Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وارتفاع تريتون X-100 تركيزات مراعاة هذه الهياكل الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الملتصقة في ثقافة الحفاظ على حالة الاستقطاب لدعم الحركة والتفاعلات بين الخلايا. Nanopodia هي رقيقة، ممدود، إلى حد كبير، F-الأكتين سلبية التوقعات في غشاء الخلايا البطانية والسرطان الذي يمكن تصور خلال TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) المناعي تلطيخ. مجموعات TM4SF1 في 100-300 ميكرون قطر TMED (TM 4SF1 ه nriched omains د الصغرى) التي تحتوي على 3 إلى ما يصل إلى 14 فرد TM4SF1 الجزيئات. يتم ترتيب TMED بشكل متقطع على طول nanopodia في تباعد العادية من 1-3 TMED في μ م وترسيخ nanopodia إلى المصفوفة. وهذا يتيح nanopodia تمديد أكثر من 100 μ م من قيادة الجبهة أو زائدة الجزء الخلفي من الخلايا البطانية أو ورم الاستقطاب، ويسبب بقايا الغشاء أن تترك وراءها على MATRالتاسع عندما يتحرك الخلية بعيدا. تم التغاضي TMED وnanopodia بسبب هشاشتها الشديدة والحساسية لدرجة الحرارة. غسل الروتينية وتعطيل تثبيت الهيكل. يتم الاحتفاظ Nanopodia من قبل التثبيت المباشر في بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية، تليها التعرض قصيرة إلى 0.01٪ تريتون X-100 قبل تلطيخ. Nanopodia فتح آفاقا جديدة في بيولوجيا الخلية: يعدون لإعادة تشكيل فهمنا لكيفية خلايا الشعور بيئتهم، كشف وتحديد الخلايا الأخرى على مسافة، والشروع في التفاعلات بين الخلايا في اتصال وثيق، وآليات الإشارات المشاركة في الحركة، والانتشار، والخلية الاتصالات الخلية. قد تكون الأساليب التي يتم تطويرها لدراسة nanopodia TM4SF1 المستمدة من المفيد للدراسات nanopodia التي تشكل في أنواع الخلايا الأخرى من خلال وكالة tetraspanins الكلاسيكية، ولا سيما CD9 أعرب بتواجد مطلق، CD81، وCD151.
المقدمة
خلال الاستقطاب للحركة، والخلايا الحيوانية توسيع مجموعة متنوعة من الديناميكية، نتوءات غشاء من سطوحها، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية، أقدام صفاحية والألياف التراجع، والكشكشة 1. تمت إضافتها مؤخرا إلى هذه القائمة كانت nanopodia، وهو نوع المعترف بها حديثا رقيقة (100-300 ميكرون في القطر)، ممدود (50-100 ميكرون تصل إلى الطويل) الغشاء الذي الإسقاط توفير قنوات الغشاء لتمديد الهياكل F-الأكتين مثل أرجل كاذبة خيطية والألياف التراجع، وأنه وصمة عار بإيجابية مع TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) في البطانية والورم الخلايا المستزرعة 2،3.
TM4SF1 هو بروتين مع مثل tetraspanin طوبولوجيا التي كانت تعرف أصلا باعتبارها مستضد الخلايا السرطانية 4 قبل اكتشاف جزيء أن العلامات البيولوجية هو الخلايا البطانية التي تلعب دورا أساسيا في تكاثر الخلايا البطانية والهجرة 2،3. وكشف المناعي تلطيخ أن TM4SF1 المترجمة إلى perinucالحويصلات ولير لغشاء البلازما، ويتم تخصيبها في TM 4SF1 ه nriched omains د الدقيقة (TMED). TMED مرساة nanopodia إلى matrix والحاضر في نمط النطاقات متباعدة بصورة منتظمة من 1-3 طول TMED / ميكرون من nanopodia. Nanopodia تمتد عادة من الأمام مما يؤدي خلية وراء خلية الخلفية خلال الاستقطاب للحركة. نظرا لطبيعة ملتصقة شركة من TMED، nanopodia غير قادرين على التراجع مرة أخرى إلى الخلية وهو يتحرك بعيدا؛ وبالتالي التخلي عن بقايا nanopodia تتبع خارج مسار الحركة الخلوية. Nanopodia توفير قنوات لتمديد غشاء F-الأكتين والتراجع، والمواقع هي من التفاعلات بين الخلايا والاتصالات 2،3. هذه الخصائص يعني أن nanopodia توفير فرصة فريدة لدراسة الآليات الكامنة وراء التجمع F-الأكتين خلال الاستقطاب الخلوية، والاستشعار الخلوية للبيئة، وتحديد مسار واتجاه حركة الخلية، والتفاعلات بين الخلايا والثانية الاتصالات.
