مقالة منهجية

A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

DOI:

10.3791/51322

⸱

أبريل 11, 2014

 , 
1Molecular Pharmacology and Pathology Program, Department of Pathology & Bosch Institute, University of Sydney, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Biomedical Sciences, Monash University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسكوربات يلعب العديد من الأدوار الهامة في عملية الأيض الخلوية، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. نحن هنا وصف-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة لتحديد كلا أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيتامين C (أسكوربات) يلعب دورا هاما في العديد من الأيض الخلوي، وكثير منها قد تأتي فقط للضوء في السنوات الأخيرة. على سبيل المثال، داخل الدماغ، أسكوربات يتصرف بطريقة اعصاب وneuromodulatory التي تنطوي أسكوربات ركوب الدراجات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية vicinal - وهي العلاقة التي يبدو أن تكون حاسمة لأسكوربات الدماغ التوازن. بالإضافة إلى ذلك، والأدلة الناشئة تشير بقوة إلى أن أسكوربات دورا توسع كبير في تنظيم استقلاب الحديد الخلوية والنظامية مما هو معترف بها تقليديا. الاعتراف المتزايد بدور لا يتجزأ من أسكوربات في الفيزيولوجيا الخلوية والعضوي الطبيعي وحررت تطالب مجموعة من المتوسطة الإنتاجية وذات حساسية عالية التقنيات التحليلية التي يمكن تنفيذها دون الحاجة إلى معدات متخصصة مكلفة للغاية. هنا نقدم تعليمات صريحة ل-الإنتاجية المتوسطة، فحص صفيحة ميكروسكوبية محددة وغير مكلفة نسبيا لتحديد بوال أسكوربات داخل وخارج الخلية في خلية ثقافة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان اكتشاف الطبيعة الكيميائية للحمض الاسكوربيك (فيتامين C)، وتحديد على أنه "عامل مكافحة حفري" يسعى منذ فترة طويلة، من قبل ألبرت زينت-جيورجي وغيرهم في الأبحاث المنشورة 1928-1934 1 الأحداث البارزة في التاريخ الكيمياء الحيوية. في الواقع، ساهمت هذه الاكتشافات إلى زينت جيورجي-حصوله على جائزة نوبل في الفسيولوجيا أو الطب عام 1937. جناح الآخذة في التوسع من أدوار لأسكوربات في علم وظائف الأعضاء الحيوانية والنباتية، وكذلك صحة الإنسان، لا تزال نشطة من الموضوعات العلمية التحقيق والجدل.

L-أسكوربات هو اختزال الفسيولوجية وفيرة وانزيم العامل المساعد في نظم الثدييات، وتساهم في العديد من التفاعلات الإنزيمية محددة جيدا تنطوي على الهيدروكسيل والكولاجين، والكارنيتين بافراز الحيوي، والتمثيل الغذائي التيروزين وهرمون الببتيد amidation 2. يثير الاهتمام والفضول، evide تصاعديوحي بأن الامتحانات التنافسية الوطنية أسكوربات يلعب دورا في تحفيز dioxygenases التي تعتمد على الحديد الأخرى، مثل prolyl وasparaginyl hydroxylases المشاركة في الهيدروكسيل واستهداف عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs) 1α و2α 3. يقترح تقرير حديث أن أسكوربات يلعب دورا في نضوج الخلايا التائية من خلال لونين تؤثر نزع الميثيل عبر نشاطها في تحفيز hydroxylases النووية، Jumonji C (JmjC) البروتينات المجال؛ وهذه الأخيرة التي يبدو أنها تتطلب أسكوربات عن النشاط الكامل 4. في الواقع، يبدو أن التحفيز هذه الانزيمات التي كتبها أسكوربات أن يحدث من خلال آلية مماثلة إلى التحفيز من قبل أسكوربات من مؤسسة الحرمين والكولاجين hydroxylases. من بين الآثار الكلاسيكية الأخرى، أسكوربات يساهم بشكل كبير في مضادة الأكسدة الخلوية وكسر سلسلة زبال الراديكالية للذوبان في الماء (5) وإلى إعادة تدوير غشاء البلازما α توكوفيرول (فيتامين E) عن طريق الحد من α-tocopheroxyl جذرية 6، ثhich المهم في حماية الغشاء ضد بيروكسيد الدهون 7. الأهم من ذلك، على الرغم من أن معظم الثدييات قادرة على دي نوفو توليف كبدي من أسكوربات من مد الجلوكوز، القرود العليا، خنازير غينيا وبعض الخفافيش تعتمد على المصادر الغذائية من فيتامين 8. وهذا يرجع إلى تثبيط الجين GULO، وorthologues منها في الثدييات تتأثر ترميز الانزيم، γ-gulono-اكتون أوكسيديز 9-13. مطلوب هذا الانزيم للتفاعل النهائي في أسكوربات الحيوي من الجلوكوز 13.

