عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية

متشابك N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات (NMDARs) تلعب دورا حاسما في اللدونة متشابك وبقاء الخلية إشارات حين تفعيل NMDARs extrasynaptic يمكن أن تؤدي إلى تنكس عصبي وموت الخلايا. هذه التغيرات تعتمد على / النشاط المنظم لرقابة مشددة التعبير الجيني يتوقف وبالتالي تتطلب التواصل المستمر بين نقاط الاشتباك العصبي أو التشعبات وتنشيط نواة ^7. خطة عمل البحر المتوسط ​​تحركات ERK1 / 2 هي المستجيبات المصب من NMDARs متشابك الإشارات ويشاركون في NMDAR-يسببها تفعيل التعبير الجيني، في حين يشير عبر NMDAR extrasynaptic لا يوجد لديه أو لها تأثير كابح بشكل خاص على ERK1 / 2 النشاط ^8،11.

هناك عدد من البروتينات التي ثبت أنها مكوكية بين التشعبات القاصي والنواة. العديد من هذه البروتينات تحتوي على إشارة توطين النووية ويتم نقلها بنشاط على طول microtubuli في داينين ​​وبطريقة تعتمد على importin إلى النواة ^6،9. Interestinglذ، بعض هذه رسل عبور فقط إلى النواة في الاستجابة للمؤثرات متشابك محددة. على سبيل المثال، التي يسببها النقل الوراء من دوري AMP عنصر استجابة ملزمة البروتين 2 (CREB2) من خلال LTD الكيميائي ولكن ليس LTP ^12. المحلية التي تعتمد على التحفيز NMDAR متشابك يقود التنظيم CREB coactivator النسخي (CRTC1) في النواة، وهي عملية النبات، التي تشارك في اللدونة الحصين على المدى الطويل ^4. وقد تبين مؤخرا أن رسول البروتين يعقوب translocates إلى النواة بعد كل وتفعيل NMDAR متشابك وextrasynaptic وينظم CREB النسخ الجيني يعتمد ^5. يتم ترميز أصل متشابك أو extrasynaptic للإشارة إلى تعديل ما بعد النقل يعقوب. النشاط متشابك يدفع ERK1 / 2 الفسفرة تعتمد يعقوب في سيرين حاسمة في الموقف 180 (pJacobS 180) الذي هو شرط مسبق لاحق إزفاء إلى النواة في الثقافة الحصين الابتدائية. وعلاوة على ذلك، طن الخلايا العصبية CA1 من شرائح الحصين الحادة pJacobS 180 translocates إلى النواة بعد شافر ضمانات LTP لكن ليس LTD ^1،10. pS180 يعقوب يؤدي إلى زيادة التعبير عن الجينات المرتبطة اللدونة وهذا التعبير الجيني يغذي العودة إلى وظيفة متشابك. في تناقض حاد، يعقوب أن translocates إلى النواة بعد لم يتم تفعيل فسفرته NMDARs extrasynaptic في Ser180 و قد تترافق مع مجمع بروتين مختلفة في النواة مما تسبب في "CREB ايقافها" وتراجع من الاتصالات متشابك ^10.

أجريت معظم الدراسات المنشورة على استيراد النووي-synapto النووي البروتين رسول في الثقافات الأولية العصبية فصلها. لذا سيكون من المثير للاهتمام أن نرى ما اذا كان يمكن تكرار هذه النتائج في أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الظروف باستخدام شرائح قرن آمون حيث الربط وظيفة الخلايا العصبية هي أفضل بكثير الحفاظ عليها. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لتقييم LTP-ديمعلقة النبات النووي من رسل البروتين immunoblotting. هذا الأسلوب هو أيضا مناسبة لتحليل النشاط الفسفرة تعتمد البروتينات في جزء نووي بدائي. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي يتضمن إعداد الحادة شرائح CA1 الحصين، التعريفي، وتسجيل LTP. بعد ذلك، يتم تشريح المنطقة CA1 مجهريا لعزل المنطقة حفز. ونحن معا وتعديل البروتوكول لعزل النووية التي تقدمها CellLytic النووية استخراج كيت مع التغييرات التي أدخلها تشاو وزملاؤه ^17. ويشمل الإجراء الأمثل تحلل من المناطق CA1 تشريح في المخزن منخفض التوتر السماح تورم الخلية وإطلاق نوى. يمكن تحديد تحلل الخلايا وأنويتها مورفولوجيا عن طريق الفحص المجهري. ويتحقق تخصيب اليورانيوم بواسطة الطرد المركزي خطوة قصيرة. Immunoblotting مع تحليل الأجسام المضادة ضد NeuN وNSE2، وعلامات محددة من الكسور النووية أو عصاري خلوي، يشير إلى أن هذا النهج يمكن أن تستخدم بسرعةوبروتوكول استنساخه لعزل هذه الكسور التحت خلوية ودراسة تعديلات ما بعد النقل عطوب جدا مثل البروتين الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب هو مفيد للعينات الأنسجة الصغيرة المستمدة من مناطق CA1 تشريح شرائح قرن آمون، ويمكن استخدامها في تركيبة لالمناعية من شرائح قرن آمون.