نظرا لطبيعة مسعور للغاية من TMED وطبيعة الغشائي رقيقة وهشة من nanopodia، يحتاج إلى رعاية خاصة التي يتعين اتخاذها من أجل الحفاظ على TMED وnanopodia. تدمير nanopodia وإزالة TMED بالطرق المختبرية الشائعة هي الأسباب المحتملة لماذا ظهرت المنشورات ثلاث وستين فقط على TM4SF1 منذ أول اكتشاف لها في عام 1986 1 والافتقار التام إلى معرفة تخصيب TM4SF1 في 100-300 ميكرون microdomains على سطح الخلية حتى تقرير TM4SF1 في الخلايا البطانية في عام 2009 2.
أساليب المناعية التقليدية عادة ما تستخدم المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، الأسيتون أو لإصلاح الخلايا واستخدام 0.1٪ أو أعلى تركيز تريتون X-100 لpermeabilize الخلايا 5. تنفيذ الدراسات وصفها هنا ثلاثة تغييرات كبيرة في الطريقة التقليدية للكشف عن TMED وnanopodia: (ط) استخدام 37 درجة مئوية 4٪ PFA وإصلاح الخلايا في 3776؛ مئوية الحاضنة، (ب) تطبيق لطيف درجة حرارة الغرفة PBS الغسيل، و (ج) استخدام أقل من 0.03٪ تريتون X-100 فقط لفترة وجيزة لpermeabilize الخلايا قبل إضافة الأجسام المضادة الأولية، كما تريتون X-100 أعلى من 0.03٪ سيتم استخراج TM4SF1.
جميع tetraspanins تشكيل microdomains على غشاء الخلية 6 و بعض colocalize مع TMED في البطانية وخلايا الورم 2،3. كما يتم التعبير عن tetraspanins مثل CD9، CD81، وCD151 بتواجد مطلق، وبروتوكول تلطيخ الموصوفة هنا يمكن أن تمتد إلى العديد من أنواع مختلفة من الخلايا التي تفتقر TM4SF1 للدراسات وظيفة nanopodia.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الثقافة الخلية على الكولاجين المغلفة القرص زجاج
- الأقراص مكان الزجاج (12 مليمتر في القطر) في وعاء زجاجي (4 أوقية) والأوتوكلاف لتعقيم الأقراص.
- وضع 25 مل 70٪ من الإيثانول في أنبوب 50 مل الصقر ووضعه في غطاء ثقافة الخلية. هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات حتى مستوى الحل ينخفض إلى 20 مل.
- وضع ملقط حاد مع نقطة غرامة اضافية في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق قبل استخدامه للتعامل مع القرص الزجاج.
- إزالة بعناية ملقط من الأنبوب وأغلق الغطاء، ثم ضع برفق الإيثانول تعامل ملقط على رأس الأنبوب إلى الهواء الجاف لمدة 2 دقيقة. لا تسمح غيض من ملقط للمس أي شيء في غطاء محرك السيارة.
- استخدام ملقط معقم للاستيلاء على قرص واحد زجاجية معقمة للخروج من جرة الزجاج ووضعه في بئر من 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية. كرر حتى تم ملؤها العدد المطلوب من الآبار مع أقراص.
- وضع 500 ميكرولتر من محلول الكولاجين البقري (50 نانوغرام / مل) في كل بئر يحتوي على قرص من الزجاج ووضعه في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 خلية ثقافة حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ليس هناك ضرر في الحضانة لفترة أطول.
- الحصاد HUVEC (الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان) أو PC3 (الخلايا السرطانية في البروستاتا) التي كانت تزرع بالفعل في 150 ملم وحة الثقافة الخلية من خلال trypsinization ومنع النشاط التربسين باستخدام كاملة المتوسطة ثقافتها. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل الصقر.
- حساب عدد الخلايا والتأكد من جدوى أكبر من 90٪.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
- استخدام مستنبت لتمييع الخلايا إلى 10 5 خلية / مل. وضع الخلايا على الجليد.