بعد امتصاص بوساطة نقل من تجويف الأمعاء في البشر، ويتم توزيع أسكوربات في جميع أنحاء الجسم عن طريق الدورة الدموية. وعادة ما يتم العثور على الفيتامين في شكله انخفاض في تركيزات millimolar داخل الخلية (مع استثناء ملحوظ من الكريات الحمراء في تركيزات التي عادة ما تكون مماثلة لتركيز البلازما السائدة)، واضرب في مكروموليentrations (على سبيل المثال 50-200 ميكرومتر) في معظم سوائل خارج الخلية 14،15.

في ظل الظروف الفسيولوجية، أسكوربات عادة تخضع لعملية الأكسدة عكسها إلكترون واحد إلى اسكوربيل الجذور الحرة (AFR؛ المعروف أيضا باسم monodehydroascorbate أو semidehydroascorbate). في حين أن AFR هو مستقر نسبيا الراديكالية 16، في غياب السريع إلكترون واحد للحد من الأنزيمية عودتها الى أسكوربات، يمكن أن اثنين AFRs تعزيز dismutate إلى أسكوربات واحد واحد dehydroascorbate (DHA) 9،13،17. في المناطق الداخلية من الخلية، وهما الإلكترون الأكسدة نتاج أسكوربات، DHA، ويمكن تخفيض بسرعة العودة إلى أسكوربات بواسطة الجلوتاثيون وNAD (P) الأنزيمية H-تعتمد وردود الفعل غير الأنزيمية 13.

في حين أنه من المقبول أن كلاسيكي دورا هاما فقط أسكوربات في استقلاب الحديد هو تحفيز امتصاص الغذائية من الحديد غير الهيم 18، نحن وآخرون قدموا الأدلة قمما يشير إلى أن trongly إستعمال أسكوربات يلعب دورا توسع كبير في عملية التمثيل الغذائي لهذا المعدن. الأولى، أسكوربات التي يتم تحريرها من قبل خلايا أسكوربات تزخر يبدو أن تلعب دورا هاما في تحوير امتصاص الحديد غير ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 19،20، والأدلة الأخيرة تشير إلى أن أسكوربات جدا أيضا ينظم امتصاص الحديد ملزمة ترانسفيرين من قبل خلايا 21، وهذه الأخيرة التي يناظر الفسيولوجية ممر رئيسي لامتصاص الحديد 22.

أسكوربات أمر ضروري لوظيفة عادية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات 23،24. جنبا إلى جنب مع القشرة الكظرية والغدة النخامية، الغدة الصعترية، الشبكية والجسم الأصفر، والدماغ يحتوي على تركيزات عالية من أسكوربات نسبة إلى أنسجة الجسم الأخرى 23،25-27. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف أن تعرض كل من الخلايا النجمية 28،29 والعصبية التي تشبه الخلايا خلايا 30 إلى الغلوتامات لتؤدي إلى الإفراج عن أسكوربات في الفضاء خارج الخلية، حيث ascorbatويعتقد الإلكترونية للمساعدة في حماية الخلايا العصبية التي يسببها ضد الغلوتامات العصبية العجز 31. في حين أن الآلية الدقيقة التي يسببها الغلوتامات الإفراج أسكوربات من الخلايا النجمية غير معروف، وقدمنا ​​مؤخرا أدلة تشير إلى تورط خلية التورم الناجم عن امتصاص الغلوتامات من الغلوتامات نجمية ونقل اسبارتاتي (GLAST؛ المعروف أيضا الأحماض الأمينية مثير نقل الإسوي 1 [EAAT1 ] في البشر) ويترتب على ذلك تفعيل osmolyte وأنيون قنوات الحساسة الحجم (VSOACs) التي هي قابلة للاختراق لالأنيونات العضوية الصغيرة مثل أسكوربات 32. تبقى الهويات الجزيئية للقنوات غشاء البلازما المشاركة في تشكيل VSOAC الكشف عن هويته 33،34.

