يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب

20.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51354

⸱

أبريل 30, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

في هذه المقالة

ملخص

في الثقافة المختبر أثبتت أنظمة لا غنى عنها في فهمنا لتكون العضل الفقاريات. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه عن تنمية العضلات والهيكل العظمي nonmammalian والنمو، لا سيما في الأصناف القاعدية. بروتوكول كفاءة وقوية لعزل الخلايا الجذعية البالغة من هذا النسيج، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، والحفاظ على التجديد الذاتي، والانتشار، وتمايز في إطار الثقافة الأولية يسمح لتحديد آليات تنظيمية والحفظ في جميع أنحاء متباينة الأنساب الفقاريات.

الملخص

نظرا لصعوبة الكامنة والوقت الذي يتطلبه مع دراسة برنامج عضلي في الجسم الحي، ونظم الثقافة الأولية المستمدة من الخلايا الجذعية البالغة من سكان العضلات والهيكل العظمي، والخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة)، وقد ثبت لا غنى عنها في فهمنا لتطوير الهيكل العظمي والعضلات في الثدييات و النمو. خاصة بين الأصناف القاعدية من الفقاريات، ولكن، من محدودية البيانات واصفا الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الذات، والانتشار، والتفريق بين البلدان المتوسطية الشريكة. ذات أهمية خاصة هي الآليات المحتملة التي تكمن وراء قدرة الفقاريات القاعدية للخضوع كبيرة postlarval الهيكل العظمي ليف عضلي تضخم (أي الأسماك مكتملة العظام) وتجديد كامل بعد فقدان أطرافهم (أي urodele البرمائيات). بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام myoblasts مثقف مساعدة في فهم التجديد وخلاصة البرنامج عضلي والخلافات بينهما. إلىلهذه الغاية، ونحن تصف بالتفصيل بروتوكول قوية وفعالة (والاختلافات فيه) لعزل والمحافظة على البلدان المتوسطية الشريكة وذريتها، وmyoblasts myotubes غير ناضجة، في خلية ثقافة كمنصة لفهم تطور البرنامج عضلي، بدءا من أكثر الفقاريات القاعدية. الاستفادة من الوضع الكائن نموذج من الزرد (دانيو rerio)، ونحن تقريرا عن تطبيق هذا البروتوكول لأسماك صغيرة من كليد الكارب Danioninae. جنبا إلى جنب، وهذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحقيق المنهج المقارن أوسع من خلال عزل الدول المتوسطية الشريكة من قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum) وحتى القوارض المختبر. والآن تستخدم على نطاق واسع في دراسة هذا البروتوكول تكون العضل في العديد من أنواع الأسماك، بما في ذلك سمك السلمون المرقط قوس قزح، والسلمون، والشبوط 1-4.

المقدمة

لقد تم الحصول على فهم كبير من الثدييات تكون العضل من خلال خلاصة هذه العملية في كل من الماوس الأساسي (المصحف العضلة) myoblast الثقافات وخط الخلية المستمدة من الماوس موصوفة وصفا جيدا، C2C12 5. بدأت في 1950s 6، وقد أدت هذه الثقافات إلى الكثير من التقدم في فهم البرنامج murinemyogenic، وبالتالي، تكون العضل في الفقاريات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زادت خلية واحدة تقنيات ليف عضلي ازدراع من فهم التفاعلات بين الخلايا الأقمار الصناعية وmyofibers المحيطة 7-9. الثقافات الخليوي وجاذبية خاصة للتحقيقات من تكون العضل بسبب الوقت القصير من السلائف لخلايا متمايزة 10، السهولة النسبية لترنسفكأيشن لرني 11-14، 15،16 المعدلة وراثيا و overexpression الدراسات 14،17،18، التوسع في المختبر تليها زرع في الجسم الحي 18-20، وحتى شركاتاريسون الخلايا السلائف عضلي وكلاء ينظم لهم عبر الأصناف 21،22. بينما الاختلافات نظرا للبيئة اصطناعية للنظام الثقافة وقد وصفت 5،23، وقد أثبتت هذه النظم في المختبر ليكون لا غنى عنه لدينا تشريح برنامج معقدة تنظم تشكيل متعددة النوى، mononucleated myofibersfrom متباينة عضال الخلايا الاصلية التكاثري المعروفة باسم myosatellite الخلايا (اللجان الدائمة) بين الثدييات.