- نضح الكولاجين في غطاء محرك السيارة خلية ثقافة ووضع بلطف 500 ميكرولتر من تعليق خلية إلى كل بئر التي تم precoated الأقراص الزجاج مع الكولاجين. سوف 5 × 10 4 خلايا / جيد في 24 لوحة جيدا تعطي 60٪ أسيوطluency لHUVEC و 30٪ confluency للخلايا PC3. ملاحظة: إضافة المزيد من تعليق خلية لأعلى كثافة الخلية.
- ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 6 ساعة، أو 24 ساعة لتتبع أنشطة nanopodia ومرور الخلية. عادة، سوف الخلايا نعلق على القرص الزجاج في أول 30 دقيقة، ثم البدء في استقطاب وتهاجر في الساعة الأولى، وإجراء التفاعلات بين الخلايا وانقسام الخلايا في الساعات التالية.
2. تثبيت الخلية
- كل بئر ستحتاج 500 ميكرولتر PFA 4٪ (بارافورمالدهيد) لإصلاح الخلايا. إما تصنيعها تجاريا أو تقدم طازجة PFA 4٪ يمكن استخدامها. حساب كمية PFA اللازمة استنادا إلى عدد من الآبار على استعداد، ووضع منهاج العمل في أنبوب 15 مل الصقر. تنبيه: امتصاص العرق هو مادة مسرطنة مشتبه بهم.
- وضع أنبوب الصقر في موقف الستايروفوم التي كانت بالفعل في مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية. ترك الأنبوب في الحاضنة لمدة 30 دقيقة إلى الحربم حتى PFA إلى 37 درجة مئوية.
- وضع وسادة التدفئة في غطاء محرك السيارة والثقافة، وتشغيله.
- إخراج 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية وPFA prewarmed للخروج من الحاضنة ووضعه على رأس وسادة التدفئة.
- استخدام يدا واحدة لنضح المتوسطة من بئر، وعلى الفور بعد استخدام اليد الأخرى إلى الشريحة بلطف 500 ميكرولتر PFA في البئر من خلال الحافة جيدا. لتسهيل الطموح، إمالة لوحة الثقافة في حوالي 45 درجة، يميل ضد موقف الستايروفوم بحيث أنها مستقرة في هذه الزاوية. وسوف يسهل هذا الطموح وإضافة PFA حل لالبئر من دون إزعاج الخلايا في الثقافة. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية للحفاظ على بنية الخلية الأصلية للأنشطة الخلية.
- كرر العملية حتى تلقوا جميع الآبار مع قرص الزجاج PFA. ملاحظة: ستكون جميع الخطوات التي تحتاج إلى تغيير الحل موجود مسبقا من البئر تطبيق إجراءات الطموح نفسه.
- وضع لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تأخذ اللوحة إلى غطاء محرك السيارة والثقافة، وإمالة ضد الستايروفوم كما هو موضح في الخطوة 2.5. استخدام يد واحدة لنقل بلطف PFA من البئر في أنبوب جمع؛ استخدام اليد الأخرى لوضع مباشرة بعد ذلك لا يقل عن 500 غرفة درجة الحرارة PBS ميكرولتر في البئر. بعد أن تم غسلها جميع الآبار، والعودة وتكرار الغسيل PBS مرة أخرى في كل جيدا. إفراغ PFA جمعها في وعاء النفايات الخطرة.
- إعداد عازلة تمنع المحكمة الجنائية الدولية بإضافة 2٪ مصل بقري جنيني لبرنامج تلفزيوني. يضاف 0.04٪ أزيد الصوديوم (20٪ من تمييع الحل الأسهم) كمادة حافظة. تنبيه: أزيد الصوديوم هو مركب سام. ويمكن تخزين المخزن المؤقت في 4 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن دون التلوث الجرثومي.
- مع لوحة الثقافة لا يزال يميل ضد موقف، مرة أخرى من خلال كل دورة الشفط جيدا لإزالة برنامج تلفزيوني ومباشرة بعد ذلك بإضافة 500 ميكرولتر من المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة. الخلايا هي الآن جاهزة للتلوين المناعي. إذا لزم الأمر، وخلايا ثابتة يمكن تخزينها في الثلاجة 4 ° C لمدة أسبوع دون خسارة كبيرة من البروتين TM4SF1.
