يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

15.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51339

⸱

أبريل 10, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, 2EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, 3EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, 4Department of Neurology, CHRU-Lille

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.

الملخص

ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2DE) هو أداة قوية للكشف عن تعديلات محتملة بروتيوم المتعلقة مختلفة ظروف فيزيولوجية أو مرضية. أساسا، ويستند هذا الأسلوب على فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي في الخطوة الأولى، وثانيا وفقا لأوزانها الجزيئية بواسطة SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). في هذا التقرير يوصف أمثل نموذج البروتوكول تمهيدا لكمية قليلة من بعد الوفاة والفأر الدماغ الأنسجة البشرية. تمكن هذه الطريقة لأداء كل من ثنائي الأبعاد الفرق مضان الكهربائي للهلام (2D-DIGE) و2DE صغيرة immunoblotting. مزيج من هذين النهجين يسمح احد لتجد ليس فقط البروتينات الجديدة و / أو التعديلات البروتين في التعبير عن شكرهم لتوافقه مع الكشف عن مطياف الكتلة، ولكن أيضا نظرة جديدة في التحقق من صحة علامات. وبالتالي، إلى جانب مصغرة 2DE لتصاريح النشاف الغربية لتحديد والتحقق من صحة آخرمتعدية التعديلات والبروتينات هدم ويوفر المقارنة بين نوعي الظروف و / أو علاجات مختلفة. هنا، ونحن نقدم طريقة لدراسة مكونات المجاميع البروتين الموجود في الجسم ليوي م والخرف مثل الببتيد اميلويد بيتا وألفا synuclein. يمكن بالتالي لدينا وسيلة يمكن تكييفها لتحليل بروتيوم واستخراج البروتينات غير قابلة للذوبان من أنسجة المخ والفئران النماذج البشرية أيضا. في موازاة ذلك، قد تقدم معلومات مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية والخلوية تشارك في الأمراض العصبية وكذلك المؤشرات الحيوية المحتملة الرواية والأهداف العلاجية.

المقدمة

الاضطرابات النفسية والعصبية تمثل 13٪ من عبء المرض العالمي، والتحديات الجديدة مثل الآليات المرضية في جسم المريض، وعوامل الخطر والمؤشرات الحيوية البادري يجب استكشافها 1. تمشيا مع هذا الهدف، البروتيوميات دراسات الدماغ البشري أصبحت لا غنى عنها للكشف عن المسارات الجزيئية المشاركة في العمليات مثل الذاكرة والسلوك والعواطف واللدونة العصبية على سبيل المثال، وليس فقط من أجل الفسيولوجية ولكن أيضا لظروف مرضية. ولذا، فإن استخدام نماذج حيوانية وبشكل أكثر تحديدا في الفئران المعدلة وراثيا، ويجلب طائفة واسعة من الاحتمالات لتقليد مسببات الاضطرابات العصبية البشرية 2.

وتتوفر في الوقت الحاضر النهج البروتينات من أجل تحقيق هذه الرؤى الجديدة في مجال علم الأعصاب. ثنائي الأبعاد الكهربائي هلام (2DE) هو وسيلة بسيطة وفعالة المرجح أن تمكن من مقارنة بروتيوم من مجموعة واسعة من العينات. علاوة على ذلك، وإنما هو أيضاطريقة قوية لعزل البروتين من خليط معقد من أجل تحديد ومواصلة تحليل بواسطة مطياف الكتلة. هذا الأسلوب يتكون أساسا في خطوتين متعاقبة: 1) فصل البروتين وفقا لنقطة تساوي الكهربية الخاصة بهم (PI) من خلال isoelectrofocusing (منتدى الطاقة الدولي). أكثر دقة، يتم تطبيق الجهد الكهربائي عبر شرائط الأكريلاميد immobiline بين التدرج درجة الحموضة ومن ثم سوف تهاجر البروتينات والتركيز على متزمت العزم في وظيفة مقابل صافي العالمية. 2) البروتينات ركزت Isoelectrically هي التشويه والتحريف، واتهم سلبا بإضافة الصوديوم كبريتات دوديسيل (SDS)، وبذلك يتم فصل البروتينات في أول بنيتها اعتمادا على ما يبدو على الوزن الجزيئي (MW) بواسطة SDS-PAGE 3. هذين خصائص متميزة تسمح لنا لمعالجة قيمة مضاعفة لتذهب أبعد من ذلك في دراسة بروتيوم. من ناحية هذا النهج يوفر إمكانية لإجراء التحليل الكمي باستخدام الحد الأدنى من الأصباغ طريقة 2D-DIGE، وعلى الجانب الآخر qualitativتحليل الإلكترونية بواسطة مصغرة 2DE جانب لالنشاف الغربية.

