطريقة هي مناسبة بشكل مثالي لاشتراكهما تسجيل البيانات microrheology عالية الدقة مع الحقول التي تنتقل عن طريق الضوء كبير من الرأي القائل بأن التبليغ عن أي تغييرات في نمو الخلايا، والهجرة والنمط الظاهري. تنفيذ PTM متكاملة مع المجهر الضوئي المنقولة بهذه الطريقة يفترض تحديد المواقع استنساخه من ذوي الخوذات البيضاء مرحلة المجهرمعنوى يتوفر عادة على المجاهر البيولوجية widefield epifluorescence التجارية الآلية. بروتوكول تطوير أدناه يمكن تنفيذها مع أي المجهر البيولوجية مضان الآلي مجهزة بشكل معقول. هذا هو أسلوب كثيفة البيانات بطبيعتها، الأمر الذي يتطلب اكتساب غيغابايت من البيانات المجهري الفيديو الرقمية لمعالجة حاليا.

في بروتوكول التالية، بروتوكول 1 تنتمي إلى الإعداد الأولي من الأجسام الشبه الكروية الورم الذي يوصف هنا باستخدام تراكب على الاغاروز ولكن يمكن أن تكون بديلا مع مجموعة متنوعة من وسائل أخرى مثل شنقا انخفاض بنسبة 40، 41 أو الثقافة الدوارة التقنيات. يصف بروتوكول 2 عملية التضمين الكروية في سقالة الكولاجين على الرغم بدلا من ذلك، يمكن أن تزرع في المختبر الأورام 3D بواسطة التغليف أو تضمين الخلايا معلق في ECM 12،15، بدلا من الأجسام الشبه الكروية غير ملتصقة واحدة شكلت من قبل. البروتوكولات اللاحقة تصف إجراءات سbtaining القياسات microrheology وقت حل من خلال الحصول على ومعالجة البيانات المجهري الفيديو، على التوالي. يوصف معالجة البيانات باستخدام MATLAB، والاستفادة من إجراءات مفتوحة المصدر لPTM مبنية على خوارزميات صفت في الأصل من قبل كروكر وجرير 42، والتي قد وضعت أيضا على نطاق واسع لمنصات البرمجيات المختلفة (انظر http://www.physics.emory.edu/ ~ أسابيع / IDL /).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الأجسام الشبه الكروية التثقيف ورم

  1. خلط 10 مل من الماء خلية ثقافة الصف مع 0.1 غرام من الاغاروز للحصول على حل الاغاروز 1٪.
  2. الحرارة الحل الاغاروز إلى فوق 70 درجة مئوية (حوالي 14 ثانية في الميكروويف القياسية أو باستخدام لوحة التسخين) قبل aliquoting 40 ميكرولتر من الحل الاغاروز في بئر في لوحة 96 جيدا.
  3. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل في حين حصاد الخلايا باستخدام التقنيات القياسية.
  4. استخدام عدادة الكريات لتحديد تركيز الخلايا في التعليق.
  5. تمييع تعليق الخلية إلى 1،000 خلية / مل وإضافة 100 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى البئر تحتوي على سرير الشفاء الاغاروز.
  6. وضع عينة على شاكر بين عشية وضحاها في حاضنة تعيين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  7. إزالة عينة من شاكر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
  8. احتضان الكروية حتى يتم التوصل إلى القطر المطلوب. على سبيل المثال، وبعد 9 أيام، وهي ليرة سوريةheroid سيكون حوالي 450 ميكرون في القطر. خلال هذا الوقت، وسائط النمو الطازجة يمكن أن تضاف إلى الآبار ولكن ينبغي تجنب التطلع لأن هذا سيؤدي إلى إزالة كروي.