خارج من فئة الثدييات، ومع ذلك، فهم الحفظ و / أو اختلاف في آليات السيطرة تكون العضل سيئة، إلى حد كبير بسبب صعوبة في زراعة الخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) وmyoblasts من مختلف الأصناف. في الواقع، لقد فقط وصفت الثقافات myoblast الأولية في ثلاثة طيور 24-26، واحدة من الزواحف 27، عدد قليل من البرمائيات 28-30، وبعض الأسماك 1،3،4،31-33. خطوط الخلايا عضلي مستمر من هاءrtebrates غيرها من القوارض 34-36، بل هي أكثر نادرة، مع الخط فقط غير الثدييات عضلي خلية مشتق من السمان الياباني (Cortunix تفرضه اليابان)، QM7 37. على الرغم من العديد من المحاولات في تخليد، لا يزال خط خلية عضلي مكتملة العظام بعيد المنال، وبروتوكول للترنسفكأيشن كفاءة هذه الخلايا تم نشره فقط هذا العام 15. وبالتالي، فإن هناك حاجة بروتوكولات واضحة جدا وجيدا الأمثل لزراعة البلدان المتوسطية الشريكة الابتدائية وmyoblasts من مجموعة متنوعة من الفقاريات بكثير ليس فقط لتوسيع معرفتنا لتطور البرنامج عضلي، ولكن لتوظيف قوة علم وظائف الأعضاء المقارن لتحقيق اختراقات في علاج أمراض العضلات والهيكل العظمي البشري والاضطرابات.

في حين أن الأدب يحتوي على العديد من التقارير MPC / myoblast العزلة 38-49، فإنه من الشائع للكتاب لوصف بروتوكولات لمثل هذه العزلة في سطور، غالبا ما تكون ناقصة، والأشكال. علاوة على ذلك، معظم بروتوكولات المفيد الريبوrted تم تطويرها للفئران 50-53، وبعض هذه تعتمد على اختيار الأجسام المضادة 54،55 أو 56،57 الجينات المحورة مضان، مما يجعل هذه البروتوكولات غير صالحة للاستعمال أو الأنواع غير القوارض اعمق غير عملي يستخدمها علماء البيولوجيا العضلات. مع المعروفة قليلا عن السمكية، البرمائيات، والزواحف تكون العضل، بروتوكول مفصلة وشاملة، وصفت مع التوجيه السمعي البصري وبكفاءة تظاهروا في الأنواع بعيدة الصلة، ستكون مفيدة للغاية في الميدان.

وصف لأول مرة من قبل باول وزملاؤه في عام 1989 58، وقد وضعت البروتوكول التالية في البداية إلى عزل الدول المتوسطية الشريكة وmyoblasts من أسماك السلمون (وهي تراوت قوس قزح، هينوكس mykiss، وسمك السلمون الأطلسي، سالموسالار) وبعض الكارب أكبر (أي ذهبية، Carassiusauratusauratus) . في عام 2000، وFauconneau Paboeuf الأمثل ثقافة myoblast الأولية لتراوت قوس قزح 59، وminoroptimizations أماهدي هذا البروتوكول للاستعمال في عدة البلم أصغر من كليد Danioninae (الزرد، دانيو rerio، ودانيو العملاق، Devario aequipinnatus) 32 وذلك بسبب العديد من الأدوات الجينية المتاحة للعمل الزرد وبالتالي الأقارب المقربين. الأسماك مكتملة العظام هي كائنات جذابة للدراسة نظرا لاستراتيجيتهم النمو المتباينة (على الأقل في معظم الأنواع). السلمون كبيرة، مثل معظم الأسماك، وتنمو indeterminately، مع إمكانات النمو لا يعوقها على الخط المقارب عند الاستحقاق، حتى في سن الشيخوخة 60-62. خلافا الزرد، danionins كبيرة مثل دانيو العملاق 63 وإمكانات النمو العرض دانيو شاربان نموذجية من الأسماك مكتملة العظام، مما يجعل تجاور بهم مباشرة إلى منصة مثالية لفهم ما إذا كان اختيار مصير الخلية لجنة السياسة النقدية تلعب دورا في تضخم العضلات والهيكل العظمي مقابل تضخم.

وبالمثل، لقد أثبتنا أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الفئران وقنافذ البحر، مع العائد خلية عالية نسبيا وviabمؤشرات ility. السلمندر Urodele، مثل قنفذ البحر المكسيكي (Ambystomamexicanum)، وتمتلك قدرة ملحوظة على تجديد الأنسجة، بما في ذلك الأطراف وذيول 64-66 بأكمله. هذه الخاصية تجعل هذه البرمائيات نماذج مثيرة للاهتمام من تلف العضلات والهيكل العظمي والشيخوخة. باستخدام بروتوكول موضح أدناه، نهجا مماثلا يمكن القيام بها كما حدث في العديد من أنواع الأسماك، وتوفير سياق المقارنة أوسع لمثل هذه الدراسات. كما العديد من علماء الأحياء المقارن حقا نقدر، ويمكن إجراء التقدم الأكثر وضوحا في مجال البيولوجيا الأساسية ومتعدية الطب الحيوي عندما يتم تحليل البيانات ضمن أوسع نطاق (هنا، ونسب الفقاريات بأكمله).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات الفقارية الموصوفة هنا مقدما قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة ألاباما في برمنغهام ويتسق مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها مكتب مختبر رعاية الحيوان والمعاهد الوطنية للصحة في الولايات المتحدة وزارة الصحة والخدمات البشرية.

1. إعداد للثقافة

  1. إعداد قاعدة المتوسطة على النحو التالي: 9 مم 3 NaHCO (1.51 غ لكل 2 لتر)، 20 ملي HEPES (9.53 غ لكل 2 لتر) في DMEM (13.48 جم / لتر؛ 26.96 غ لكل 2 لتر).
    1. تحديد درجة الحموضة والتكيف مع 7.40 مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو.
    2. تحديد وضبط الأسمولية إلى ~ 300 الميلي أسمول مع كلوريد الصوديوم (إذا لزم الأمر).
    3. فلتر تعقيم باستخدام (2) نظم التعقيم 1 L فراغ وتخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة تصل إلى 2-3 أشهر.
      ملاحظة: انظر الجدولين 1 و 2 للكاشف كاملة، والأدوات، والمستهلكونABLES، والمعلومات المعدات.
  2. تحضير-L-المعالجة يسين بولي لوحات عن طريق إذابة 5 ملغ من المشع-γ بولي-L-يسين (> 300،000 ميغاواط) في 50 مل من الماء المعقم عالى النقاء. المزيج بلطف بواسطة انقلاب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وضمان حل كامل للبوليمرات يسين.
  3. ماصة المبلغ اللازم من بولي-L يسين الحل في كل بئر، وفقا لنوع لوحة (الجدول 3). السماح لوحات للوقوف في تدفق الصفحي هود لمدة 5 دقائق.
  4. المقبل، وإزالة بولي-L يسين حل ويغسل مرتين مع الماء المعقم. السماح لوحات في الهواء الجاف في تدفق الصفحي هود لمدة 20 دقيقة.
  5. الحصول على 1 ملغ من laminin (Engelbreth-هولم-سرب المنشأ) وتذوب في 50 مل من قاعدة متوسطة إلى تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل. تطبيق حل laminin لوحات زراعة الخلايا المعالجة بولي-L-يسين في 2 ميكروغرام / سم 2. (انظر الجدول 3 لأحجام وحة مختلفة)
  6. دوامة بلطف الحل لضمان فوليرة لبنانية كذلك التغطية. ختم لوحات مع الشريط المختبر وضعها في الحاضنة لمدة 24 ساعة. يجب تعيين الحاضنة إلى درجة الحرارة المناسبة للأنواع المستخدمة (انظر الجدول 7)، وليس غازات إضافية بحاجة إلى أن تضاف إلى الحاضنة.
    ملاحظة: Laminin يجب أن يسمح للانضمام إلى لوحات للخلايا قبل البذر 24 ساعة. وعدم القيام بذلك يؤدي ذلك إلى ضعف إلى ما لا تمسك الخلية.
  7. إعداد وسائل الاعلام كما هو موضح في الجدول رقم 4. يتم إعداد وسائل الإعلام كاملة أفضل اليوم من الاستخدام.
  8. تمهيدا لعزل الأنسجة، وتجميع العناصر والأوتوكلاف التالية: 300-500 مل دورق (ق)؛ أطباق بتري الزجاج؛ مشرط مقابض؛ ملقط (الناعم والخشن)؛ مقص تشريح؛ وعدة أوراق من المياه طارد رقة الأوتوكلاف.
    ملاحظة: للحصول على كل شخص المساعدة في عملية التشريح، (2) مقابض مشرط، (1) ملقط (نوع اعتمادا على تفضيل شخصي)، (1) مقص تشريح، و (5-10) ورقة من الورق الأوتوكلاف المواد الطاردة للماء هيكافية.
  9. بالإضافة إلى العناصر تعقيمها أعلاه، تجميع الايثانول 70٪، والتوازن الوزن، عقيمة أنابيب مخروطية 50 مل (عدد يعتمد على حجم الثقافة)، والجليد.