التحليل الكمي من قبل 2D-DIGE يمنح يغير البروتين التعبير في جميع أنحاء عينة بروتيوم. لفترة وجيزة، وصفت العينات مع ثلاثة cyanines (CY2، CY3 وCy5) الباعثة على ثلاثة أطوال موجية مميزة (الأزرق والأخضر والأحمر). هذه الأصباغ التي تحتوي على الحد الأدنى من فلوري-N هيدروكسي مجموعة succinimidyl استر تتفاعل مع المجموعة الأمينية-ε من lysines المخلفات الناتجة من البروتينات في السندات أميد التساهمية 4. وصفت بقايا يسين فقط بين 1-3٪ وبالتالي منع إضافة تسميات متعددة لكل من البروتين والتعديلات صافي تهمة الكبرى 5، 6. وغالبا ما تستخدم CY3 وCy5 لتسمية عينتين مستقلتين بينما العلامات CY2 مزيج من نسبة متساوية من العينات للمقارنة. المزايا الرئيسية هما أن جميع العينات وصفت مختلطة وتتم منتدى الطاقة الدولي وSDS-PAGE في هلام واحد في وقت واحد عن كل خطوة، وتجنب التباين بين بين التجارب بسبب المواد الهلامية المقارنة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل عتبة الكشف عالية من حوالي 1 فيمتومول من البروتين 7. يتم فحص المواد الهلامية والبرمجيات 2D يقارن الصور مضان هلام 2D، حيث يخدم CY2 كمعيار داخلي يسمح لتحديد فروق ذات دلالة إحصائية بين البقع لتحديد الخلفي عن طريق قياس الطيف الكتلي. برنامج تحليل 2D باستخدام معيار الداخلية يحقق كشف سريع من أقل من 10٪ من الاختلافات بين العينات مع أكثر من 95٪ من الثقة الإحصائية 8.

التحليل النوعي من قبل مصغرة 2DE هو خطوة حاسمة لتوصيف البروتين. المبدأ هو نفسه كما هو موضح سابقا لPI وMW الانفصال، ولكن في هذه الحالة يتم نقل البروتينات من هلام بولي أكريلاميد صغيرة إلى الغشاء ويتم تنفيذ immunoblotting بعد ذلك. بينما احدة الكهربائي هلام البعد يوفر التغيرات في تعبير البروتين واحد أو عدة الحواتم البروتين في وظيفة من الأجسام المضادة، والمعلومات!ن مصغرة 2DE يمنح مع معلمتين إضافية. أولا، تغيير isovariants البروتين في وظيفة من المعهد البترولي، مشيرا إلى أن التعديلات بعد متعدية قد يتحقق. ثانيا، قد يكون تحديد قياس الطيف الكتلي يدل على zymogens المعقول والمنتجات تقويضي للبروتينات. لذلك، تعديلات لاحظها 2D-DIGE من المرجح يدل على الآليات الكامنة وراء التغييرات في التشكيل بروتيوم العالمية. قد يعكس التحالفات من immunoblots بين عدة عينات لنفس البروتين حاتمة / ثانية عن طريق مصغرة 2DE التغييرات الحموضة تسليط الضوء على الاختلافات آخر متعدية لوحظ قليلا أو حتى ليس من immunoblotting monodimensional 9، 10. وعلاوة على ذلك، فإن هذا التحليل بإعلام حول المواقع المحتملة بسبب الانقسام معرفة PI وميجاوات من مخلفات التمثيل الغذائي 11،12.

مزيج من هذه التقنيات اثنين يوفر تحليل البروتينات التكميلية. من جهة 2D-DIGE يتيح لالطباع(ه) من الاختلافات السماح عزلة الدقيق للالبروتينية التي التعبير مختلفة. هذه الاختلافات تتكون أساسا إلى ظهور أو اختفاء بقعة أو زيادة / نقصان كثافة واحدة تعطى عن طريق تحليل البرمجيات من المواد الهلامية الفلورسنت. ومع ذلك، هذه الملاحظات من قبل أنفسهم من غير المحتمل أن يفسر طبيعة التعديل ملاحظتها. لهذه الأسباب، وبمجرد عزل ببتيد والتي حددها مطياف الكتلة، واستخدام مصغرة 2DE تمكن من تأكيد على وجه التحديد 1) هوية البروتين معزولة و2) طبيعة الفرق: تغيير في مستوى isovariant / الإسوي من التعبير، والتعديلات اللاحقة لمتعدية وعمليات الانقسام على سبيل المثال. ومع ذلك، فمن الضروري وضع بدء تحلل العازلة على حد سواء متوافقة مع 2D-DIGE ومع مصغرة 2DE من أجل الحد من التفرق المحتملة الناتجة عن استخدام بروتوكولات الاستخراج التي هي متباينة جدا.

في هذه المادة، ونحن ديمكتوب بروتوكول تكييفها لإعداد واستخراج وأداء 2D-DIGE والتقنيات المصغرة 2DE للبروتينات الدماغ قادمة من الأنسجة البشرية والفأرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التجانس واستخراج البروتين من إجمالي الإنسان والفأر أنسجة المخ

  1. الدماغ تجانس الأنسجة. التجانس أنسجة المخ بنسبة 10٪ (ث / ت) في 8 M اليوريا، 2 M ثيوريا و 1٪ ث / ت SDS العازلة (UTS) باستخدام الزجاج الفخاري (للعينات البشرية) أو تفلون الخالط (بالنسبة للفئران عينات). يصوتن في 60 هرتز 30 مع مولد نبضات الموجات فوق الصوتية تطبيق 0.5 ثانية لمجموع تفكك النسيج 13، 14.
    1. تحديد تركيز البروتين مع برادفورد مقايسة، وذلك باستخدام BSA وفقا لمعايير. هذا UTS استخراج العازلة متوافق تماما مع واحد البعد SDS-PAGE طالما لست] هي عدم الإفراط في تسخينه لتجنب carbamylation 15.
    2. إضافة 1٪ (ث / ت) من Amberlite واحتضان مع خلط لطيف خلال 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تصفية بعد ذلك إلى 0.22 ميكرون مرشحات حقنة وأخيرا إضافة SDS إلى محلول اليوريا / ثيوريا. هذه الخطوة يقلل من كمية حمض اليوريك وحمض الأيزوسيانيك، والتي هي في equilibrالبوتاسيوم مع اليوريا في حل وتسهيل تدهورها.
  2. كلوروفورم / الميثانول البروتين هطول الأمطار. تترسب بين 100-150 ميكروغرام من البروتين لمدة 11 سم شرائط IPG و1-1.5 ملغ لل18 سم منها (بشكل مستقل على نطاق الأس الهيدروجيني اختيارها لأداء IEF).
    1. تنفيذ كافة الخطوات على الجليد أو على 4 درجات مئوية. الكلوروفورم والميثانول بارد في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل البدء في إجراء هطول الأمطار.
    2. إضافة ثلاثة مجلدات من الميثانول ومجلد واحد من كلوروفورم للحجم واحدة من UTS المحللة. يهز يدويا الخليط وإضافة ثلاثة مجلدات من الماء البارد. الدوامة خلال 1 دقيقة وبيليه البروتينات بواسطة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل طاف باستخدام ماصة باستور وإضافة ثلاثة مجلدات من MeOH الباردة. الدوامة مرة أخرى وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أخيرا تجاهل طاف وتجفيف بيليه تحت رقم 2.
  3. إعداد لتحليل البروتينات 2D.resuspend الكرية المجفف البروتين في 2D العازلة (8 M اليوريا، 2 M ثيوريا تستكمل مع 4٪ CHAPS). غسل الحل مع Amberlite كما هو مبين أعلاه ومحاولة للحفاظ على نسبة 500 ميكروغرام من البروتين لكل 200 ميكرولتر من العازلة لل2D 2D-DIGE. ملاحظة: يمكن تخزين عازلة 2D في -80 درجة مئوية أو الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية خلال أسبوع واحد (لمنع تدهور اليوريا).
    1. يصوتن وتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى تنفيذ الخطوة التالية. الجدير بالذكر أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها بعد ذوبان حمض الفورميك من البروتين المجاميع 10. لفترة وجيزة، تتبخر حمض الفورميك تحت رقم 2 و resuspend بيليه كما هو موضح.

2. 2D-DIGE

  1. عينات اختبار الجودة. عينات الجرعة مرة أخرى باستخدام أسلوب برادفورد. تمييع 15 ميكروغرام من البروتينات في عينة LDS العازلة، والحرارة عند 37 درجة مئوية 15 و 4-12٪ على تحميل المواد الهلامية بولكرلميد.
  2. Coomassie تلطيخ. وصمة عار هلام بولي أكريلاميد مع 0.1٪ (ث / ت) Coomassieالأزرق G-250، 50٪ و 10٪ ETOH (ت / ت) محلول حامض الخليك لمدة 1 ساعة على الأقل. دعونا الخلفية يزيل اللون بين عشية وضحاها في حامض الخليك 7٪ و 10٪ (ت / ت) الحل الايثانول.
  3. وضع العلامات قبل الكهربي من العينات. قبل تنفيذ cyanine وضع العلامات صبغ، تحقق من درجة الحموضة من العينة، التي ينبغي أن تكون أساسية أو حتى محايدة منذ إحلال N-hydroxysuccinimide هو أكثر كفاءة في درجة الحموضة الأساسية، ونظرا لتكون الأمثل في درجة الحموضة 8.6.
    1. تسمية الحد الأدنى للعينتين من الدراسة مع الأصباغ الفلورية CY3 أو Cy5 مع نسبة 50 ميكروغرام protein/400 بمول صبغة والحفاظ لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في الظلام لتسهيل مجموعة NHS رد الفعل استر من cyanines مع أمين unprotonated مجموعات من lysines.
    2. تقليل الاختلافات عينة مما يجعل وضع العلامات الصليب مع CY3 والأصباغ Cy5، لتجنب حدوث اقتران تفضيلية من عينة واحدة لcyanine معينة. لاحظ أن cyanine صبغ الحد الأدنى من وضع العلامات يمكن تكييفها لكمية صغيرة من البروتينات مع الحفاظ على نسبة 1 ميكروغرام العلاقات العامةotein في 8 بمول cyanine صبغ. إذا كان الأمر كذلك، فإن النظام مصغرة 2DE يمكن استخدامها بدلا من نظام هلام 2D كبيرة. وسيمكن هذا التحليل 2D-DIGE لكمية صغيرة من أنسجة المخ.
    3. تسمية مجموعة من العينات على حد سواء مع نفس كمية البروتين (50 ميكروغرام في المجموع) مع صبغة الفلورسنت CY2 واستخدامها وفقا لمعايير داخلية. استخدام نفس الشروط كما هو مبين سابقا.
    4. الكامل إلى الحجم الكلي 350 ميكرولتر مع العازلة 2D تحتوي على 1.1٪ كاشف Destreak، 1.2٪ من العازلة IPG وآثار برموفينول الأزرق مجموع 150 ميكروغرام من البروتينات المسماة (50 ميكروغرام من CY2، 50 ميكروغرام من CY3 و 50 ميكروغرام من CY2). تنفيذ هذه الخطوة في quadruplicate باستخدام أربعة شرائط مستقلة. وعلاوة على ذلك، وإعداد قطعتين إضافية غير المسمى (واحد لكل عينة) مع 350-450 ميكروغرام من البروتين للإعدادي المواد الهلامية.
    5. مغادرة ستة شرائط محملة مغطاة بين عشية وضحاها الزيوت المعدنية لمعالجة الجفاف السلبي.
  4. Isoelectrofocusing. تنفيذ منتدى الطاقة الدولي في 206؛ C. لدرجة الحموضة 3-11NL، 18 سم تجريد البروتوكول هو: الحد الأقصى الإعداد الحالي هو 50 أمبير / الشريط خلال 8 مراحل: 1) 150 V خطوة لمدة 1 ساعة، 2) 200 V خطوة لمدة 5 ساعة، 3) 500 V التدرج ل 2 ساعة، 4) التدرج 1،000 V لمدة 2 ساعة، 5) 2،000 V التدرج لمدة 2 ساعة، 6) 4،000 V التدرج لمدة 2 ساعة، 7) 8،000 V التدرج لمدة 2 ساعة و 8) لما مجموعه 24،000 V · خطوة ساعة . بعد منتدى الطاقة الدولي، وإيفاد الزائدة من الزيوت المعدنية باستخدام ورقة اللوني وتخزين الشرائط في -20 درجة مئوية حتى البعد الثاني.
  5. IPG شرائط موازنة. تتوازن الشرائط في 6 M اليوريا و 2٪ SDS، الجلسرين 30٪، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.6 العازلة مع 1٪ من DTT خلال 15 دقيقة وبعد مع 4.7٪ من iodoacetamide في نفس المخزن المؤقت ولكن من دون DTT.
  6. البعد الثاني أو SDS-PAGE الكهربائي. جعل ستة 12٪ SDS-PAGE المواد الهلامية (1.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.6، 12٪ مادة الأكريلاميد / bisacrylamide، 0.1٪ (ث / ت) SDS، 0.072٪ (ث / ت) APS و 0.1٪ (ت / ت) TEMED ) في نفس الوقت باستخدام نظام 2D كبيرة، مع أربع لوحات الزجاج المنخفضة مضان ليتوملاحظة مع عينات مضان واثنين من لوحات الزجاج الأخرى مع 1.5 ملم من سمك المواد الهلامية للالتحضيرية من أجل استئصال بؤر البروتين.
    1. تحميل ستة شرائط IPG على الجزء العلوي من المواد الهلامية وأكثر الطبقات مع 0.5٪ (ث / ت) من الاغاروز. وتتكون تشغيل العازلة من 25 ملي تريس، جليكاين 192 ملم و 0.1٪ (ث / ت) SDS. تنفيذ الهجرة على W 2.5 / هلام بين عشية وضحاها مع نظام التبريد تعيين إلى 4 درجات مئوية 16،17.
  7. الصور مضان اقتناء والتحليل. استخدام تايفون 9400 الماسح الضوئي للحصول على الصور والمواد الهلامية مضان (12 صورة لتجربة واحدة). مسح CY2، CY3 وCy5 الصور لكل هلام في 488/520 نانومتر، 532/580 نانومتر و 630/670 نانومتر الإثارة / الانبعاثات موجات، على التوالي. استخدام برامج المعلوماتية لتحليل الصور. البيانات هي ممثل للتغيرات في حجم البقعة المرتبطة توزيع إشارة عبر الهلام أربعة من بين اثنين من العينات المدروسة.
  8. Coomassie تلطيخ لالهلام كبيرة. إصلاح المواد الهلامية التحضيرية في 50٪ (ت / ت) ETOH و 3٪ (ت / ت) محلول حمض الفوسفوريك لمدة 24 ساعة على الأقل. ثم بعد، ويغسل مرتين مع الماء النقي جدا لمدة 20 دقيقة. أداء التلون في 34٪ (ت / ت) MeOH، 17٪ (ث ت /) كبريتات الامونيوم وحامض الفوسفوريك 2٪ لمدة 1 ساعة قبل إضافة 0.1٪ (ث / ت) Coomassie الأزرق G-250. الحفاظ على المواد الهلامية في تلوين لمدة 48 ساعة على الأقل وdecolorized في الماء النقي جدا.
    1. بقع لتحديد MS. مرة واحدة ويتم تحليل الصور مضان، يوفر البرنامج قائمة من المواقع التي التعبير يختلف إحصائيا. استئصال يدويا هذه البقع من المواد الهلامية التحضيرية. يتطلب هذا الإجراء الممارسة وبعض البراعة اليدوية من أجل تجنب التلوث الكيراتين. ثم عينات يمكن أن تظل في الماء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى إرسالها إلى MS. تحديد بقعة متوافق تماما مع جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) وأهمية الهويات البروتين يحكم وفقا لدرجة احتمال Mowse أساس حساب مع القيمة p من 0.05 (P <0.05) 18.

    3. النوعية ميني 2DE الفحص

    1. في resuspend الحد الأقصى 100 ميكروغرام من البروتين في عينة العازلة 2D حتى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر ل11 سم الشريط IPG. في حالة النظام من overexpression أو البروتين النقي، يمكن خفض كمية بدءا إلى 20 ميكروغرام.
    2. إضافة 1.1٪ (ت / ت) Destreak الكاشف، 0.55٪ (V / V) العازلة IPG وآثار برموفينول الأزرق إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. ثم، الدوامة، وجعل تدور بسرعة وتحميل إلى الشريط IPG لمعالجة الجفاف السلبي (لجلب الشريط لسمك الأصلي) تغطية ليلة وضحاها مع الزيوت المعدنية. ملاحظة: نسبة عازلة IPG هو نفسه بالنسبة لجميع فاصل من درجة الحموضة المطلوبة (درجة الحموضة 3-11، 4-7، 7-11، الخ)، ولكن تركيبته تختلف في وظيفة من درجة الحموضة مجموعة مختارة.
    3. Isoelectrofocalisation. أداء منتدى الطاقة الدولي في 20 درجة مئوية. مدة البرنامج يعتمد على الفاصل الزمني المحدد الحموضة. الجدير بالذكر، المعلمات مثل التناضح الكهربي قد تعكر صفو الشخصي منتدى الطاقة الدولي وفي هذه الحالات،مطلوب الأمثل في الوقت electrofocalisation 19. ملاحظة: ليس بالضرورة أن يكون منتدى الطاقة الدولي يعد يوفر نتائج أفضل ولكن يمكن اختصار الوقت من منتدى الطاقة الدولي أيضا تحسين القرار. بعد منتدى الطاقة الدولي، وشرائط IPG يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أشهر.
    4. IPG يجرد موازنة. تتوازن الشرائط في العازلة التي تحتوي على 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 20 ملي DTT، الجلسرين 10٪، 5٪ SDS، 0.05٪ برموفينول الأزرق. جعل ثلاثة موازنة الاستحمام لمدة 15 دقيقة مع تغيير حل العازلة بين كل حمام.
    5. SDS-PAGE. طبقة الشريط IPG على هلام مسبقة الصنع (IPG +1 جيدا، و11 سم الشريط IPG) بنسبة بولكرلميد اختار تبعا لميجاوات من البروتين من الفائدة. ثم، وصمة عار الجل على غشاء النيتروسليلوز / PVDF في 100 بالسيارات خلال 33 دقيقة.
    6. احتضان بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة المطلوبة وتصور من حيث نوع النشاط البيروكسيديز. أداء التحالفات من immunoblots باستخدام البروتينية التي كشفت عنها لا علاقة لها الضد الثانوية. التوصل إلى شبه الكميه-اطر النسبية تحليل كثافة من حجم وكثافة للآثار / البقع مع برنامج يماغيج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتينات في أنسجة المخ لا يزال تحديا نظرا لعدم وجود عازلة مثالية لاسترداد 100٪ من البروتينات، وخاصة المرتبطة غشاء أو البروتينات الهيكل الخلوي. وركزت المجموعة الأولى من التجارب على البحث عن تحلل العازلة مناسبة متوافقة مع النهجين والذي تمكن من استعادة لوحة كبيرة من البروتين. وبالتالي، ويعاير ثلاثة مخازن تحلل لتحديد أنسب. أولا، انه كان يستخدم المشتركة الكيمياء الحيوية والجزيئية علم الأحياء عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك 20 في 10 ملم مع 1٪ (ث / ت) (1A الشكل)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

اكتشاف التغيرات المرضية التعبير من البروتينات، والبحث عن المؤشرات الحيوية والتشكيل من المسارات المحتملة للأهداف الدوائية هي من بين أهداف neuroproteomics النهج 30. وسط الأدوات الناشئة، مجال 2DE يضيف expectative واعدة. ومع ذلك، ينبغي التوصل إلى توافق في الآراء من أجل تقليل التباين وزيادة التكاثر في التجارب. في خط هذه الفكرة وهنا وصف بروتوكول موحد لأداء 2D-DIGE (الشكل 2) و2DE immunoblotting اللاحقة (الشكل 3) بالنسبة للفئران الإنسان وأنسجة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح لتعلن.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل INSERM، جامعة ليل 2، MEDIALZ، LabEx (مختبر الامتياز، برنامج استثمار للمستقبل) وDISTALZ (تطوير استراتيجيات مبتكرة لنهج العبرمناهجية لمرض الزهايمر). FJ.FG حاليا زمالة المستفيد من وكالة الاستخبارات الوطنية (وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية / NeuroSplice دي تاو PROJET ANR-2010-1114-بلان 01)، ولكن هذا العمل أيضا في ظل دعم من منحة من JCCM (إسبانيا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 نانومول 1 * 5 NmoGE Healtcare25-8010-65
Immobiline DryStripGE Healtcareالمرجع في وظيفة فاصل الأس الهيدروجيني / حجم
IPG Buffer ، مرجع PH XXGE Healtcareفي وظيفة الفاصل الزمني للأس الهيدروجيني المطلوب
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 &NBSP ؛GE Healtcare551797N
غطاء الشريط الجاف السائل IMMOBILINE 1 * 1 لترGE Healtcare17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KITGE Healtcare28-9334-92صندوق بلاستيكي لعمل الجفاف السلبي   ؛
MILLEX GS فلترMilliporeSLGS033SB
Criterion XT جل مسبقة الصب 13.3 × 8.7 سم (العرض × الطول)مرجع Bio-Radفي وظيفة MW لفصل
وحدة التركيز المتساوي الكهربية IPGphor IIIGE Healtcare11-0033-64
Ettan DALTsix نظام الرحلان الكهربائي الكبيرGE Healtcare80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm ؛شركة جلP2D1.5

المراجع

  1. Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
  2. De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
  3. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).
  4. Riederer, B. M. Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis. J Proteomics. 71, 231-244 (2008).
  5. Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).
  6. Westermeier, R., Scheibe, B. Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging. Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).
  7. Gong, L., et al. Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis. Development. 131, 643-656 (2004).
  8. Gharbi, S., et al. Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system. Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).
  9. Ando, K., et al. Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker. Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).
  10. Bretteville, A., et al. Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes. PLoS One. 4, 4843(2009).
  11. Sergeant, N., et al. Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications. J Neurochem. 69, 834-844 (1997).
  12. Sergeant, N., et al. Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases. FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).
  13. Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis. Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).
  14. Wrobel, K., Caruso, J. A. Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection. Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).
  15. McCarthy, J., et al. Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality. J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).
  16. Chafey, P., et al. Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway. Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).
  17. Kahn, J. E., et al. Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia. J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).
  18. Pottiez, G., et al. A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties. Proteome Sci. 8, 57(2010).
  19. Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration. CSH Protoc. , (2006).
  20. Azimzadeh, O., et al. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
  21. Singh, S., et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis. J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).
  22. Rabilloud, T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).
  23. Molloy, M. P., et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).
  24. Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples. Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).
  25. Shaw, M. M., Riederer, B. M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).
  26. Ye, X., et al. Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS. J Proteomics. 73, 112-122 (2009).
  27. Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction. J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).
  28. Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes. Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).
  29. Schindowski, K., et al. Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits. Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).
  30. Veenstra, T. D., Marcus, K. Multidimensional advancement of neuroproteomics. Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).
  31. Hernandez-Hernandez, O., et al. Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse. 136, 957-970 (2013).
  32. Deramecourt, V., et al. Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies. J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).
  33. Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function. J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).
  34. Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).
  35. Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
  36. Leboucher, A., et al. Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice. Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).
  37. Deramecourt, V., et al. Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S. J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).
  38. Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).
  39. Bell, J. E., et al. Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium. Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).
  40. Crecelius, A., et al. Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE. Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).
  41. Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE). Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).
  42. Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. Two-dimensional difference gel electrophoresis. Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).
  43. Tannu, N. S., Hemby, S. E. Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling. Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

2D DIGE SDS PAGE
بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.