1. إعداد الحاد الحصين شرائح من دماغ الفئران الكبار

1. تخدير الفئران مع isoflurane. تنبيه: تنفيذ الإجراء باستخدام exicator مغلق، لا يستنشق الأيزوفلورين. تأكد من أن الحيوان هو تخدير تماما.
2. قطع رأس الفئران، وسرعان ما عزل الدماغ، وتزج به في precarbonated (95٪ O _2/5٪ CO ₂ خليط الغاز) الجليد الباردة حل Gey في (تكوين في ملي: 130 كلوريد الصوديوم، و 4.9 بوكل، 1.5 CaCl ₂ · 2H ₂ O 0.3 MgSO ₄ · 2H ₂ O، 11 MgCl ₂ · 6H ₂ O، 0.23 KH ₂ PO _4، 0.8 نا ₂ هبو ₄ · 7H ₂ O، 5 الجلوكوز · H ₂ O، 25 HEPES، 22 NaHCO _3، ودرجة الحموضة 7.32) لمدة 30 دقيقة ^{1،2،10،16.}
3. إزالة المخيخ وجزء من القشرة المخية الأنفية الداخلية. فصل نصفي الكرة الأرضية القشرية مع خفض منتصف السهمي، ثم وضع كل نصف الكرة أسفل على سطحه وسطي. جعل بعد ذلكو50-70 ° قطع (50-70 درجة عرضية) على طول حافة الظهرية كل نصف الكرة ^13،14.
4. الغراء كل نصف الكرة مع سطح قطع طازجة على منصة تشريح للنظام باجتزاء. يجب تغطية منصة بواسطة precarbogenated حل Gey في الجليد الباردة.
5. قطع 350 ميكرون 50-70 ° شرائح عرضية من الجانب الأمامي إلى الخلفي باستخدام vibratome تعديلها للحد من محور ض التذبذب. سوف تشكيل الحصين، والقشور مرفدي المخية الأنفية الداخلية، فضلا عن القشور التي تقع ظهراني جانبي لالحصين أن تكون جزءا من شرائح المستخدمة في التجارب ^13،14.
6. نقل شرائح الحصين إلى U-شكل والمغمورة نوع الحاضنة واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة عند 32 درجة مئوية مع carbogenated السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF يحتوي في ملي: 110 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2.5 CaCl ₂ · 2H ₂ O، 1.5 MgSO ₄ · 2H ₂ O، 1.24 KH ₂ PO _4، 10 الجلوكوز · H ₂O، 27.4 NaHCO _3، ودرجة الحموضة 7.3) ^{1،2،10،16.}