2. تشريح الأنسجة

  1. قبل بداية، تأكد من أن مخزون كاف من الأسماك هو متاح.
    ملاحظة: عمر الأسماك لاستخدامها له أهمية حاسمة. بينما الأسماك اثنين من الأنواع المختلفة قد يكون من الأوزان مماثلة، فإن الأسماك الأصغر من نوع واحد من البلدان المتوسطية الشريكة تمتلك أكثر سمكة قديمة من نوع آخر. كقاعدة عامة، والأسماك الأصغر، وخاصة عند العمل مع السلمون، هي الأفضل. لdanionins والأسماك قديمة قدم سنة واحدة يمكن استخدامها على النحو الأمثل، في حين السلمون في سن 4-6 أشهر أو أقل (تصل إلى 15 غرام) هي الأمثل.
  2. لكل 5 غرام من الأنسجة إلى أن تشريح، قسامة 25 مل من العزلة المتوسطة في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي.
  3. وزن والكتلة قياسية، وعدد أنبوب (ق). وضع أنابيب على الجليد.
  4. الموت ببطء 2-3 الأسماكفي وقت عن طريق الغمر في> 300 ملغ / لتر الصوديوم بيكربونات مخزنة تريكين methanesulfonate. تسمح بالحركة وصادي إلى وقف ل> 5 دقائق ثم submerse الأسماك في الايثانول 70٪ (الواردة في الأكواب معقمة) لمدة 30 ثانية.
  5. إزالة الأسماك من 70٪ من الإيثانول ووضع على الورق الأوتوكلاف المواد الطاردة للماء. مباشرة وراء غطاء الخياشيم، واستخدام مشرط لجعل سطحية، شق الضحلة. إزالة القشور والجلد عن طريق استيعاب الجلد في شق السالفة الذكر وسحب نحو ذيل سمكة.
  6. بعد إزالة الجلد، استئصال فوق المحور، سريع، حال السكر العضلات "أبيض" من الأسماك من الجانبين (تجنب العضلات بطيئة الأكسدة "الحمراء" التي تقع بالقرب من الخط الجانبي) ووضعت في العزل المتوسط. تجاهل ما تبقى من الأسماك على النحو المطلوب من قبل المؤسسة.
    الخلايا في حين أنه من الممكن تماما لثقافة البلدان المتوسطية الشريكة القادمة من العضلات الحمراء، كل منشور تقريبا باستخدام مكتملة العظام البلدان المتوسطية الشريكة وقد استخدمت معزولة عن متر فوق المحور: ملاحظةyotome.
  7. كرر الخطوات من 2.4-2.6 حتى يتم الحصول على كمية كافية من العضلات. أثناء تشريح، وضمان أن الأنسجة العضلية المجمعة يبقى على الجليد للحفاظ على بقاء الخلية.

