بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

Francisco-Jose Fernandez-Gomez; Fanny Jumeau; Maxime Derisbourg; Sylvie Burnouf; Hélène Tran; Sabiha Eddarkaoui; Hélène Obriot; Virginie Dutoit-Lefevre; Vincent Deramecourt; Valérie Mitchell; Didier Lefranc; Malika Hamdane; David Blum; Luc Buée; Valérie Buée-Scherrer; Nicolas Sergeant

doi:10.3791/51339

Method Article

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

DOI:

10.3791/51339

⸱

April 10th, 2014

Francisco-Jose Fernandez-Gomez¹ , Fanny Jumeau¹^,² , Maxime Derisbourg¹ , Sylvie Burnouf¹ , Hélène Tran¹ , Sabiha Eddarkaoui¹ , Hélène Obriot¹ , Virginie Dutoit-Lefevre³ , Vincent Deramecourt⁴ , Valérie Mitchell² , Didier Lefranc³ , Malika Hamdane¹ , David Blum¹ , Luc Buée¹ , Valérie Buée-Scherrer¹ , Nicolas Sergeant¹

¹Team Alzheimer & Tauopathies, Jean-Pierre Aubert Research Centre, Inserm UMR 837, ²EA 4308-Department of Reproductive Biology-Spermiology-CECOS, CHRU-Lille, ³EA2686-Laboratorie d'Immunologie, Faculté de Médecine - Pôle Recherche, ⁴Department of Neurology, CHRU-Lille

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول استخراج البروتين الشائعة باستخدام العازلة اليوريا / ثيوريا / SDS لأنسجة المخ الفئران والإنسان يسمح يفهم المرء من البروتينات عن طريق 2D-DIGE وتوصيف لاحقا من قبل 2DE صغيرة immunoblotting. هذه الطريقة تمكن واحد للحصول على نتائج أكثر استنساخه وموثوق بها من الخزعات الإنسان ونماذج تجريبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام (2DE) هو أداة قوية للكشف عن تعديلات محتملة بروتيوم المتعلقة مختلفة ظروف فيزيولوجية أو مرضية. أساسا، ويستند هذا الأسلوب على فصل البروتينات وفقا لجهة نظرهم كهرساوي في الخطوة الأولى، وثانيا وفقا لأوزانها الجزيئية بواسطة SDS هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (SDS-PAGE). في هذا التقرير يوصف أمثل نموذج البروتوكول تمهيدا لكمية قليلة من بعد الوفاة والفأر الدماغ الأنسجة البشرية. تمكن هذه الطريقة لأداء كل من ثنائي الأبعاد الفرق مضان الكهربائي للهلام (2D-DIGE) و2DE صغيرة immunoblotting. مزيج من هذين النهجين يسمح احد لتجد ليس فقط البروتينات الجديدة و / أو التعديلات البروتين في التعبير عن شكرهم لتوافقه مع الكشف عن مطياف الكتلة، ولكن أيضا نظرة جديدة في التحقق من صحة علامات. وبالتالي، إلى جانب مصغرة 2DE لتصاريح النشاف الغربية لتحديد والتحقق من صحة آخرمتعدية التعديلات والبروتينات هدم ويوفر المقارنة بين نوعي الظروف و / أو علاجات مختلفة. هنا، ونحن نقدم طريقة لدراسة مكونات المجاميع البروتين الموجود في الجسم ليوي م والخرف مثل الببتيد اميلويد بيتا وألفا synuclein. يمكن بالتالي لدينا وسيلة يمكن تكييفها لتحليل بروتيوم واستخراج البروتينات غير قابلة للذوبان من أنسجة المخ والفئران النماذج البشرية أيضا. في موازاة ذلك، قد تقدم معلومات مفيدة لدراسة المسارات الجزيئية والخلوية تشارك في الأمراض العصبية وكذلك المؤشرات الحيوية المحتملة الرواية والأهداف العلاجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاضطرابات النفسية والعصبية تمثل 13٪ من عبء المرض العالمي، والتحديات الجديدة مثل الآليات المرضية في جسم المريض، وعوامل الخطر والمؤشرات الحيوية البادري يجب استكشافها ^1. تمشيا مع هذا الهدف، البروتيوميات دراسات الدماغ البشري أصبحت لا غنى عنها للكشف عن المسارات الجزيئية المشاركة في العمليات مثل الذاكرة والسلوك والعواطف واللدونة العصبية على سبيل المثال، وليس فقط من أجل الفسيولوجية ولكن أيضا لظروف مرضية. ولذا، فإن استخدام نماذج حيوانية وبشكل أكثر تحديدا في الفئران المعدلة وراثيا، ويجلب طائفة واسعة من الاحتمالات لتقليد مسببات الاضطرابات العصبية البشرية ^2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التجانس واستخراج البروتين من إجمالي الإنسان والفأر أنسجة المخ