3. TM4SF1 المناعي تلون Nanopodia
- في كل بئر، واستبدال العازلة حجب 500 ميكرولتر المحكمة الجنائية الدولية مع عازلة تمنع جديدة تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. لا تستخدم أعلى من 0.03٪ تريتون X-100 كما أنه سيتم إزالة TM4SF1 من أغشية الخلايا. PBS غسلها الخلايا من الخطوة 2.10 يمكن نقلها مباشرة إلى المخزن المؤقت حجب تحتوي على تريتون إذا كان على استعداد لتلطيخ أن تبدأ على الفور.
- تمييع الأساسية المضادة للTM4SF1 (أو المضادة للCD9) الأجسام المضادة إلى 0.5 ميكروغرام / مل في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة.
- في كل بئر، وإزالة ICC/0.01٪ تريتون العازلة واستبدالها 300 ميكرولتر من الحل لمكافحة TM4SF1 الضد. احتضان 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو ترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- غسل كل بئر مع ما لا يقل عن 500 ميكرولتر PBS. تكرار 3X؛ في كل مرة تعطي في LeAST 5 دقائق من الوقت الحضانة.
- إعداد الأجسام المضادة وphalloidin حل الثانوي في المحكمة الجنائية الدولية عرقلة العازلة، وذلك باستخدام 1،000 مرة التخفيف من اليكسا 488 المسمى حمار مكافحة فأر الضد الثانوية (2 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) و 1،000 س التخفيف من phalloidin (50 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
- إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية وحل phalloidin إلى كل بئر واحتضان لمدة 2 ساعة أو ترك الأمر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تكرار PBS غسل الخطوات مع ما لا يقل عن 5 دقائق في الحضانة غسل. في غسل الماضي، وترك كل بئر في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة.
- إسقاط قطرة واحدة (~ 10 ميكرولتر) من مكافحة تتلاشى تصاعد وسائل الاعلام على شريحة زجاجية.
- منحنى غيض من 19 G 1 ½ حقنة في الإبرة 90 درجة عن طريق الضغط بلطف على سطح صلب. استخدام يد واحدة لعقد إبرة محني ورفع بلطف صعودا قرص الزجاج من البئر، واستخدام اليد الأخرى لفهم القرص باستخدام ملقط حادة.
- تحويل القرص الزجاج و# 160؛ وجهه لأسفل السماح للاتصال الجانب خلية الإعلام متزايدة على شريحة زجاجية. وضع بلطف قرص الزجاج واتركها تجف بين عشية وضحاها في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة.
- انتقل إلى صورة ملطخة nanopodia المناعي، أو تخزين الشرائح في مربع الشريحة في -20 درجة مئوية. ستبقى الشرائح للعرض لمدة بضعة أشهر في -20 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لخطوة 1:
إذا الخلايا (مثل HUVEC وPC3 المستخدمة في هذه الدراسة) هي قادرة على النمو بشكل طبيعي، وسوف نعلق على خلايا القرص المغلفة الكولاجين في غضون 30 دقيقة بعد هم المصنف، استقطاب وتصبح المحمول بعد ذلك بقليل، وتوسيع nanopodia قبل مسيرتهم الحركة. أرقام 1A و 1B يظهر على التوالي على الاستقطاب والانتشار HUVEC. الشكل 2A يظهر خلايا PC3 الاستقطاب في حالة المحمول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Nanopodia قنوات رقيقة الغشاء الخلوي أن نعلق بحزم إلى matrix خلال TMED ويمكن أن تمتد أكثر من 100 ميكرون من خلية المحمول الاستقطاب لاستشعار البيئة والتفاعلات بين الخلايا توسط 2،3. Nanopodia التمسك مصفوفة بقوة حتى يتم ترك مخلفات وراء بينما يتحرك بعيدا الخلية (الشكلان 1 و 2). وبالتالي Nanopodia تسمح لنا لدراسة كيفية خلايا الشعور بيئتهم وتحديد مسار حركة الخلية، وكيفية حركة التغييرات التعبير الجيني أو المخدرات العلاج. ولكن نظرا لهشاشة هذه (10...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن نعترف الدكتور هارولد دفوراك لإجراء مناقشات مفيدة بما في ذلك الاقتراح في محاولة التثبيت في 37 ° C PFA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح P01 CA92644 وبموجب عقد من المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أقراص زجاجية | فيشر سيانتيفك | 12-545-82 | 12 مم |
| جرة زجاجية | فيشر سيانتيفك | 02-912-310 | برطمانات زجاجية شفافة ونظيفة معتمدة ، 4 أوقية |
| شريحة زجاجية | فيشر سيانتيفك | 12-544-1 | شرائح مجهر زجاجي عادي فاخرة |
| من فيشرfinest 50 مل أنبوب فالكون | BD | Falcon 352070 | أنبوب طرد مركزي مخروطي بولي بروبلين عالي الوضوح 50 مل ، تصنيف 16,000 RCF. عقيم. |
| أنبوب صقر 15 مل مع رف الستايروفوم | Corning | 430790 | Corning 15 مل أنابيب الطرد المركزي PP |
| ملقط حاد | فيشر Scientific | 13-812-42 | ملقط مدبب فائق النعومة ملقط |
| 24 بئر لوحة زراعة الخلية | BD Bioscience | 353047 | 24 بئر لوحة زراعة الخلايا |
| 150 مم لوحة زراعة الخلايا | BD Bioscience | 353025 150 مم لوحة زراعة الخلايا | |
| 19 ز 1 ½ إبرة حقنة | BD Bioscience | 309635 | 19 ز 1 ½ ؛ |
| الإيثانول | ديكون ، إنك. | 2701 | النقي للإيثانول 200 من Decon |
| Bioscience | 354249 | Collagen I ، تركيز عالي ، ذيل الفئران ، 100 مجم | |
| Trypsin / EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25٪ Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM عالي الجلوكوز (1x) ، سائل ، مع L-glutamine ، بدون بيروفات الصوديوم |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 لتر | PBS ، محلول 10x ، درجة الحموضة 7.4 |
| PFA (بارافورمالدهايد) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4٪ في PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | مصل الأبقار الجنيني |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit ، EBM-2 Basal Medium 500 مل و EGM-2 SingleQuot Kit مكمل غذائي عوامل النمو |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3< / sub> | Sigma-Aldrich | S2002-25G | قابل للذوبان في الماء. محلول المخزون 4٪ وتركيز العمل 0.4٪. |
| الفأر المضاد للإنسان TM4SF1 الأجسام المضادة | يقع Millipore | MAB3127 | Epitope في المجال خارج الخلية |
| الجسم المضاد للفأر CD9 المضاد للإنسان | يقع BD Bioscience | 555370 | Epitope في المجال خارج الخلية |
| Alexa Fluor 488 Donkey المضاد للفأر 2nd الأجسام المضادة | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | الرودامين المترافق Phalloidin |
| مضاد للتلاشي وسائل التركيب | Life Technologies | P-36931 | كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان مع DAPI |
| 70٪ إيثانول ؛ | 17.5 مل من الإيثانول (200 برهان) < / > 7.5 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 10x PBS (صنع 200 مل) 20 | مل من 10x PBS 180 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 20٪ Triton X-100 (صنع 20 مل) & nbsp ؛ | 4 مل Triton X-100 16 مل ماء مزدوج منزوع الأيونات | ||
| 4٪ NaN3< / sub> (صنع 25 مل) | 1 جم من NaN3< / sub> 25 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 50 نانوغرام / مل محلول الكولاجين البقري في PBS (صنع 5 مل) | محلول مخزون 50 مو ؛ جم / مل (50 مل) < BR / > 830 مو ؛ ل من الكولاجين الأول (3 مجم) 50 مل PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 مل) | 49 مل PBS 2٪ FBS (إضافة 1 مل) 0.04٪ NaN3< / sub> (إضافة 100 مو ؛ ل من 4٪ NaN3< / sub>) ICC | ||
| Blocking Buffer / 0.01٪ Triton X-100 (صنع 50 مل) 50 | مل من ICC Blocking Buffer 25 & mu ؛ ل من 20٪ Triton X-100 | ||
| HUVEC & nbsp ؛ | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| غطاء مزرعة الخلية | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (السلسلة 60) خزانة السلامة البيولوجية ؛ |
| 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO2< / sub> حاضنة زراعة الخلايا ؛ | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2< / sub> وسادة تسخين حاضنة مغلفة بالماء |
| ؛ | ك & H التصنيع | 1020 | K & وسادة H Lectro Kennel ساخنة مع غطاء من الصوف الحر (www.amazon.com< / a>) |
| أجهزة الطرد المركزي | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) جهاز الطرد المركزي على الطاولة |
| مقياس الدم | Sigma-Aldrich | Z359629 | مقياس الدم ذو الخط الساطع |
المراجع
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
