تقييم الأداء الوظيفي في MDX نموذج الفأر

Summary

قياس النتيجة الأولية في التجارب السريرية لاضطرابات العصبية والعضلية وتحسين وظيفة العضلات عموما. وبالتالي، وتقييم تأثير المركبات العلاجية المحتملة على أداء العضلات سريريا قبل في نماذج الماوس هو من أهمية كبيرة. نحن هنا تصف عدة اختبارات وظيفية لمعالجة هذا الأمر.

Abstract

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو شديد في العضلات والهزال التدريجي اضطراب والتي لا يوجد علاج متاح. ومع ذلك، قد تقدمت العديد من المركبات الدوائية المحتملة والنهج العلاج الجيني في التجارب السريرية. مع تحسن في وظيفة العضلات كونها نقطة النهاية الأكثر أهمية في هذه التجارب، تم وضع الكثير من التركيز على إنشاء موثوق بها، قابلة للتكرار، وسهلة لأداء الاختبارات الوظيفية إلى ما قبل سريريا تقييم وظيفة عضلة، والقوة، والشرط، والتنسيق في MDX نموذج الفأر لDMD. تتوفر كل من اختبارات الغازية وغير الغازية. الاختبارات التي لا تؤدي إلى تفاقم المرض يمكن أن تستخدم لتحديد التاريخ الطبيعي للمرض وآثار التدخلات العلاجية (على سبيل المثال. اختبار قوة قبضة forelimb، اختبارين شنقا مختلفة سواء باستخدام الأسلاك أو شبكة وrotarod تشغيل). بدلا من ذلك، اضطر تشغيل مفرغه يمكن استخدامها لتعزيز تطور المرض و / أو تقييمآثار وقائية من التدخلات العلاجية في أمراض الأمراض. نحن هنا تصف كيفية أداء هذه الاختبارات الوظيفية الأكثر استخداما بطريقة موثوق بها وقابلة للتكرار. باستخدام هذه البروتوكولات على أساس إجراءات التشغيل القياسية تمكن مقارنة البيانات بين المختبرات المختلفة.

Introduction

ضمور العضلات دوشين (DMD) هو اضطراب عصبي عضلي الأكثر شيوعا التي تؤثر 1:5،000 الأولاد حديثي الولادة. ويتسبب هذا المرض الشديد والهزال العضلات التدريجي عن طريق الطفرات في الجين DMD التي تعطل الإطار القراءة المفتوحة ومنع تخليق البروتين الدستروفين الوظيفية. ألياف العضلات التي تفتقر إلى الدستروفين عرضة لممارسة الأضرار التي يسببها. عند استنفاد قدرة العضلات على التجدد، ويرجع ذلك إلى التهاب مزمن في العضلات التالفة، يتم استبدال الألياف عن طريق النسيج الضام والدهون، مما يؤدي لاحقا إلى فقدان وظيفة. عموما، والمرضى DMD تفقد التمشي في الأطراف السفلية في وقت مبكر من العقد الثاني. في وقت لاحق، وكذلك عضلات الذراعين والكتف حزام هي المتضررة والمرضى وغالبا ما تضع صدري قطني جنف بسبب ضعف في عضلات غير المتماثلة دعم الحبل الشوكي. التهوية المساعدة هو مطلوب عموما في أواخر سن المراهقة أو في أوائل العشرينات. الجهاز التنفسي وفشل القلب الرصاصحتى الموت في العقد الثالث أو الرابع ^1.

على الرغم من أن الجين المسبب للمرض تم اكتشافه منذ أكثر من 25 عاما ^2، لا يوجد علاج متاح لDMD. ومع ذلك، وتحسين الرعاية الصحية واستخدام الكورتيزون وزيادة متوسط ​​العمر المتوقع في العالم الغربي ^3. مع استخدام نماذج حيوانية مثل الماوس MDX، إلى الأمام خطوات كبيرة في اكتشاف استراتيجيات العلاجية المحتملة بذلت. الماوس MDX هو نموذج الفأر DMD الأكثر استخداما. لديها طفرة نقطة في اكسون 23 من الجينات DMD الفئران وبالتالي يفتقر الدستروفين ^4. على مدى العامين الماضيين، قد حققت تقدما العديد من الاستراتيجيات المقترحة في التجارب السريرية ^5-9. في هذه التجارب، وتحسين وظيفة العضلات هو نقطة النهاية الأولية، التي يقوم عليها أهمية اختبار فائدة من المركبات على وظيفة العضلات في الفئران خلال مرحلة ما قبل السريرية لاختبار.

مثل DMDالمرضى، وأيضا الألياف العضلية السلبية الدستروفين من الفئران MDX عرضة للضرر الناجم عن ممارسة واختلال وظائف العضلات مقارنة C57BL/10ScSnJ الفئران نوع البرية. ويمكن تقييم هذا الانخفاض مع مجموعة متنوعة من الاختبارات الوظيفية. بعض هذه الاختبارات موسع ولا تتداخل مع أمراض العضلات (مثل forelimb قوة قبضة، واختبارات شنقا وrotarod تشغيل). وبالتالي يمكن أن تستخدم لرصد التاريخ الطبيعي للمرض أو تحديد آثار المركبات على تطور المرض. للحصول على الصورة في عمق تأثير المركبات على وظيفة العضلات في الفئران MDX، نظام اختبار وظيفي أن لا تتداخل مع تطور المرض تتكون من كل هذه التجارب يمكن استخدامها ^10.

بدلا من ذلك، اضطر تشغيل مفرغه يمكن استخدامها لتفاقم عمدا تطور المرض واختبار القدرات الوقائية للمركبات ^11. ويمكن أيضا أن تكون حلقة مفرغةتستخدم قياس النتيجة التي تشغل الوقت حتى استنفاد يقاس ^12، أو كأداة لالتعب الفئران MDX بحيث أداء أقل بشكل جيد في اختبار وظيفي لاحقة ضمان أكبر الاختلافات في الأداء بين مجموعات العلاج ^13. عند اختيار الاختبارات الوظيفية، يجب أن تبقى تأثيرها على تطور المرض في الاعتبار خاصة عند اختبار الفئران التصنع مثل الماوس MDX ^14.

نحن هنا تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ الاختبارات الوظيفية الأكثر استخداما بطريقة موثوق بها وقابلة للتكرار على أساس إجراءات التشغيل القياسية المتوفرة من شبكة TREAT NMD. اضغط هنا لزيارة TREAT-NMD .

Protocol

تمت الموافقة على التجارب وصفها هنا من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوانية (DEC) من المركز الطبي لجامعة لايدن (LUMC). كانت ولدت الفئران عن طريق منشأة الحيوان من LUMC وضعهم في أقفاص التهوية بشكل فردي مع 12 ساعة ضوء دورات الظلام. كان عليهم بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية الحصول على المياه وتشاو القياسية.

عند تنفيذ أي من الاختبارات الوظيفية المبينة أدناه، الظروف التجريبية يجب أن تكون خاضعة لرقابة صارمة للحد من التباين. ويفضل، ينبغي استخدام العمر والجنس الفئران المتطابقة، كما يختلف الأداء بين العمر وبين الجنسين. وينبغي العشوائية الفئران التي تنتمي إلى نفس القمامة على المجموعات التجريبية. وينبغي اختبار الحيوانات من قبل نفس المشغل، الذي هو أعمى إلى المجموعات التجريبية. يجب أن يتم تنفيذ الاختبارات على نفس الوقت من اليوم وأيام الأسبوع، نفس الغرفة لمعادلة الروائح، والضوضاء، الخ ويمكن ملاحظة تباين كبير بين ¹⁴ الفئران الفردية والنقاط الزمنية للجميعاختبارات وظيفية، وبالتالي 6-8 الفئران / المجموعة التجريبية التي ينبغي استخدامها. يمكن أداء اختبار وظيفي أيضا تختلف إلى حد كبير بين مختلف السلالات البرية من نوع الفطرية. وبالتالي، الفئران البرية من نوع التجريبية والضابطة ينبغي دائما أن الخلفيات المقابلة (في حالة الفئران MDX استخدام C57BL/10ScSnJ نوع السلالة البرية). وقد تم الحصول على جميع البيانات الموضحة هنا مع C57BL/10ScSnJ نوع السلالة البرية، وهو ما يشير إلى نوع البرية اعتبارا من الآن فصاعدا. الاختبارات الموصوفة هنا يمكن استخدام طوليا من 1-19 أشهر على الأقل من العمر في الفئران نوع MDX والبرية. يجب أن لا تتكرر التجارب أكثر من مرة واحدة أسبوعيا لمنع الفئران من فقدان الاهتمام والاستعداد لتنفيذ المهمة.

1. Forelimb قبضة قوة اختبار

استخدام اختبار forelimb قوة قبضة لقياس قوة الأمامية. ويستند الاختبار على الميل على فأرة الحاسوب لفهم غريزي شبكة عندما علقت من ذيله ^15، وadapteد من DMD_M2.2.001.pdf .

1. تعيين الجهاز الأعلى: إرفاق الشبكة لمحول القوة، والذي يقيس أقصى القوة التي تطبقها الماوس على الشبكة أثناء السحب. تأكد من أن الإعداد هو على الذروة وضع التوتر (T-PK) لسحب. ويمكن تعديل وحدات من القوة في أي أوقية من قوة، غرام من قوة، جنيه من قوة، كجم من القوة، أو نيوتن.
   ملاحظة: نحن نفضل العمل مع غرام كوحدة من القيم. هي متر متعددة متاحة تجاريا، ولكن فقط محولات المحوري تعطي نتائج موثوق بها وتتأثر قوة محولات رافعة نوع سلبا من القوانين الفيزيائية من تأثير رافعة. إما شبكة nonflexible أو مثلث يمكن استخدامها مع الحانات التي هي 1-2 ملم في القطر.
2. قبل إجراء الاختبار، وتقييم وزن الجسم من الفأرة، للسماح للتطبيع وزن الجسم.
3. استخدام غرام كوحدة من القيم. إعادة تعيين العداد في بداية كل ريكوrding.
4. إزالة الماوس من قفصه عن طريق الاستيلاء على الذيل وتحريكه أفقيا نحو الشبكة.
5. تأكد من أن الماوس القبضات الشبكة بشكل وثيق مع كل من الأرجل الأمامية.
6. سحب الماوس بعيدا عن الشبكة بحيث يتم كسر سيطرتها؛ سيظهر أعلى القوة المطبقة على الشبكة على شاشة محول، والتي يمكن أن تكون إما يدويا أو تلقائيا المسجلة.
7. تأخذ فقط في الاعتبار تسحب فيها الماوس يظهر مقاومة المجرب. رفض التدابير التي forepaw واحد فقط، أو hindlimbs استخدمت والتي تحولت الماوس أثناء السحب.
8. السماح للماوس سحب الشبكة ثلاث مرات على التوالي ومن ثم إعادته في القفص لفترة يستريح من دقيقة واحدة على الأقل ملاحظة: بين سلسلة من تسحب فترة الراحة ضروري لالماوس لاستعادة وتجنب تشكيل العادة.
9. ثم ترك الماوس إجراء سلسلة من أربعة تسحب كل تليها فترة راحة قصيرة. بهذه الطريقة مذكرات التفاهموقد سحبت ه ما مجموعه 15X (3 × 5 مرات تسحب = 15 تسحب).
10. تحديد الحد الأقصى لقوة قبضة وتطبيع لوزن الجسم عن طريق أخذ متوسط ​​القيم الثلاث أعلى من القيم التي تم جمعها 15.
11. اختياري: تحديد التعب عن طريق حساب إنقاص بين متوسط ​​من الأولين والأخيرين من سلسلة تسحب 1 +2 +3 = A، 4 +5 +6 = B، 10 +11 +12 = C و 13 +14 + 15 = D. الصيغة: (C + D) / (A + B) يعطي قيمة 1 بالنسبة للفئران التي لا مرهق. هذا يمكن التعبير عنها في النسب المئوية بحيث ماوس دون تعب يحتوي على قيمة 0٪ والفأر الأمامية التي مرهق تماما يحتوي على قيمة 100٪.

2. معلقة الاختبارات

مع الاختبارات شنقا، والتوازن والتنسيق وحالة العضلات يمكن تقييمها. وتستند هذه الاختبارات على الفئران أن المعرفة هي حريصة أن تبقى معلقة على سلك الشبكة أو حتى استنفاد ^16. هناك نوعان من اختبارات شنقا المميزة التي في بداية الاختبار إماوتستخدم فقط الأمامية اثنين أو جميع أطرافه الأربعة، وذلك باستخدام سلك الشبكة أو على التوالي. اختبار شنقا باستخدام الأسلاك والشبكة هي أطول وقت طريقة التعليق مقتبس من DMD_M.2.1.004.pdf و DMD_M.2.1.005.pdf على التوالي. ويستخدم الحد شنقا ثابتة من 600 ثانية. غالبية الفئران البرية من نوع يمكن أن يتعطل عن 600 ثانية، بينما الفئران التصنع لا يمكن. للحد من قضاء بعض الوقت أداء هذا الاختبار، تم تعيين الحد الأقصى الوقت شنقا في المكان. يتم إعطاء الفئران التي تسقط السلك أو الشبكة قبل ثم يصل إلى اثنين من أكثر محاولات. يتم ذلك لإعادة التأمين أن الفئران غير قادر حقا أن يتعطل وحتى لا يسقط بسبب الحماقات.

1. اختبار شنقا مع اثنين من أطرافه
   1. تعيين جهاز الأعلي: تأمين بإحكام 2 مم معدنية سميكة من القماش شماعات لرف مع الشريط والحفاظ على شماعات حول 370؛ سم فوق طبقة من الفراش. ملاحظة: بدلا من ذلك، 55 سم 2 مم سلك معدني سميك الذي هو المضمون بإحكام بين 2 المدرجات الرأسي يمكن استخدامها. على مسافة 37 سم يكفي لتشجيع الفئران أن تظل معلقة، ولكن أيضا منخفضة بما فيه الكفاية لمنع الفئران من الإصابات عند سقوطها. يجب أن السلك لم يهتز أو تهجير أثناء الاختبار لأن هذا يمكن أن تتداخل مع أداء الماوس.
   2. التعامل مع الماوس عبر الذيل وجعله بالقرب من السلك.
   3. السماح للماوس فهم السلك مع الأرجل الأمامية اثنين فقط، وخفض hindlimbs في مثل هذه الطريقة أن توقف الماوس فقط مع اثنين من الأرجل الأمامية على السلك (الشكل 2B).
   4. البدء مباشرة في توقيت عند تحرير الماوس. بعد الإفراج عنهم، الفئران قوية في محاولة للقبض على الأسلاك مع جميع أطرافه الأربعة والذيل، والذي يسمح (الشكل 2C).
   5. عندما يظهر الماوس السلوك غير اللائق (مثل موازنة أو عمدا القفز من الأسلاك على النحو SHتملك في أرقام 2D و 2E)، معالجة مباشرة هذا عن طريق استبدال الماوس على السلك من دون التوقف الموقت.
   6. عندما يسقط ماوس قبالة الأسلاك، وإيقاف الموقت وتسجيل الوقت شنقا.
   7. عندما تكون قادرا على شنق ل600 ثانية الفئران، وتأخذهم بعيدا عن الأسلاك وإعادتها إلى القفص. يتم إعطاء الفئران التي تقع قبل هذا الحد بحد أقصى اثنين من أكثر محاولات.
   8. تسجيل الحد الأقصى للوقت شنقا (أي أطول من تجارب) واستخدام هذا لمزيد من التحليل.
2. معلقة اختبار مع أطرافه الأربعة
   1. تعيين الجهاز حتى: استخدام إما اليد التي قدمت مربع أو غطاء قفص كبير للفأر أو أرنب لهذا الاختبار. وضع الشبكة 25 سم فوق الفراش لينة لمنع الفئران من إيذاء أنفسهم على السقوط، ولكن أيضا للحد من الفئران على القفز عمدا خارج الشبكة. تأمين بإحكام الشبكة بحيث لا يكون المجرب لعقد الشبكة يدويا أثناء التجربة حيث أن هذه الحركات قد طnterfere مع أداء الفأر.
   2. ضع الماوس على الشبكة بحيث القبضات مع الكفوف الأربعة.
   3. عكس الشبكة بحيث الماوس هو معلق والبدء مباشرة في جهاز ضبط الوقت.
   4. تنتهي جلسة اختبار للفئران التي تكون قادرة على شنق لمدة 600 ثانية. إعطاء الفئران التي تقع خارج الشبكة في وقت سابق بحد أقصى اثنين من أكثر محاولات.
   5. استخدام الحد الأقصى للوقت شنقا (أي. أطول من تجارب) لمزيد من التحليل.