2. وضعية أقطاب، الاساس تسجيل، وتحريض LTP

1. نقل شريحة الحصين إلى الغرفة المغمورة نوع تسجيل شنت تحت المجهر. يروي (6-7 مل / دقيقة) مع ACSF carbogenated لا يقل عن 30 دقيقة في 32 درجة مئوية.
2. إعداد الميكروية الشعرية زجاجية مملوءة ACSF (المقاومة هي غيض MΩ 3-5).
3. وضع الميكروية زجاجية مملوءة ACSF في الألياف CA1 شافر-ضمانات لتحفيز وفي المشععة CA1 الطبقة لfEPSP تسجيل ^1،2،10 (الشكل 2). المسافة بين الأقطاب يجب أن يكون حوالي 300 ميكرون.
4. استحضار الحقل مثير بعد المشبكي إمكانيات (fEPSPs) من خلال تحفيز ألياف شافر-ضمانات مع نبضات الحالية مستطيلة ثنائية الطور (200 ميللي ثانية / قطبية) في مجموعة من 3-4 V.
5. أداء أقصى اختبار التحفيز عن طريق قياس INPالعلاقة التحرير والمخرجات وتحدد قوة التحفيز إلى 40٪ من القيم fEPSP المنحدر القصوى التي تم الحصول عليها وابقائها ثابتة طوال التجربة.
6. بدء تسجيل خط الأساس لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد أقصى اختبار التحفيز. قياس الاستجابات لاختبار محفزات كل دقيقة في كافة مراحل التجربة. أداء التسجيلات الأساسية مع التحفيز التردد المنخفض.
7. تسجيل خط الأساس لمدة 30 دقيقة على الأقل.
8. لوقت متأخر من LTP تحريض تطبيق عالية التردد 100 هرتز تكزيز تتألف من ثلاثة قطارات التحفيز 1 ثانية عند 100 هرتز مع فاصل زمني intertrain 5 دقائق. لزيادة مجال التحفيز داخل المنطقة CA1 5 ميكرومتر bicuculline يمكن غسلها في 2 دقيقة قبل تكزيز ويجب غسلها على الفور بعد تكزيز الماضية.

3. جمع شرائح بعد تحريض LTP والتقط التجميد

1. توقف LTP تسجيل 2 دقيقة أو 30 دقيقة بعد ثلاثة قطارات من التحفيز كزازي حمل في وقت متأخر من LTP.
2. جمع كل شريحة في أنبوب 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

4. عزل المخصب الكسور النووية من المنطقة CA1 من الحصين

1. أخذ 1.5 مل أنابيب إيبندورف مع شرائح المجمدة من -80 ° C والاحتفاظ بها على الجليد.
2. إضافة 0.5 مل من TBS العازلة التي تحتوي على الأنزيم البروتيني الطازجة الباردة (PI) والفوسفاتيز (PS) مثبطات، في أنبوب. احتضان لمدة 2-3 دقيقة ونقل إلى stereomicroscope. تنبيه: استخدام القفازات الواقية ومعطف المختبر بينما كان يعمل مع PI وPS.
3. تشريح المنطقة الهرمية CA1 من الطبقة الحصين باستخدام اثنين من الإبر. استخدام إبرة واحدة لعقد شريحة تحت stereomicroscope والإبرة الثانية لقطع المنطقة CA1.
4. جمع CA تشريح1 مناطق من 5 شرائح (لكل مجموعة) في أنبوب جديد 1.5 مل تحتوي على 50 ميكرولتر تحلل العازلة (1X منخفض التوتر تحلل العازلة التي تحتوي في ملي: 10 HEPES، 1.5 MgCl _2، 10 بوكل، ودرجة الحموضة 7.9، مع PI وPS). لاحظ أن هذه الكمية من المواد ستكون كافية لتشغيل immunoblots 2-3.
5. التجانس الأنسجة التي جمعتها دقيق يصل pipetting لوهبوطا. استخدام ماصة 200 ميكرولتر. احتضان المحللة على الجليد لمدة 5-7 دقيقة للسماح للخلايا لتنتفخ.
6. تأخذ 2 ميكرولتر من المحللة، وانخفاض على شريحة مجهرية، وتصور تورم الخلايا تحت المجهر حقل مشرق. مع تورم السليم للخلايا تظهر نواة جولة وهياكل سليمة.
7. جمع 20 ميكرولتر من العينة في أنبوب 1.5 مل جديدة باسم 'جزء جناسة. إضافة 8 ميكرولتر من تغيير طبيعة 4x وSDS عينة العازلة.
8. الطرد المركزي لست] المتبقية في 11،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
9. جمع بعناية طاف من أعلى ('جزء عصاري خلوي')، آرansfer في أنبوب جديد وإضافة 20 ميكرولتر من العينة 4X العازلة.
10. Resuspend وبيليه في 60 ميكرولتر من العازلة منخفض التوتر وإضافة 20 ميكرولتر من 4x وعينة العازلة. ويشار إلى هذا الكسر ك "جزء التخصيب النووي".
11. جناسة، عصاري خلوي، والكسور التخصيب النووية يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة immunoblotting لاحق.

5. Immunoblotting نصف كمي للSynapto البروتينات النووية

1. Defreeze العينات وسلقها لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
2. تأخذ 5 ميكرولتر من كل جزء وتحديد تركيز البروتين بواسطة amido اختبار أسود أو اختبار BCA.
3. تحميل كمية مساوية من عينات البروتين من جناسة، والكسور حشوية والنووية المخصب على SDS-PAGE. ينبغي أن توضع عينات من السيطرة وشرائح LTP على نفس هلام للمقارنة المباشرة.
4. تنفيذ إجراء النشاف الغربي القياسية (يوصى نقل الرطب).
5. بحث الأغشية مع تي انه الأضداد في الاختيار. في وقت لاحق من نفس البقع (أو نفس العينات بالتوازي) يمكن بحثها مع علامة حشوية - enolase2 الخلايا العصبية محددة (NSE2) وعلامة النووية - NeuN والأجسام المضادة -actin كما تحكم التحميل.

تحليل البيانات 6.

1. كفاءة LTP الاستقراء يمكن تحليلها بواسطة برنامج Clampfit. تمت مقارنة متوسط ​​المنحدر من التسجيلات الأساسية مع المنحدرات بعد تكزيز باستخدام اتجاهين أنوفا، ف <0.05 اعتبر اختلافا كبيرا. وقد تم تصوير القيم المنحدر fEPSP في المخططات كما يعني ± SEM
2. لتقدير حجم immunoblots والمسح إما فيلم autoradiographic وتحليل كثافة متكاملة من العصابات البروتين يماغيج أو العصابات مضان مع نظام Licor. يجب تطبيع قيم عصابات مناعيا لمراقبة التحميل والنشاف. للمقارنة بين السيطرة والجماعات LTP على nonparametrical مان ويتني U للتجارب يمكن استخدامها.

الجدول 1. المخازن.

لقد أظهرنا سابقا أن للsynapto النووي البروتين رسول يعقوب يتراكم في النواة بعد تحريض LTP لكن ليس LTD 1. وعلاوة على ذلك، إزفاء يعقوب بعد التحفيز متشابك يتطلب تفعيل MAPK ERK1 / 2 و الفسفرة يعقوب في Ser180 (الشكل 1). فسفرته يعقوب translocates إلى النواة بطريقة تعتمد على importin ويمكن الحفاظ على الدولة فسفرته على مدى فترات طويلة من الزمن من قبل بالتعاون مع خيوط وسيطة αinternexin 15 (الشكل 1). الدولة-الفوسفات يعقوب مهمة للتعبير عن الجينات التي تعتمد على النشاط وبقاء الخلية. ومن المثير للاهتمام، وتفعيل NMDARs extrasynaptic يدفع أيضا يعقوب في النواة ولكن في هذه الحالة يعقوب ليس فسفرته في Ser180 وتراكم النووي يدفع CREB "اغلاق" 5،10. تم الحصول على النتائج المذكورة أعلاه protocoليرة سورية أنشئت في دراستنا الأخيرة (انظر كاربوفا آخرون (10) لوصف تفصيلي للنموذج).

لإثبات أن يعقوب translocates الى نواة بعد تحريض LTP، فإننا يسببها وقياس تحريض شافر ضمانات fEPSP التقوية في شرائح الحصين الحادة وعزل نواة الخلايا العصبية من الخلايا العصبية CA1 في وقت لاحق (الشكلان 2 و 3). قارنا نقطتين زمنية مختلفة بعد تطبيق التحفيز عالية التردد (2 دقيقة و 30 دقيقة) وسجلت تحريض LTP لكل شريحة التي تم معالجتها في وقت لاحق لعزل النووية والغربية النشاف (الشكلان 2 و 3). ويمكن رؤية إثراء علامة النووية NeuN العصبية في جزء التخصيب النووي أعدت من المنطقة CA1 تشريح، في حين enolase2 محددة عصاري خلوي علامة الخلايا العصبية (NSE) موجود معظمها في جزء طاف الحصول عليها بعد الطرد المركزي هي lysed جملتعلمي (الشكل 4A). وقد اتسمت بخصوصية pS180 يعقوب الأجسام المضادة سابقا (لمزيد من التفاصيل انظر كاربوفا وآخرون 10). وظلت مستويات pS180 يعقوب دون تغيير في إجمالي الخليط البروتين CA1 وفي النووي المخصب جزء 2 دقيقة بعد تكزيز (الشكل 4B)، ولكن وجدنا زيادة كبيرة في pJacobS 180 مناعية 30 دقيقة بعد تحريض LTP (الشكل 4C)، مؤكدا أن يعقوب translocating إلى النواة في هذا النموذج اللدونة الخلوي هو فسفرته في Ser180.

الرقم 1. فسفرته يعقوب في S180 بترميز أصل متشابك من إشارات NMDARs. التحفيز كزازي من قرن آمون شافر الألياف ضمانات النتائج في تفعيل NMDARs متشابك وتفعيل لاحق من MAPKERK1 / 2 يشير التعاقبي. ERK1 تنشيط / 2 بربط وphosphorylates يعقوب في سيرين 180 ويعقوب-ERK1 / 2 مجمع translocates إلى النواة وهذا يرتبط مع تعزيز النشاط CREB وتفعيل اللدونة ذات الصلة التعبير الجيني.

الرقم 2. المعدات والأدوات المستخدمة لLTP تحريض وتشريح المنطقة CA1 من شرائح قرن آمون. A) Vibratome تستخدم لإعداد شرائح الحصين الحادة (1 - Vibratome) B1-2) الكهربية والإعداد والتصوير (2 - المجهر، 3 - مياداة مجهرية ونظام نضح، 4 - إعادة ترميز القطب، 5 - التحفيز الكهربائي، 6 - المياه عدسة الهدف ، 7 - حامل شريحة مع شريحة الحصين) C) معدات تستخدم لتشريح المنطقة CA1 من شرائح قرن آمون (8. ستيرeomicroscope. 9 - حقنة الأنسولين مع الإبر. 10 - مقص صغير الجراحية، 11 - المبضع، 12 - بلاستيك باستور ماصة بتاريخ 13 - ملعقة رقيقة، 14-100 مم طبق الثقافة بلاستيكية مملوءة بالماء الجليد، و 40 ملم صحن الثقافة البلاستيكية المستخدمة للتشريح شرائح.

الرقم 3. الكرتون يدل على إجراء التجارب. أرقام تشير الخطوات في البروتوكول. 2،1-2،8) إن شريحة الحصين الحادة في غرفة مغمورة مع أقطاب الزجاج وضعت في الطبقة المشععة لالتقوية من شافر ضمانات-CA1 نقاط الاشتباك العصبي. أقحم يمثل آثار التناظرية عينة fEPSP، يشير شريط أفقي 5 ميللي ثانية، ويشير الشريط العمودي 0.5 بالسيارات. 3.3) وقد تم جمع شرائح إلى 1.5 مل أنابيب بعدتسجيل LTP والمفاجئة المجمدة. 4.3) تشريح المنطقة CA1 من شرائح قرن آمون الفئران البالغة. 4،4-4،5) يتجانس الخليط المناطق CA1 في تحلل العازلة منخفض التوتر، والذي يسبب تورم التناضحي من الخلايا والافراج عن نوى. 4.8) الطرد المركزي من 11،000 دورة في الدقيقة لست] في مدة 1 دقيقة. 4.10) جمع الكسور حشوية والنووية المخصب لimmunoblotting. 5.3) تحميل الكسور حشوية والنووية المخصب على SDS-PAGE واللاحقة القياسية الغرب النشاف.

الرقم التعريفي 4. من CA1 LTP يؤدي إلى تراكم pJacS180 في النواة. A) طخة مناعية لجناسة، عصاري خلوي والكسور التخصيب النووية من CA1 المحللة بحث مع عصاري خلوي وعلامات النووية. B) تحليل طخة مناعية من مستوى pJac-S180 جناسة في 2 دقيقة و 30 دقيقة بعد ايندوction من تكزيز. C) تحليل طخة مناعية من مستوى التخصيب النووي في pJacS180 جزء 2 دقيقة ودقيقة بعد تكزيز. هذه النتائج هي جزء من الرسم البياني الكمي نشرت في كاربوفا وآخرون 10. لا يتم تضمين هذه immunoblots تمثيلي في لالمنشور الأصلي.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.