2. إعداد الأجسام الشبه الكروية جزءا لا يتجزأ من ورم 3D في ECM

  1. إعداد محطة عمل مع المواد اللازمة داخل غطاء تدفق الصفحي.
  2. إعداد خليط مخفف من المعدلة الكربوكسيل 1 ميكرون قطر تحقيقات التتبع الفلورسنت بإضافة تحقيقات الأسهم 2 أجزاء (2٪ مواد صلبة) إلى 25 أجزاء من الماء المعقم.
  3. إزالة زجاجة من 3.1 ملغ / مل الكولاجين البقري من الثلاجة ووضعه على الجليد.
  4. قسامة 125 ميكرولتر من الكولاجين إلى 2 مل قارورة فارغة.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من المخفف الحل التتبع التحقيق إلى القارورة التي تحتوي على الكولاجين ودوامة لفترة وجيزة لتوزيع تحقيقات.
  6. إضافة 235 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة ثقافة الخلية التي تحتوي على الفينول الحمراء (والتي سوف تتحول الصفراء) لمجموع حجم 410 مل ودوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 مل (نصف مجموع حجم) ووضعه في قارورة جديدة 2 مل. سوف قارورة تحتوي على 1 كروي الورم وسوف فيال 2 أن تكون مزيجا السيطرة.
  7. إضافة ~ 2 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم M 1 إلى 1 فيال لتحقيق الحل إلى محايد الرقم الهيدروجيني (يجب سائل الإعلام والثقافة التي تحتوي على الفينول الأحمر العودة إلى اللون الأحمر). لاحظ أن هذا سوف يسبب الخليط لبدء علاج إذا لم يتم الاحتفاظ به على الجليد. دوامة لفترة وجيزة إلى المزيج، ثم العودة إلى رف الجليد على الفور.
    ملاحظة: كروي هو بالكاد مرئية للعين المجردة بعد 9 أيام من الثقافة وزواله من السرير الاغاروز مهمة حساسة. استخدام المجهر تشريح قد يكون من المفيد لبعض المستخدمين. الحفاظ على سلامة كروي أثناء النقل هو الهدف الأسمى.
  8. باستخدام ماصة الحافة واسعة الفم، وإزالة بلطف 40 ميكرولتر من وسائل الاعلام من البئر الذي يحتوي على الورم كروي. الإبقاء على هذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية.
  9. تحقق البئر لمعرفة ما إذا كان كرويتمت إزالة في الخطوة السابقة. إذا كان، إضافة 40 ميكرولتر تحتوي كروي لفيال 1، وإذا لم يكن كذلك، ضع 40 ميكرولتر مرة أخرى إلى البئر وكرر الخطوة السابقة.
  10. بلطف اثارة فيال 1 (لا خطر vortexing ل، فإنه قد يؤدي إلى تلف كروي) قبل نقل الخليط في 60 ميكرولتر في أجزاء منفصلة من ثلاثة آبار لوحة 96 جيدا. تفقد كل بئر مع المجهر بعد إضافة الخليط إلى تحديد والذي يحتوي أيضا كروي.
  11. إضافة ~ 2 ميكرولتر 1 M هيدروكسيد الصوديوم و 40 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى فيال 2 ودوامة قبل aliquotting 60 ميكرولتر من هذا الخليط لبئر فارغة في لوحة 96 جيدا ووضع العلامات كمجموعة تحكم.
  12. وضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية إلى علاج لمدة 1 ساعة على الأقل.

3. كونستركت شبكة من نقاط عينة وتأخذ شريط فيديو في كل نقطة

  1. نقل لوحة عينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. سماح 10 دقيقة للعينة لequilibrate مع درجة حرارة الغرفة إذا مرحلة ساخنة غير متوفر.
  2. مراقبة عينة مع انخفاض العدسات الهدف بالطاقة للتأكد من انها سليمة وجاهزة للتصوير. تحديد موقف الورم داخل البئر.
  3. تحديد كيفية العديد من نقاط العينة التي يجب اتخاذها. عادة، سوف 20 نقطة العينة في كل بئر، وزعت في حلقات متحدة المركز حول كروي نتائج مفصلة بشكل كاف.
  4. نقل المرحلة إلى كل الموضع المطلوب واستخدام المجهر التواصل البرمجيات لتسجيل x و y الإحداثيات (أو إحداثيات سجل يدويا إذا تفاعل البرمجيات غير متوفرة).
  5. التبديل المجهر لعدسة الهدف رفيع المستوى (عادة 100X)، وحدد المكعب مرشح المناسب لطول الموجة من الإثارة تحقيقات التتبع. استخدام قائمة من النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 3.4 للانتقال إلى أول نقطة في الشبكة.
  6. ضبط التركيز للعثور على قاع البئر، ثم نقل ما يصل الى العثور على مجال الرؤية (فوف) التي تحتوي على العديد من تراك في التركيزإيه تحقيقات.
  7. مراقبة الرسم البياني شدة وضبط شدة التعرض والوقت لإعطاء أعظم النطاق الديناميكي ممكن مع ضمان أن الصورة لا تصبح مشبعة.
  8. الحصول على تسلسل الفيديو بمعدل الإطار من 20-30 ميللي ثانية لكل إطار (ما يقرب من 800 لقطة في الثانية أو 16-24 في طول ينصح لتوفير إحصاءات كافية عن الحساب MSD قوية متوازنة مع الحاجة إلى تقليل اكتساب الوقت في كل نقطة الشبكة المكاني) وحفظ مع اتفاقية المناسبة. أثناء التسجيل، لا تلمس المجهر أو الجدول.
  9. كرر الخطوات من 3،6-3،9 لكل نقطة عينة في الشبكة.
  10. كرر الخطوات 3،3-3،10 لكل بئر في التجربة.

4. تحليل البيانات والفيديو لحساب خصائص الريولوجية في كل نقطة عينة

  1. نسخ كافة بيانات الفيديو إلى مجلد تحليل (ربما على كمبيوتر آخر).
  2. استيراد بيانات الصورة في MATLAB أو برامج التحليل الأخرى.
    NOTE: وثائق واسعة النطاق بشأن مجموعة من الجسيمات MATLAB إجراءات تتبع اعتمدت هنا هو متاح في http://people.umass.edu/kilfoil . فمن المستحسن استخدام وظيفة الدعوة مخصصة لأتمتة معالجة ملفات متعددة في مواقع مختلفة.
  3. معايرة البرمجيات من خلال تحليل عدة إطارات من الفيديو لتحديد بشكل مناسب الاختيار والرفض المعلمات (الحجم، ممر الموجة، الخ) لتحديد مواقع مركز التحقيق. يوصف خلفية واسعة لهذه الخطوات الحاسمة التي كتبها كروكر وجرير.
  4. استخدام البرنامج لتحديد تلقائيا كل موقف دقق في جميع الأطر الفيديو ومن ثم ربط هذه المواقف في مسارات.
  5. استخدام البيانات مسار لحساب متوسط ​​مربع الإزاحة (MSD) بوصفها وظيفة من الوقت الضائع، ويجري التأكد من تطبيق عامل المعايرة المكانية المناسبة (ميكرون لكل بكسل) للعدسة هدف محدد، أي binning بكسل، الخ (نفذت عادةفي البيانات الفوقية).
  6. حساب G * (باستخدام المعمم علاقة ستوكس آينشتاين تؤخذ بعين الاعتبار حدود انطباق GSER عن معين عينة 24،28،43. بدلا من ذلك، قد يرغب المستخدمين لتفسير خصائص ECM مباشرة من MSD ببساطة عن طريق المقارنة بين قانون السلطة التحجيم، الهضبة القيم والأرقام القياسية لعدم التجانس أو غيرها من المعالم.
  7. كرر الخطوات من 4.2 خلال 4.6 لكل فوف في التجربة.
  8. شارك في تسجيل البيانات الموقف من الخطوة 3.4 مع modulii اللزجة على تردد معين من الفائدة. اعتمادا على الشركة المصنعة للمجهر المستخدمة، وهذه الخطوة يمكن أن تيسره روتين مخصصة التي يقرأ البيانات الوصفية المجهر أو موقف البيانات يمكن جدولتها يدويا.
  9. استخدام وظائف 3D الاستيفاء لتوليد خريطة الريولوجيا المكاني للECM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من صحة G * (ω) القياسات على مواقع محلية داخل المجمع المكروية نموذج الورم، أجريت تجربتين التحقق من صحة الأولية. أولا، وسعى للتحقق من صحة القياسات لدينا ضد "المعيار الذهبي" من الجزء الأكبر متذبذبة القص rheometry. نحن على استعداد عينات مماثلة من الكولاجين مصفوفة (بدون الخلايا) بتركيز 1.0 ملغ / مل الكولاجين. كما تم بحث هذه العينات مع مقياس غلفاني الأكبر (TA الأدوات AR-G2، وذلك باستخدام 40 مم موازية الهندسة لوحة) وPTM (باستخدام نفس المعلمات في جميع انحاء هذا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول نقدم استراتيجية قوية وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتتبع التغيرات المحلية طوليا في ECM صلابة في نماذج ورم 3D. ونحن نتصور أن هذه المنهجية يمكن أن تعتمدها علماء الأحياء السرطان وفيزيولوجيون المهتمين في السلوك mechanosensitive المتورطين في مصفوفة إعادة عرض خلال نمو الورم وعمليات الغزو. الكمي الدقيق للمصفوفة حركية تدهور يمكن أن تكون ذات قيمة خاصة لأولئك الذين يدرسون نشاط metalloproteases المصفوفة، الليزيل أوكسيديز أو الأنواع الكيميائية الحيوية الأخرى ذات الصلة في نماذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نحن نعترف بامتنان تقاسم المصادر المفتوحة من MATLAB تتبع الجسيمات رمز تقدمها ماريا Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ )، جنبا إلى جنب مع رمز IDL في وقت سابق وثائق واسعة النطاق التي تقدمها جون كروكر واريك أسابيع R.. وقدم هذا العمل ممكن بتمويل من المعهد الوطني للسرطان (لجنة التحقيق الوطنية / NIH)، وK99CA155045 R00CA155045 (PI: JPC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكولاجين البقري من النوع 1BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا354231
PANC-1ثقافة الخلايا من النوع الأمريكي ، ماناساس ، فيرجينياCRL1469أو أي نوع آخر مناسب
من الخلايا Fluorescent MicrospheresLife Technologies ، Carlsbad ، CA906906
MatrigelBD Biosciences ، بيدفورد ، ماساتشوستس354230
AgaroseFisher الكواشف الحيوية ، والثام ، ماساتشوستسC12H18O9
هيدروكسيد الصوديومفيشر Bioreagents ، والثام ، ماساتشوستسNC0480985
لوحات التصوير 96 بئر CorningInc. ، Corning ، NY3904
DMEMHyclone ، Waltham ، MASH30243.01أو وسائط زراعة الخلايا
المناسبة Zeiss AxioObsever MicroscopeZeiss ، Oberkochen ، ألمانياتتضمن كاميرا عالية السرعة وبرامج التصوير
برنامج MATLABThe Mathworks و Natick و MA