3. الجري Rotarod

مع اختبار قوة العضلات rotarod، والتنسيق، والتوازن، وحالة يمكن تحديد ^17.

1. تعيين الجهاز الأعلى: لهذا الاختبار، والفئران لديك لتشغيل على أنبوب الدورية. ضمان أن يتم ضبط سرعة ثابتة عند 5 التناوب لكل دقيقة (دورة في الدقيقة)، وأن يزيد من سرعة 5-45 دورة في الدقيقة في 15 ثانية الأولى عندما بدأت. بعد هذا لديه للحفاظ على سرعته.
2. وضع الفئران على أنبوب من rotarodعندما يدور بسرعة ثابتة بطيئة من 5 دورة في الدقيقة. يمكن اختبار خمسة الفئران في وقت واحد.
3. بدء التشغيل مرة واحدة يتم وضع جميع الفئران. ضمن 15 ثانية الأولى من سرعة أنبوب تسارع 5-45 دورة في الدقيقة وبعد ذلك يؤكد أن السرعة.
4. مراقبة التشغيل. إدارة الوقت وتسجل باستمرار من قبل البرنامج. إدارة الوقت يتوقف تلقائيا عندما يسقط ماوس خارج الأنبوب حيث أن هذا ينشط شريط الوقت ضعه تحت الأنبوب. إعادة الفئران التي يستدير التي تواجه الاتجاه المعاكس على أنبوب أثناء تشغيل دون توقف أنبوب للتدوير.
5. إنهاء جلسة اختبار للفئران التي هي قادرة على تشغيل لمدة 500 ثانية. إعطاء الفئران بحد أقصى اثنين محاولات أكثر مما يسمح لهم لتحسين وقتهم على التوالي، عندما يقعون في وقت سابق.
6. استخدام الحد الأقصى للوقت تشغيل (أي أطول من تجارب) لمزيد من التحليل.

4. التمرين مفرغه

المفرغه يمكن استخدامها في ثلاث طرق كأداة في مرحلة ما قبل البحوث السريرية. أولا، مطحنة اضطر تشغيل يمكن استخدامها لتفاقم الأمراض المرض كما هو موضح في هذا البروتوكول (انظر أيضا: DMD_M2.1.001.pdf ). ثانيا، القدرة على التوالي القصوى من الفئران وآثار العلاجات على هذا يمكن تقييمها (انظر لطريقة للسماح الفئران تشغيل حتى استنفاد DMD_M.2.1.003.pdf ). أخيرا، مطحنة تشغيل يمكن استخدامه قبل اختبار وظيفي آخر لاستنفاد الماوس بحيث ينفذ أقل بشكل جيد في الاختبار الثاني ^13. يتم ذلك من خلال ممارسة الفئران مرتين أو ثلاث مرات أسبوعيا كما هو موضح أدناه، تليها مباشرة من قبل أي واحد من اختبارات وظيفية وصفها في بروتوكول 1-3.

1. تعيين جهاز حسابه: هناك العديد من المطاحن المتاحة تجاريا التي يمكن العديد من الفئران رون في وقت واحد والتي الارتفاع ومدته وسرعة يمكن تعديلها. وقد تم تجهيز بعض المطاحن مع شبكة لتقديم الصدمات كثافة منخفضة لتشجيع الفئران لتشغيل. ومع ذلك، الفئران MDX حساسة للإجهاد، ويمكن بسهولة أن يكون الدافع بطريقة ودية من خلال دفعة لطيف مع اليد في الاتجاه قيد التشغيل. وبالتالي، فإنها مدعوة بقوة إلى عدم استخدام الشبكة الصدمة. عموما، هناك حاجة إلى التحفيز مع اليد فقط خلال الدورة الأولى على التوالي.
2. وضع الفئران في حلقة مفرغة الأفقي.
3. بدء حلقة مفرغة في سرعة تشغيل 12 م / دقيقة. بسرعة أقل (8 م / دقيقة) لديها لاستخدامها في الفئران القديمة (> 15 شهرا)، حيث السرعات العالية يؤدي بسهولة إلى الإرهاق.
4. خلال الدورة الأولى، وتشجيع الفئران لتشغيل عن طريق دفع لهم بلطف عندما يكونون قرب نهاية الحزام.
5. عندما قمت بتشغيل الفئران لمدة 30 دقيقة، ووضعها مرة أخرى في قفص.
6. كرر ذلك مرتين أسبوعيا لمدة 12 أسبوعا على سبيل المثال.
7. تسمح فترات الراحة عند الحاجة. على سبيل المثال، بعض الفئران MDX ديك لإيقاف تشغيل وينبغي أن يسمح للراحة لبضع دقائق. إذا حدث هذا، بدوره قبالة الحزام، وإعطاء كل الفئران فترة الراحة اثنين من دقيقة، يتحول الحزام على لمدة دقيقة على 4 م / دقيقة. بعد هذا، وزيادة السرعة إلى 12 م / دقيقة والسماح للفئران لإنهاء البروتوكول. من المهم أن جميع الفئران استكمال بروتوكول تشغيل كامل.
   
   ملاحظة: في حالة الفئران MDX تحتاج فترات الراحة، والنظر في الاحماء قبل ممارسة بروتوكول 30 دقيقة. يتكون هذا الاحماء دورة: فترة التأقلم 2 دقيقة بسرعة 4 م / دقيقة، تليها مباشرة والودية 8 دقائق في 8 متر / دقيقة.
   
   
   في أيدينا الفئران MDX الإناث 4-16 أسبوع من العمر قادرون على استكمال بروتوكول ممارسة 30 دقيقة من دون يستريح. وذكر آخرون أن في سن المتطابقة الفئران MDX الذكور 45٪ من الفئران لا تحتاج إلى فترات الراحة لإنهاء العملية. بروتوكول الاحماء تقللو كمية من توقف ^12.

Results

قوة قبضة forelimb من نوع البرية والفئران MDX يزيد تتراوح أعمارهم ما بين 4-12 أسابيع، ويقلل من جديد في الفئران الأكبر سنا. يمكن بالفعل لوحظ ضعف في القوة في الفئران MDX الشباب. وتظهر بيانات تمثيلية من الفئران الإناث 9 الاسبوع القديمة في أرقام 1A و 1 ب. على الرغم من التعب لا تختلف بين سلالات حتى الآن في هذا العصر، الفئران MDX أضعف من الفئران نوع البرية. ليس لدينا بيانات حتى الآن على فتور في MDX السن والنوع البري ال...

Discussion

الاختبارات الفنية المعروضة هنا هي استنساخه، وسهلة لأداء وتنطبق على نوع البرية والفئران التصنع مستقلة عن سنهم. الاختبارات توفير أدوات مفيدة لتقييم ما قبل السريرية وظيفة العضلات، والقوة، والشرط، والتنسيق. عند اختبار آثار مركب على التاريخ الطبيعي للمرض، ووصف الاختبارات موسع هنا (قوة قبضة forelimb، سواء شنقا الاختبارات واختبار rotarod) ويمكن الجمع بين طيف في نظام اختبار وظيفي حيث يتم تنفيذ هذه الاختبارات في أيام متتالية . هذه البروتوكولات ليست ضارة على الفئران MDX، ويمكن استخ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
مقياس قوة قبضة الماوس	Chatillon DFE (أعيد بيعه بواسطة Columbus Instruments)	# 80529
سلك معلق 2 جهاز أطراف	شماعات قماش أو جهاز
سلك معلق 4 أطراف: جهاز	غطاء قفص الفئران أو جهاز
Rotarod	Ugo Basil	# 47600
جهاز المشي للفئران Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM