Nanopodia قنوات غشاء رقيق ولكنها هشة التي تمتد ما يصل الى 100 ميكرون من قيادة الجبهة الخلفية أو زائدة الخلية والشعور البيئة الخلوية. ويلزم تثبيت مباشرة عند 37 درجة مئوية، وغسل لطيف، وتجنب المذيبات العضوية مثل الإيثانول والميثانول، أو الأسيتون وارتفاع تريتون X-100 تركيزات مراعاة هذه الهياكل الخلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Nanopodia - رقيقة، غشاء التوقعات الهشة مع الأدوار في حركة التفاعلات بين الخلايا الخليوي و
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الملتصقة في ثقافة الحفاظ على حالة الاستقطاب لدعم الحركة والتفاعلات بين الخلايا. Nanopodia هي رقيقة، ممدود، إلى حد كبير، F-الأكتين سلبية التوقعات في غشاء الخلايا البطانية والسرطان الذي يمكن تصور خلال TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) المناعي تلطيخ. مجموعات TM4SF1 في 100-300 ميكرون قطر TMED (TM 4SF1 ه nriched omains د الصغرى) التي تحتوي على 3 إلى ما يصل إلى 14 فرد TM4SF1 الجزيئات. يتم ترتيب TMED بشكل متقطع على طول nanopodia في تباعد العادية من 1-3 TMED في μ م وترسيخ nanopodia إلى المصفوفة. وهذا يتيح nanopodia تمديد أكثر من 100 μ م من قيادة الجبهة أو زائدة الجزء الخلفي من الخلايا البطانية أو ورم الاستقطاب، ويسبب بقايا الغشاء أن تترك وراءها على MATRالتاسع عندما يتحرك الخلية بعيدا. تم التغاضي TMED وnanopodia بسبب هشاشتها الشديدة والحساسية لدرجة الحرارة. غسل الروتينية وتعطيل تثبيت الهيكل. يتم الاحتفاظ Nanopodia من قبل التثبيت المباشر في بارافورمالدهيد (PFA) عند 37 درجة مئوية، تليها التعرض قصيرة إلى 0.01٪ تريتون X-100 قبل تلطيخ. Nanopodia فتح آفاقا جديدة في بيولوجيا الخلية: يعدون لإعادة تشكيل فهمنا لكيفية خلايا الشعور بيئتهم، كشف وتحديد الخلايا الأخرى على مسافة، والشروع في التفاعلات بين الخلايا في اتصال وثيق، وآليات الإشارات المشاركة في الحركة، والانتشار، والخلية الاتصالات الخلية. قد تكون الأساليب التي يتم تطويرها لدراسة nanopodia TM4SF1 المستمدة من المفيد للدراسات nanopodia التي تشكل في أنواع الخلايا الأخرى من خلال وكالة tetraspanins الكلاسيكية، ولا سيما CD9 أعرب بتواجد مطلق، CD81، وCD151.
المقدمة
خلال الاستقطاب للحركة، والخلايا الحيوانية توسيع مجموعة متنوعة من الديناميكية، نتوءات غشاء من سطوحها، بما في ذلك أرجل كاذبة خيطية، أقدام صفاحية والألياف التراجع، والكشكشة 1. تمت إضافتها مؤخرا إلى هذه القائمة كانت nanopodia، وهو نوع المعترف بها حديثا رقيقة (100-300 ميكرون في القطر)، ممدود (50-100 ميكرون تصل إلى الطويل) الغشاء الذي الإسقاط توفير قنوات الغشاء لتمديد الهياكل F-الأكتين مثل أرجل كاذبة خيطية والألياف التراجع، وأنه وصمة عار بإيجابية مع TM4SF1 (عبر الغشاء-4-L-ستة أسرة-1) في البطانية والورم الخلايا المستزرعة 2،3.
TM4SF1 هو بروتين مع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الثقافة الخلية على الكولاجين المغلفة القرص زجاج
- الأقراص مكان الزجاج (12 مليمتر في القطر) في وعاء زجاجي (4 أوقية) والأوتوكلاف لتعقيم الأقراص.
- وضع 25 مل 70٪ من الإيثانول في أنبوب 50 مل الصقر ووضعه في غطاء ثقافة الخلية. هذا الحل يمكن إعادة استخدامها عدة مرات حتى مستوى الحل ينخفض إلى 20 مل.
- وضع ملقط حاد مع نقطة غرامة اضافية في الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقائق قبل استخدامه للتعامل مع القرص الزجاج.
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لخطوة 1:
إذا الخلايا (مثل HUVEC وPC3 المستخدمة في هذه الدراسة) هي قادرة على النمو بشكل طبيعي، وسوف نعلق على خلايا القرص المغلفة الكولاجين في غضون 30 دقيقة بعد هم المصنف، استقطاب وتصبح المحمول بعد ذلك بقليل، وتوسيع nanopodia قبل مسيرتهم الحركة. أرقام 1A و 1B يظهر على التوالي على الاستقطاب والانتشار HUVEC. الشكل 2A يظهر خلايا PC3 الاستقطاب في حالة المحمول.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Nanopodia قنوات رقيقة الغشاء الخلوي أن نعلق بحزم إلى matrix خلال TMED ويمكن أن تمتد أكثر من 100 ميكرون من خلية المحمول الاستقطاب لاستشعار البيئة والتفاعلات بين الخلايا توسط 2،3. Nanopodia التمسك مصفوفة بقوة حتى يتم ترك مخلفات وراء بينما يتحرك بعيدا الخلية (الشكلان 1 و 2). وبالتالي Nanopodia تسمح لنا لدراسة كيفية خلايا الشعور بيئتهم وتحديد مسار حركة الخلية، وكيفية حركة التغييرات التعبير الجيني أو المخدرات العلاج. ولكن نظرا لهشاشة هذه (10.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أعلن عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نحن نعترف الدكتور هارولد دفوراك لإجراء مناقشات مفيدة بما في ذلك الاقتراح في محاولة التثبيت في 37 ° C PFA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح P01 CA92644 وبموجب عقد من المؤسسة الوطنية لأبحاث السرطان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أقراص زجاجية | فيشر سيانتيفك | 12-545-82 | 12 مم |
| جرة زجاجية | فيشر سيانتيفك | 02-912-310 | برطمانات زجاجية شفافة ونظيفة معتمدة ، 4 أوقية |
| شريحة زجاجية | فيشر سيانتيفك | 12-544-1 | شرائح مجهر زجاجي عادي فاخرة |
| من فيشرfinest 50 مل أنبوب فالكون | BD | Falcon 352070 | أنبوب طرد مركزي مخروطي بولي بروبلين عالي الوضوح 50 مل ، تصنيف 16,000 RCF. عقيم. |
| أنبوب صقر 15 مل مع رف الستايروفوم | Corning | 430790 | Corning 15 مل أنابيب الطرد المركزي PP |
| ملقط حاد | فيشر Scientific | 13-812-42 | ملقط مدبب فائق النعومة ملقط |
| 24 بئر لوحة زراعة الخلية | BD Bioscience | 353047 | 24 بئر لوحة زراعة الخلايا |
| 150 مم لوحة زراعة الخلايا | BD Bioscience | 353025 150 مم لوحة زراعة الخلايا | |
| 19 ز 1 ½ إبرة حقنة | BD Bioscience | 309635 | 19 ز 1 ½ ؛ |
| الإيثانول | ديكون ، إنك. | 2701 | النقي للإيثانول 200 من Decon |
| Bioscience | 354249 | Collagen I ، تركيز عالي ، ذيل الفئران ، 100 مجم | |
| Trypsin / EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25٪ Trypsin-EDTA 1x |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM عالي الجلوكوز (1x) ، سائل ، مع L-glutamine ، بدون بيروفات الصوديوم |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 لتر | PBS ، محلول 10x ، درجة الحموضة 7.4 |
| PFA (بارافورمالدهايد) | Affymetrix | 19943 1 LT | 4٪ في PBS |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | مصل الأبقار الجنيني |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit ، EBM-2 Basal Medium 500 مل و EGM-2 SingleQuot Kit مكمل غذائي عوامل النمو |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3< / sub> | Sigma-Aldrich | S2002-25G | قابل للذوبان في الماء. محلول المخزون 4٪ وتركيز العمل 0.4٪. |
| الفأر المضاد للإنسان TM4SF1 الأجسام المضادة | يقع Millipore | MAB3127 | Epitope في المجال خارج الخلية |
| الجسم المضاد للفأر CD9 المضاد للإنسان | يقع BD Bioscience | 555370 | Epitope في المجال خارج الخلية |
| Alexa Fluor 488 Donkey المضاد للفأر 2nd الأجسام المضادة | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) |
| Phalloidin | Chemicon | 90324 | الرودامين المترافق Phalloidin |
| مضاد للتلاشي وسائل التركيب | Life Technologies | P-36931 | كاشف ProLong Gold المضاد للبهتان مع DAPI |
| 70٪ إيثانول ؛ | 17.5 مل من الإيثانول (200 برهان) < / > 7.5 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 10x PBS (صنع 200 مل) 20 | مل من 10x PBS 180 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 20٪ Triton X-100 (صنع 20 مل) & nbsp ؛ | 4 مل Triton X-100 16 مل ماء مزدوج منزوع الأيونات | ||
| 4٪ NaN3< / sub> (صنع 25 مل) | 1 جم من NaN3< / sub> 25 مل من الماء منزوع الأيونات | ||
| المزدوج 50 نانوغرام / مل محلول الكولاجين البقري في PBS (صنع 5 مل) | محلول مخزون 50 مو ؛ جم / مل (50 مل) < BR / > 830 مو ؛ ل من الكولاجين الأول (3 مجم) 50 مل PBS | ||
| ICC Blocking Buffer (50 مل) | 49 مل PBS 2٪ FBS (إضافة 1 مل) 0.04٪ NaN3< / sub> (إضافة 100 مو ؛ ل من 4٪ NaN3< / sub>) ICC | ||
| Blocking Buffer / 0.01٪ Triton X-100 (صنع 50 مل) 50 | مل من ICC Blocking Buffer 25 & mu ؛ ل من 20٪ Triton X-100 | ||
| HUVEC & nbsp ؛ | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| غطاء مزرعة الخلية | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425 (السلسلة 60) خزانة السلامة البيولوجية ؛ |
| 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO2< / sub> حاضنة زراعة الخلايا ؛ | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2< / sub> وسادة تسخين حاضنة مغلفة بالماء |
| ؛ | ك & H التصنيع | 1020 | K & وسادة H Lectro Kennel ساخنة مع غطاء من الصوف الحر (www.amazon.com< / a>) |
| أجهزة الطرد المركزي | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) جهاز الطرد المركزي على الطاولة |
| مقياس الدم | Sigma-Aldrich | Z359629 | مقياس الدم ذو الخط الساطع |
المراجع
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogen....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