الدماغ تجانس الأنسجة. التجانس أنسجة المخ بنسبة 10٪ (ث / ت) في 8 M اليوريا، 2 M ثيوريا و 1٪ ث / ت SDS العازلة (UTS) باستخدام الزجاج الفخاري (للعينات البشرية) أو تفلون الخالط (بالنسبة للفئران عينات). يصوتن في 60 هرتز 30 مع مولد نبضات الموجات فوق الصوتية تطبيق 0.5 ثانية لمجموع تفكك النسيج ^{13، 14.}
1. تحديد تركيز البروتين مع برادفورد مقايسة، وذلك باستخدام BSA وفقا لمعايير. هذا UTS است....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات في أنسجة المخ لا يزال تحديا نظرا لعدم وجود عازلة مثالية لاسترداد 100٪ من البروتينات، وخاصة المرتبطة غشاء أو البروتينات الهيكل الخلوي. وركزت المجموعة الأولى من التجارب على البحث عن تحلل العازلة مناسبة متوافقة مع النهجين والذي تمكن من استعادة لوحة كبيرة من البروتين. وبالتالي، ويعاير ثلاثة مخازن تحلل لتحديد أنسب. أولا، انه كان يستخدم المشتركة الكيمياء الحيوية والجزيئية علم الأحياء عازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك ²⁰ في 10 ملم مع 1٪ (ث / ت) (1A الشكل)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اكتشاف التغيرات المرضية التعبير من البروتينات، والبحث عن المؤشرات الحيوية والتشكيل من المسارات المحتملة للأهداف الدوائية هي من بين أهداف neuroproteomics النهج ^30. وسط الأدوات الناشئة، مجال 2DE يضيف expectative واعدة. ومع ذلك، ينبغي التوصل إلى توافق في الآراء من أجل تقليل التباين وزيادة التكاثر في التجارب. في خط هذه الفكرة وهنا وصف بروتوكول موحد لأداء 2D-DIGE (الشكل 2) و2DE immunoblotting اللاحقة (الشكل 3) بالنسبة للفئران الإنسان وأنسجة .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح لتعلن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل INSERM، جامعة ليل 2، MEDIALZ، LabEx (مختبر الامتياز، برنامج استثمار للمستقبل) وDISTALZ (تطوير استراتيجيات مبتكرة لنهج العبرمناهجية لمرض الزهايمر). FJ.FG حاليا زمالة المستفيد من وكالة الاستخبارات الوطنية (وكالة الأبحاث الوطنية الفرنسية / NeuroSplice دي تاو PROJET ANR-2010-1114-بلان 01)، ولكن هذا العمل أيضا في ظل دعم من منحة من JCCM (إسبانيا).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 نانومول 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		المرجع في وظيفة فاصل الأس الهيدروجيني / حجم
IPG Buffer ، مرجع PH XX	GE Healtcare		في وظيفة الفاصل الزمني للأس الهيدروجيني المطلوب
AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1 &NBSP ؛	GE Healtcare	551797N
غطاء الشريط الجاف السائل IMMOBILINE 1 * 1 لتر	GE Healtcare	17-1335-01
KIT BOX IPG 1 * 1 KIT	GE Healtcare	28-9334-92	صندوق بلاستيكي لعمل الجفاف السلبي ؛
MILLEX GS فلتر	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT جل مسبقة الصب 13.3 × 8.7 سم (العرض × الطول)	مرجع Bio-Rad		في وظيفة MW لفصل
وحدة التركيز المتساوي الكهربية IPGphor III	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix نظام الرحلان الكهربائي الكبير	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm ؛	شركة جل	P2D1.5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
O'Farrell, P. H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

بروتين إجماع الدماغ المستمدة، بروتوكول استخراج لدراسة الإنسان والفئران بروتيوم الدماغ عن طريق كل من 2D-DIGE والبسيطة 2DE Immunoblotting

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles