نحن نقدم بروتوكول مفصلة لتحريض التقوية على المدى الطويل في المنطقة CA1 من الحصين والعزلة اللاحقة الكسور التخصيب النووية من منطقة tetanized للشريحة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد النشاط يعتمد استيراد البروتين النووي في النماذج الخلوية التعلم والذاكرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل CA1 النووي المخصب الكسور من شرائح الحصين لدراسة تعتمد على نشاط استيراد النووية من رسول البروتينات Synapto النووية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
دراسة نشاط البروتين يعتمد التعبير، إزفاء التحت خلوية، أو الفسفرة ضروري لفهم الآليات الخلوية الكامنة وراء اللدونة متشابك. تحظى بقبول واسع التقوية طويلة الأمد (LTP) والاكتئاب الطويل الأمد (LTD) المستحثة في شرائح الحصين الحادة كنماذج الخلوية التعلم والذاكرة. هناك العديد من الدراسات التي تستخدم التصوير الخلية المناعية أو النهج الحية لتصور النشاط ديناميات البروتين تعتمد. لكن هذه الطرق تعتمد على مدى ملاءمة الأجسام المضادة للمناعية أو overexpression من البروتينات الموسومة مضان في الخلايا العصبية واحدة. Immunoblotting من البروتينات هو طريقة بديلة توفير تأكيد مستقل للنتائج. العامل المحدد الأول في إعداد الكسور التحت خلوية من شرائح قرن آمون tetanized الفردية هو كمية قليلة من المواد. ثانيا، إجراء معالجة أمر بالغ الأهمية لأن التلاعب حتى قصيرة جدا وبسيطة للترتعيشان شرائح قد تتسبب في تنشيط بعض أجهزة الطرد المركزي الإشارات. نحن هنا وصف لسير العمل الأمثل من أجل الحصول على كمية كافية من نسبة التخصيب النووي من النقاء ما يكفي من المنطقة CA1 من شرائح الحصين الحادة من دماغ الفئران. كمثال التمثيلي وتبين لنا أن شكل فسفرته للsynapto النووي البروتين رسول ERK1 / 2 يعقوب translocates بنشاط إلى النواة على تحريض LTP ويمكن الكشف في جزء التخصيب النووي من الخلايا العصبية CA1.
المقدمة
متشابك N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات (NMDARs) تلعب دورا حاسما في اللدونة متشابك وبقاء الخلية إشارات حين تفعيل NMDARs extrasynaptic يمكن أن تؤدي إلى تنكس عصبي وموت الخلايا. هذه التغيرات تعتمد على / النشاط المنظم لرقابة مشددة التعبير الجيني يتوقف وبالتالي تتطلب التواصل المستمر بين نقاط الاشتباك العصبي أو التشعبات وتنشيط نواة 7. خطة عمل البحر المتوسط تحركات ERK1 / 2 هي المستجيبات المصب من NMDARs متشابك الإشارات ويشاركون في NMDAR-يسببها تفعيل التعبير الجيني، في حين يشير عبر NMDAR extrasynaptic لا يوجد لديه أو لها تأثير كابح بشكل خاص على ERK1 / 2 النشاط 8،11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الحاد الحصين شرائح من دماغ الفئران الكبار
- تخدير الفئران مع isoflurane. تنبيه: تنفيذ الإجراء باستخدام exicator مغلق، لا يستنشق الأيزوفلورين. تأكد من أن الحيوان هو تخدير تماما.
- قطع رأس الفئران، وسرعان ما عزل الدماغ، وتزج به في precarbonated (95٪ O 2/5٪ CO 2 خليط الغاز) الجليد الباردة حل Gey في (تكوين في ملي: 130 كلوريد الصوديوم، و 4.9 بوكل، 1.5 CaCl 2 · 2H 2 O 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O، 11 MgCl 2 · 6H 2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد أظهرنا سابقا أن للsynapto النووي البروتين رسول يعقوب يتراكم في النواة بعد تحريض LTP لكن ليس LTD 1. وعلاوة على ذلك، إزفاء يعقوب بعد التحفيز متشابك يتطلب تفعيل MAPK ERK1 / 2 و الفسفرة يعقوب في Ser180 (الشكل 1). فسفرته يعقوب translocates إلى النواة بطريقة تعتمد على importin ويمكن الحفاظ على الدولة فسفرته على مدى فترات طويلة من الزمن من قبل بالتعاون مع خيوط وسيطة αinternexin 15 (الشكل 1). الدولة-الفوسفات يعقوب مهمة للتعبير عن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوات المذكورة في البروتوكول فوق إرشادات كيفية تحضير شرائح الحصين الحادة من الشباب أو الكبار الفئران، لحث وسجل LTP، تشريح بسرعة منطقة حفز شريحة، وإعداد جزء التخصيب النووي لدراسة نشاط ديناميات البروتين تعتمد. هذا النهج مستمد من مزيج من عدة أساليب مختلفة تستخدم بشكل مستقل عن بعضها البعض. نحن الأمثل لسير العمل وتوفير التفاصيل الكافية للمبتدئين لإقامة التجارب الخاصة بها لدراسة إعادة توزيع التحت خلوية من البروتينات على تحريض LTP. كمثال علينا أن نبرهن على شكل الراحل LTP الحث على تراكم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل DFG (SFB 779 TPB8 ، Kr1879 / 3-1 MRK) ، منحة DIP (MRK) ، الاتحاد الأوروبي FP7 MC-ITN NPlast (MRK) ، مركز علوم الدماغ السلوكية (CBBS ، Sahsen-Anhalt) ، (AK و SB) ، MM حاصلة على زمالة طويلة الأجل من المنظمة الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) وماري كوري IEF.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
recodes < / strong>فأر فأر
مصنوعة جراحي صغير ملعقة بلاستيكية باستور دورق بنسن < td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Equipment< / strong> | |||
| CED 1401 AD / DA محول | Cambridge Electronics Design ، المملكة المتحدة | ||
| Stereomicroscope< / a> | Leica S4E ، ألمانيا | ||
| Vibrotome | Leica VT1000S ، ألمانيا | ||
| محفز النبض المعزول | AM الأنظمة ، الولايات المتحدة الأمريكية | موديل 2100 | |
| جهاز طرد مركزي | حراري علمي | ||
| نظام SDS-PAGE | Biorad | ||
| Cooler | Julabo | ||
| مجهر المجال الساطع | نيكون Eclipse TS100 | ||
| حاضنة ثقافة الخلية | Thermo Electron Corporation | ||
| Micromanipulator | Luigs & أمبير Neumann ، SM-5 ، ألمانيا | ||
| غرفة النشاف ومورد الطاقة الكهربائية | Hoefer Scientific Instruments ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا | ||
| غرفة تسجيل من النوع المغمور | حسب الطلب | ||
| على شكل حرف U وحاضنة من النوع المغمور ؛ | حسب الطلب | ||
| مقص | |||
| مشرط | |||
| رقيقة | |||
| ماصة | |||
| طبق ثقافة بلاستيكي ؛ | |||
| حقنة | |||
| NaCl | Roth | Art.-Nr.3957.1 | &ge ؛ 99.5٪ ، PA ، ACS ، ISO |
| KCl | Roth | Art.-Nr.6781.1 | & ge ؛ 99.5٪ ، سنويا ، ACS ، ISO |
| CaCl 2< / sub> middot ؛ 2H2O | Merck | 1.02382.0500 | pro analysis |
| MgSO4· 2H2O | Merck | 5886.05 | pro analysis |
| MgCl2· 6H2O | AppliChem | CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO: 2320946 | للبيولوجيا الجزيئية |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | للبيولوجيا الجزيئية |
| Na2HPO4& middot; 2H2O | Merck | 1.06574.1000 | |
| جلوكوز نقي إضافي & middot; H2< / sub>O | Roth | Art.-Nr.6887.1 | للبيولوجيا الجزيئية |
| HEPES | Roth | Art.-Nr.9105.4 | PUFFERAN, & ge ; 99.5٪ سنويا |
| NaHCO3< / sub> | Merc | 1.06329.1000 | التحليل الاحترافي |
| كوكتيل مثبط الإنزيم | Roche | ||
| Phosphostop | Roche | ||
| Bicuculline | Tocris Bioscience | ||
| Isoflurane | Baxter | ||
| antibodies < / strong> | |||
| الأجسام المضادة الأولية | رقم كتالوج | الشركة | الأنواع |
| pJac-s180 | أرنب Biogenes | (مخفف 1: 100) | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | (مخفف 1: 1،000) أرنب |
| إشارات خلية | NSE D20H2 | (مخفف 1: 1،000) | |
| بيتا أكتين | سيجما | A-5441 | (مخفف 1: 5،000) |
| الأجسام المضادة الثانوية | رقم كتالوج | الشركة | الأنواع |
| IgG HRP المترافق | DAKO | الماعز المضاد للفأر (1: 5،000) | |
| IgG HRP المترافق | NEB | الماعز المضاد للأرانب (1: 5،000) |
المراجع
- Behnisch, T., et al. Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression. PLoS One. 6 (2), e17276(2011).
- Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