على الرغم من أن وضعت العديد من فحوصات لتحديد أسكوربات في العينات البيولوجية، والتي تشمل الطيف، وفلوروميتريك الكروماتوغرافي المقايسات 35،36، هناك الكثير من التباين في خصوصية وحساسية، interferencه من الملوثات الكيميائية، ومجموعة خطية فعالية واستقرار الحليلة نقطة النهاية. بالإضافة إلى ذلك، عوامل الأخرى التي تؤثر على اختيار الاختبار هي سرعة، وسهولة الاستخدام والوصول إلى المعدات المتخصصة نسبيا مثل اللوني السائل عالي الأداء (HPLC) الجهاز.

نحن هنا تقديم مقايسة اللونية صفيحة ميكروسكوبية بسيطة ومحددة للغاية لتحديد أسكوربات الخلايا في الخلايا المستزرعة، فضلا عن فحص منفصل لتحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة. يهدف الفحص الأخير للالتفاف على مشكلة التقليل من الإفراج أسكوربات من الخلايا نظرا لسرعة إعادة امتصاص أسكوربات صدر عن نقل أسكوربات التي تعتمد على الصوديوم (SVCTs). على الرغم من أن كل من هذه الأساليب التي ظهرت في بعض منشوراتنا السابقة 19،20،32،37،38، يوفر هذا المخطوط مجموعة واضحة من التعليمات والمبادئ التوجيهية للتنفيذ على نحو فعال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة

  1. زراعة الخلايا والحصاد
    1. تنمو التعليق (مثل ابيضاض الدم الاحمراري الإنسان، K562) أو الخلايا الملتصقة (مثل الخلايا النجمية الأساسي) باستخدام الإجراءات القياسية الثقافة 19-21،32،38. ملاحظة: لضمان الخلايا تحتوي على أسكوربات، تحميل الخلايا المستزرعة مع أسكوربات إما أسكوربات أو DHA 33،39.
  2. إنشاء مقتطف الخلوية التي تحتوي على أسكوربات
    1. احتضان عدد مناسب من الفوسفات مخزنة المالحة تعليق (PBS) غسلها أو الخلايا الملتصقة مع 450 ميكرولتر من خلية الجليد الباردة العازلة Permeabilization [CPB؛ 0.1٪ (ث / ت) سابونين في برنامج تلفزيوني؛ 4 ° C]. ملاحظة: تحديد عدد الخلايا المطلوبة للحصول على قيمة الامتصاصية ضمن مجموعة خطية من الفحص (انظر أدناه) تجريبيا من قبل المستخدم النهائي. ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم مستخلصات الأنسجة (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
    2. Agitaخلايا الشركة المصرية للاتصالات على الجليد لمدة 10 دقيقة لضمان تحلل الخلوية شامل.
    3. إنشاء المحتوية على استخراج الخلايا أسكوربات أوضح عن طريق إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي للالمحللة الخام عند 16،000 × ز لمدة 5 دقائق في microcentrifuge المبردة (4 درجة مئوية).
    4. إزالة بعناية 4 × 100 ميكرولتر مأخوذة من كل عينة وإضافة إلى سلسلة الآبار الأفقية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا أن يحتوي إما 25 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني ("AO") فقط أو 25 ميكرولتر / جيد من 45.5 U / مل محلول المخزون من L-أسكوربات-أوكسيديز (AO) في برنامج تلفزيوني ("+ AO"). ملاحظة: يجب أن يتم ذلك بالتوازي مع إعداد المعايير (انظر أدناه).
  3. أسكوربات البناء القياسية منحنى (يجب أن تبنى من جديد لكل مقايسة)
    1. إعداد محلول المخزون من 10 ملم حمض الاسكوربيك في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. ملاحظة: تحقق من تركيز أسكوربات طيفيا باستخدام كفيت الكوارتز مع 1سم طول المسار 265 نانومتر في (معامل الانقراض = 14.5 مم -1 سم -1) 40.
    2. إعداد بعناية سلسلة من المعايير أسكوربات بين 0 و 20 ميكرومتر.
    3. بالتوازي مع الخطوة 1.2.4، وإزالة بعناية 4 × 100 ميكرولتر مأخوذة من كل معيار، ويضاف إلى سلسلة الآبار الأفقية في لوحة مسطحة القاع 96-جيدا أن يحتوي على 25 ميكرولتر / جيد من برنامج تلفزيوني ("AO") أو 45.5 U / مل محلول المخزون من AO في برنامج تلفزيوني ("+ AO"). ملاحظة: ستكون 100 ميكرولتر من المعايير أسكوربات أعلاه تحتوي على 0-2 nmole من أسكوربات. يرجى ملاحظة أن الغرض من AO هو السيطرة للمساهمة الاختزال غير أسكوربات إلى الحد فيري سيانيد.
  4. تحديد الخلايا أسكوربات - الخطوة 1: إزالة انتقائي أسكوربات وكميا أكسدة أسكوربات مع فيري سيانيد
    1. مزيج Orbitally 96 لوحة جيدا في 550 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في الظلام من خلال تغطية لوحة في احباط. ملاحظة: Tخطوته يجب أكسدة جميع أسكوربات في "+ AO" الآبار لهيئة الصحة بدبي. يجب أن تكون الآبار "AO" لم تتأثر.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من 3.5 ملي فيري سيانيد البوتاسيوم (المشار إليها هنا "فيري سيانيد") في برنامج تلفزيوني لجميع الآبار. المباراة النهائية [فيري سيانيد] = 1 ملم. ملاحظة: استخدام multipipettor.
    3. مزيج Orbitally لوحة في 550 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أخرى في الظلام. ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن يؤدي إلى الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد بواسطة أسكوربات في نسبة متكافئة من 2 جزيئات فيري سيانيد تخفيض لكل 1 جزيء من أسكوربات أكسدة.
    4. إضافة على الفور 25 ميكرولتر من حل شيدت حديثا تحتوي على 50٪ (ت / ت) وحامض الخليك 30٪ (ث / ت) وحامض الخليك ثلاثي الكلور (TCA). ملاحظة: استخدام multipipettor.
  5. تحديد الخلايا أسكوربات - الخطوة 2: quantitate مقدار فيروسيانيد شكلت 37
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الحل فيروسيانيد تقرير 37 إلى البريدمنظمة العمل ضد الجوع أيضا. ملاحظة: يجب أن يتم حل العمل فورا قبل الاستخدام: 2 مل من 3 M نا خلات (الرقم الهيدروجيني 6.0)؛ 0.5 مل من حمض الخليك الجليدي (~ 17.4 M حمض الخليك)؛ 2 مل من 0.2 M حمض الستريك؛ 2 مل من 3.3 ملي FeCl 3 في 0.1 حمض الخليك M؛ 1 مل من 30 ملي ferene-S. يجب أن يكون الحجم النهائي من هذا الحل يعمل 7.5 مل.
    2. مزيج Orbitally لوحة في الظلام في 550 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. قراءة القيم الامتصاصية من آبار في 593 نانومتر (أي الحد الأقصى لامتصاص الحديد (II) (ferene-S) 3 المعقدة).
    4. حساب كمية أسكوربات داخل الخلايا كما nmoles أسكوربات لكل مليون الخلايا عن طريق طرح في البداية A 593 نانومتر القيم للآبار و'+ AO' من المقابلة - آبار 'AO' لكل عينة ثم التحريف من منحنى أسكوربات القياسية (انظر الخطوة 1.3 ). عند بناء منحنى القياسية، رسم هذا "قيمة الاختلاف" لكل معيار مقابل مبلغ من ascorbأكلت لكل بئر.

2. تحديد أسكوربات-هروب رأس المال من الخلايا المستزرعة

  1. زراعة الخلايا والحصاد
    1. تنمو تعليق أو الخلايا الملتصقة على النحو الوارد أعلاه (انظر الخطوة 1.1). ملاحظة: تنفيذ مقايسة أدناه في شكل بلات 24 جيدا مع التعليق والخلايا الملتصقة للحصول على أفضل النتائج.
    2. تعليق الخلايا في resuspend، أو تراكب الخلايا الملتصقة، مع 400 ميكرولتر من قبل حرارة محلول ملحي HEPES مخزنة، مع أو بدون الكالسيوم والمغنيسيوم، وتحتوي على 5 ملي مد الجلوكوز (HBS / D؛ درجة الحموضة 7.3، 37 ° C) في الآبار من 24 لوحة جيدا. إضافة نفس حجم HBS / D إلى الآبار خالية من الخلايا المحددة في كل لوحة 24 جيدا لفحصها. ملاحظة: هذا الأخير سيكون بمثابة الضوابط خالية من الخلايا للتفاعل الأساس (انظر أدناه).

3. تحديد مقدار أسكوربات الاصدار

  1. وينبغي إعداد الحلول الأسهم التالية مسبقا: 120U / مل AO في HBS / D (إعداد الطازجة)؛ 2.4 ملي Ferene-S في HBS / D؛ 120 ميكرومتر FeCl 3 و 600 ميكرومتر نا السيترات في HBS / D (إعداد فورا من الحلول الأسهم أكثر تركيزا).
  2. لبدء رد فعل ferrireduction (الحجم النهائي لكل بئر يجب أن يكون 600 ميكرولتر)، إضافة الكميات التالية من الكواشف إلى الآبار الفردية التي تحتوي بالفعل 400 ميكرولتر من HBS / D:
    1. إضافة 50 ميكرولتر من AO (120 U / مل) أو HBS / D لإقران الآبار في ثلاث نسخ. وينبغي أن يكون تركيز AO النهائي 10 U / مل. ملاحظة: تسمية تقرن الآبار و"- AO" و "+ AO".
    2. مزيج من لوحات مع خلط المدارية لطيف لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من 2.4 ملي ferene-S لجميع الآبار. وينبغي أن يكون النهائي تركيز ferene-S 200 ميكرومتر. مزيج من لوحات على النحو الوارد أعلاه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من الطازجة 120 ميكرومتر سترات الحديديك. يجب أن تكون نهائية وتركيزات الحديد سترات الحديد 10 ميكرومتر و 50 ميكرومتر سيترات. تخلط جيدا.
    5. في ثلاثة آبار المراقبة ثلاث نسخ، نضح المتوسطة الفوقية وإضافة 600 ميكرولتر HBS / D تحتوي على 0.1٪ سابونين. ملاحظة: ستكون هذه بمثابة "بنسبة 100٪ خلية تحلل" الضوابط لاكتات نازعة (LDH) الإفراج الفحص التي ستجرى بالتوازي (انظر أدناه).
    6. احتضان لمدة 60 دقيقة في الظلام في 37 درجة مئوية.
    7. في نهاية الفحص أسكوربات هروب رأس المال، ونضح بسرعة 500 ميكرولتر من كل بئر وإضافة إلى الآبار المسمى بشكل مناسب في 24 لوحة جيدا. ملاحظة: للخلايا التعليق، وإزالة البداية الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية.
    8. إضافة 300 ميكرولتر مأخوذة من طاف لوحة 96 جيدا وثم قرأ في 593 نانومتر.

    4. تحديد أسكوربات خارج الخلية

    1. قراءة القيم الامتصاصية من آبار في 593 نانومتر.
    2. حساب كمية أسكوربات خارج الخلية كما nmoles أسكوربات في ملغ من البروتين (أو لكل مليون خلية) كما هو موضح لتحديد الخلايا أسكورباتفي الخطوة 1.5.4. ملاحظة: يجب على المستخدم النهائي تحسين الظروف بحيث الإفراج أسكوربات لا يقتصر بواسطة أسكوربات داخل الخلايا.

    5. تحديد LDH الإصدار

    1. مع 200 ميكرولتر المتبقية من حل خارج الخلية من كل عينة إجراء فحص الإفراج LDH 32،41 لتحديد مدى تحلل الخلوية. ملاحظة: حساب كنسبة مئوية من إجمالي LDH نشره. تحديد LDH نشره من العينات التي تم تعامل مع 0.1٪ سابونين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد أسكوربات بين الخلايا في الخلايا المستزرعة تعليق

في مقايسة الأولى (الشكل 1)، يتم تحديد أسكوربات داخل الخلايا، وبعد أسكوربات محددة (أي AO-الحساسة) الحد من فيري سيانيد لفيروسيانيد، وذلك باستخدام تقرير حساسة للغاية من فيروسيانيد بواسطة إجراء نشرت سابقا 37. ويستند الكشف عن أسكوربات على عملية إزالة معدن ثقيل من الحديد اللونية الحديدية التي يتم إنشاؤها بواسطة تخفيض تعتمد على أسكور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة نقدم اثنين السريع ومحددة وحساسة نسبيا المقايسات صفيحة ميكروسكوبية اللونية لتحديد أسكوربات المستمدة من المقصورات داخل وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة. المقايسات يمكن أن تكتمل مع إمكانية الوصول إلى المعدات المختبرية القياسية والكواشف. كاشف فقط تكلفة معتدلة المطلوبة للفحص هي AO، وهو أمر ضروري لأنه يضفي على درجة عالية من الحليلة خصوصية نحو L-أسكوربات. المقايسات هي مناسبة تماما لخلايا إما تعليق (على سبيل المثال K562) أو الخلايا ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للدكتور ستيفن روبنسون والسيدة هانية Czerwinska (جامعة موناش) لتوريد سخية من الثقافات نجمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ألواح Nunc 96 بئر مسطحةالقاع Thermo269620يمكن استخدام أي صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا
جهاز طرد مركزي دقيق مبرد على الطاولةEppendorf5415Dيمكن أيضا استخدام جهاز طرد مركزي دقيق غير مبرد تم مواصفته بدرجة الحرارة في غرفة باردة
جهاز طرد مركزي مبردEppendorf5810Rدلو
متأرجحBio-Rad Benchmark Plus Microplate SpectrophotometerBio-Radيمكن استخدام أي مقياس طيف ضوئي دقيق قادر على القراءة عند 593 نانومتر ويوصى به. إذا تم استخدام قارئ لوحة قائم على المرشح ، فاختر أقرب طول موجي ممكن واستخدم طريقة المنحنى القياسي.
Ependorf MixMate (خلاط مداري ميكروبليت)Eppendorfهذا خلاط دقيق متعدد الاستخدامات وموثوق به للغاية ويعمل بشكل جيد للغاية مع هذه المقايسات
المخازن
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4
ملحي مخزن ب MOPS (MBS) ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الكولوكس ، 15 ملي مولار MOPS-Na + < / sup> ، درجة الحموضة 7.3
MBS + 5 ملي مولار د-جلوكوز (MBS / D) محلول
ملحي مخزن بالأبد + 5 ملي مولار D-glucose (HBS / D) ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 5.2 ملي كلوريد كلوريد ، 1.8 ملي كلوريد الهواء < الفرعي >2< / الثور ال>فرعي ؛ 2 H2O, 0.8 mM MgSO4& bull; 7 H2< / sub>O ، 5 ملي مولار D-glucose ، 20 ملي مولار HEPES-Na + < / sup> ، درجة الحموضة 7.3)
المخزن المؤقت لنفاذية الخلية (CPB ؛ 0.1٪ سابونين في PBS) المواد
الكيميائية
حمض L-ascorbic أو الصوديوم L-ascorbateSigma-Aldrichيجب الحصول على أعلى مستحضرات نقاء
حمض ديهيدرو إل أسكوربيك (DHA)Sigma-Aldrich30790المحاليل المائية تنتج نظريا 2 مول من مونومر DHA لكل مول من ثنائي DHA
Cytochalasin BSigma-AldrichC6762محاليل المخزون المحضرة في DMSO أو الإيثانول
أسكوربات أوكسيديز (AO)يمكن تحضير محاليل المخزون Sigma-AldrichA0157(120 وحدة / مل) في PBS أو MBS ثم تجميدها في كميات
كبيرة من فيريسيانيد البوتاسيوم (FIC)سيجما ألدريتش455989ثلاثي هيدرات
فيرين-S (3-(2-بيريديل) -5،6-دي (2-فوريل) -1،2،4-تريازين-5 & رئيس ؛ &prime ؛ ملح ثنائي الصوديوم حمض ديسولفونيك)Sigma-Aldrich92940
الصوديوم L-glutamateSigma-Aldrich
L-glutamineSigma-Aldrich
SaponinSigma-Aldrich47036تحضير محلول مخزون 0.1٪
حلول المخزون لمقايسة
3 M أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 6.0)
حمض
0.2 م حامض
3.3 ملي مولار FeCl 3< / sub> في 0.1 M حمض
30 ملي مولار فيرين S
50٪ (حجم / حجم) حمض الخليك + 30٪ (وزن / حجم) حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA)
حلول المخزون لمقايسة
AO (120 وحدة / مل)
2.4 ملي مولار فيرين-S
0.12 ملي مولار FeCl3 في 0.6 ملي مولار من سترات
للأغراض العامة محلول العامة ثنائي تحديد الأسكوربات داخل الخلاياالخليك الجليديالستريكالخليكتدفق الأسكوربات الصوديوم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buettner, G. R., Schafer, F. Q. Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification. Biochem. J. , (2006).
  2. Padayatty, S. J., Levine, M. New insights into the physiology and pharmacology of vitamin. C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).
  3. Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents. Biochem. J. 427, 135-142 (2010).
  4. Manning, J., et al. Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells. Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).
  5. Asard, H., et al. Redox Biochemistry. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).
  6. Aguirre, R., May, J. M. Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin. C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).
  7. May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid. Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).
  8. Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. Synthesis and some major functions of vitamin C in animals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).
  9. Rumsey, S. C., Levine, M. Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans. J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).
  10. Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man. J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).
  11. Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. Free Radic. Biol. Med. 25, 130-132 (1998).
  12. Nishikimi, M., Yagi, K. Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis. Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).
  13. Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. recycling and degradation in mammals. FEBS J. 274, 1-22 (2007).
  14. May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).
  15. Wilson, J. X. Regulation of vitamin C transport. Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).
  16. Buettner, G. R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).
  17. May, J. M. Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane. FASEB J. 13, 995-1006 (1999).
  18. Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. Ascorbic acid - important for iron metabolism. Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).
  19. Lane, D. J. R., Lawen, A. Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells). J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).
  20. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron. Biochem. J. 432, 123-132 (2010).
  21. Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).
  22. Lawen, A., Lane, D. J. R. Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action. Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).
  23. Grünewald, R. A. Ascorbic acid in the brain. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).
  24. Harrison, F. E., May, J. M. Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).
  25. Rebec, G. V., Pierce, R. C. A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission. Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).
  26. Hediger, M. A. New view at C. Nat. Med. 8, 445-446 (2002).
  27. Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer. Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).
  28. Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes. Brain Res. 858, 61-66 (2000).
  29. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  30. May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity. Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).
  31. Rice, M. E. Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain. Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).
  32. Lane, D. J. R., Lawen, A. The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes. Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).
  33. Lane, D. J. R., Lawen, A. Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux. Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).
  34. Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).
  35. Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids. Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).
  36. Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader. Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).
  37. Lane, D. J. R., Lawen, A. A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation. Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).
  38. Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane. Biochem. J. 428, 191-200 (2010).
  39. Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate. Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).
  40. Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances. J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).
  41. Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).
  42. Lane, D. J. R., Lawen, A. Transplasma membrane electron transport comes in two flavors. Biofactors. 34, 191-200 (2009).
  43. Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).
  44. May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol. Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).
  45. Avron, M., Shavit, N. A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide. Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

K562

مقالات ذات صلة