المراجع

  1. Bissell, M. J., et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast. Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).
  2. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer metastasis reviews. 28, 113-127 (2009).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  4. Bershadsky, A. D., Balaban, N. Q., Geiger, B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annual review of cell and developmental biology. 19, 677-695 (2003).
  5. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, 179-183 (2011).
  6. Ingber, D. E. Tensegrity-based mechanosensing from macro to micro. Prog Biophys Mol Biol. 97, 163-179 (2008).
  7. Peyton, S. R., Ghajar, C. M., Khatiwala, C. B., Putnam, A. J. The emergence of ECM mechanics and cytoskeletal tension as important regulators of cell function. Cell Biochem Biophys. 47, 300-320 (2007).
  8. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116, 2377-2388 (2003).
  9. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).
  10. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9, 108-122 (2009).
  11. Assoian, R. K., Klein, E. A. Growth control by intracellular tension and extracellular stiffness. Trends Cell Biol. 18, 347-352 (2008).
  12. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4, 359-365 (2007).
  13. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature reviews. Cancer. 5, 675-688 (2005).
  14. Ulrich, T. A., Jain, A., Tanner, K., MacKay, J. L., Kumar, S. Probing cellular mechanobiology in three-dimensional culture with collagen-agarose matrices. Biomaterials. 31, 1875-1884 (2010).
  15. Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix encapsulation of cancer cells. J. Vis. Exp. (34), e1692(2009).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  17. Celli, J. P., Rizvi, I., Evans, C. L., Abu-Yousif, A. O., Hasan, T. Quantitative imaging reveals heterogeneous growth dynamics and treatment-dependent residual tumor distributions in a three-dimensional ovarian cancer model. J Biomed Opt. 15, 051603-051610 (2010).
  18. Rizvi, I., et al. Synergistic Enhancement of Carboplatin Efficacy with Photodynamic Therapy in a Three-Dimensional Model for Micrometastatic Ovarian Cancer. Cancer Res. 70, 9319-9328 (2010).
  19. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels. J. Vis. Exp. (42), e2089(2010).
  20. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell Cycle. 8, (2009).
  21. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Mason, T. G., Weitz, D. A. Optical Measurements of Frequency-Dependent Linear Viscoelastic Moduli of Complex Fluids. Physical Review Letters. 74, 1250(1995).
  24. Mason, T. G., Ganesan, K., van Zanten, J. H., Wirtz, D., Kuo, S. C. Particle Tracking Microrheology of Complex Fluids. Physical Review Letters. 79, 3282-3285 (1997).
  25. Crocker, J. C., et al. Two-Point Microrheology of Inhomogeneous Soft Materials. Physical Review Letters. 85, 888(2000).
  26. Valentine, M. T., et al. Investigating the microenvironments of inhomogeneous soft materials with multiple particle tracking. Physical Review E. 64, 061506(2001).
  27. Helfer, E., et al. Microrheology of Biopolymer-Membrane Complexes. Physical Review Letters. 85, 457(2000).
  28. Levine, A. J., Lubensky, T. C. One- and Two-Particle Microrheology. Physical Review Letters. 85, 1774(2000).
  29. Jonas, M., Huang, H., Kamm, R. D., So, P. T. Fast fluorescence laser tracking microrheometry, II: quantitative studies of cytoskeletal mechanotransduction. Biophys J. 95, 895-909 (2008).
  30. Celli, J., et al. Viscoelastic properties and dynamics of porcine gastric mucin. Biomacromolecules. 6, 1329-1333 (2005).
  31. Pelletier, V., Gal, N., Fournier, P., Kilfoil, M. L. Microrheology of microtubule solutions and actin-microtubule composite networks. Phys Rev Lett. 102, 188303(2009).
  32. Bloom, R. J., George, J. P., Celedon, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Mapping local matrix remodeling induced by a migrating tumor cell using three-dimensional multiple-particle tracking. Biophys J. 95, 4077-4088 (2008).
  33. Gordon, V. D., et al. Measuring the mechanical stress induced by an expanding multicellular tumor system: a case study. Exp Cell Res. 289, 58-66 (2003).
  34. Li, Y., Schnekenburger, J., Duits, M. H. Intracellular particle tracking as a tool for tumor cell characterization. J Biomed Opt. 14, 064005(2009).
  35. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical Mapping of Live Cells by Multiple-Particle-Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 83, 3162-3176 (2002).
  36. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of Mechanical Strains and Stresses around Quiescent Engineered Three-Dimensional Epithelial Tissues. Biophysical Journal. 103, 152-162 (2012).
  37. Yang, Y. L., Motte, S., Kaufman, L. J. Pore size variable type I collagen gels and their interaction with glioma cells. Biomaterials. 31, 5678-5688 (2010).
  38. Ludwig, T., Kirmse, R., Poole, K., Schwarz, U. S. Probing cellular microenvironments and tissue remodeling by atomic force microscopy. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 456, 29-49 (2008).
  39. Sipos, B., et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform. Virchows Archiv : an international journal of pathology. 442, 444-452 (2003).
  40. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
  41. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
  42. Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 298-310 (1996).
  43. Savin, T., Doyle, P. S. Static and Dynamic Errors in Particle Tracking Microrheology. Biophysical Journal. 88, 623-638 (2005).
  44. Evans, C. L., et al. Killing hypoxic cell populations in a 3D tumor model with EtNBS-PDT. PLoS ONE. 6, e23434(2011).
  45. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  46. Celli, J. P., et al. Helicobacter pylori moves through mucus by reducing mucin viscoelasticity. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 14321-14326 (2009).
  47. Bansil, R., Celli, J. P., Hardcastle, J. M., Turner, B. S. The Influence of Mucus Microstructure and Rheology in Helicobacter pylori Infection. Frontiers in immunology. 4, 310(2013).
  48. Furst, E. M. Applications of laser tweezers in complex fluid rheology. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 10, 79-86 (2005).
  49. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic Tweezers: Micromanipulation and Force Measurement at the Molecular Level. Biophysical Journal. 82, 3314-3329 (2002).
  50. Dembo, M., Wang, Y. -L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76, 2307-2316 (1999).
  51. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: a new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS ONE. 6, e17833(2011).
  52. Celli, J. P., Petrovic, L., Massdodi, I., Rizvi, I., Hasan, T. Overcoming therapeutic resistance in pancreatic cancer is not a simple mix of PDT and chemotherapy: Evaluation of PDT-chemotherapy combinations in 3D tumor models. Proc SPIE. , 85680R-85680R (2013).
  53. Glidden, M. D., et al. Image-Based Quantification of Benzoporphyrin Derivative Uptake, Localization, and Photobleaching in 3D Tumor Models, for Optimization of PDT Parameters. Theranostics. 2, 827-839 (2012).
  54. Celli, J. P., et al. An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models. Scientific reports. 4, 3751-3710 (2014).
  55. Celli, J. P. Stromal interactions as regulators of tumor growth and therapeutic response: A potential target for photodynamic therapy. Israel journal of chemistry. 52, 757-766 (2012).
  56. Garber, K. Stromal depletion goes on trial in pancreatic cancer. J Natl Cancer Inst. 102, 448-450 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نماذج الأورام ثلاثية الأبعادسرطان البنكرياسسِقالة الكولاجينمسابير التتبع الفلوريةعلاقة ستوكس-أينشتاين العامةمعامل القص اللزج المرنالمراقبة الطوليةالبيئة الميكروية الميكانيكية
قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.