3. التفكك الميكانيكية

  1. صب أنبوب واحد من 25 مل / 5 غرام من الأنسجة العضلية في طبق بتري الزجاج. باستخدام اثنين من يتعامل مع مشرط المرفقة رقم 10 شفرات المشرط، اللحم المفروم الأنسجة إلى الطين أو بوريه الاتساق. A "ذهابا وإيابا" حركة سحب شفرات المشرط الماضية بعضها البعض يعمل على نحو أفضل.
    ملاحظة: على الرغم من التجانس الأنسجة قد يبدو مناسبا، وعدد من خلايا قابلة للحياة وسيتم خفض بشكل كبير، إن لم يكن إلغاؤها.
  2. باستخدام 25 مل ماصة المصلية وpipettor المصلية، وإزالة الأنسجة تلييس جوانبها واستبدال في أنبوب مخروطي الشكل الأصلي.
  3. كرر الخطوات من 3،1-3،2 حتى يتم فصلها عن الأنسجة في جميع أنابيب ميكانيكيا.
  4. الأنسجة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج و 10 درجة مئوية.
  5. الفلبسبب الطرد المركزي، وتجاهل طاف 25 مل من وسائل الإعلام مع 25 مل ماصة المصلية، فراغ الشافطة، أو عن طريق الصب حذرا.
  6. إضافة 25 مل من غسل المتوسطة إلى كل الأنسجة أنبوب، في resuspend، وrecentrifuge على النحو الوارد أعلاه.
  7. يغسل مرتين مع غسل المتوسطة، وإزالة طاف في كل مرة.

4. الأنزيمية التفكك

  1. خلال الخطوة 3.4، وإعداد حل كولاجيناز من خلال الجمع بين 0.22 غرام من النوع الرابع كولاجيناز و 44 مل من المتوسط ​​قاعدة (أو كمية كافية في g/0.22 0.11 مل).
  2. اثارة في كوب لمدة 10-15 دقيقة في 4 درجات مئوية. فلتر تعقيم مع حقنة 50 مل ومرشح حقنة 0.45 ميكرون.
    ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من مرشح واحد حقنة، وهذا يتوقف على إعداد كولاجيناز. كولاجيناز الحصول عليها من الشركات الأخرى من الكيمياء الحيوية ورثينجتون يطرح أكثر صعوبة خلال الترشيح. يستخدم كولاجيناز لفصل السندات الببتيد الكولاجين في التي تشكل غمد الليف العضلي. هذاسوف الهضم إزالة هذا الحاجز واقية من myofibers.
  3. لكل غرام من النسيج العضلي، في resuspend الأنسجة في حل كولاجيناز 0.2٪. لمدة 5 غرام من الأنسجة العضلية، وإضافة 10 مل من محلول كولاجيناز و 15 مل من قاعدة المتوسطة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من قوات الأمن الفلسطينية في مل من كولاجيناز الحل / متوسطة قاعدة (على سبيل المثال 250 ميكرولتر إلى 25 مل). ضمان أن يتم تعليق الأنسجة بشكل جيد، وهذا سوف يؤثر على كفاءة عملية الهضم الأنزيمية.
  5. احتضان الأنسجة العضلية في كولاجيناز لمدة 60 دقيقة عند 18 درجة مئوية مع هزاز لطيف. اعتمادا على درجة من التفكك والأنواع الميكانيكية، ويجوز تمديد كولاجيناز الهضم إلى 90 دقيقة، على الرغم من أن هذا قد يؤثر على بقاء الخلية.
  6. التالية أنابيب كولاجيناز الهضم، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج المخروطية لمدة 5 دقائق في 12 درجة مئوية. تجاهل طاف والأنسجة resuspend في 25 مل من غسل المتوسطة.
  7. Recentrifuge في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 126؛ C. أكرر مع الغسيل المتوسطة للمرة الثانية.
  8. بعد غسل الأنسجة مرتين، الأنسجة العضلية resuspend في 25 مل من غسل المتوسطة ويسحن مع 10 مل ماصة المصلية حتى تمر الأنسجة / متوسطة جناسة داخل وخارج ماصة مع السهولة النسبية. 5-10 triturations وعادة ما يكفي.
    1. أكرر مع 5 مل ماصة المصلية ثم قنية المعادن قياس 16 تعلق على حقنة.
  9. أنابيب الطرد المركزي المخروطية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 12 درجة مئوية. صب طاف.
  10. خلال 5 دقائق أعلاه الطرد المركزي، وإعداد الحل التربسين الهضم من خلال الجمع بين 0.25 غرام من التربسين مع 5 مل من قاعدة المتوسطة.
  11. اثارة في 4 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة وتصفية تعقيم مع حقنة 20 مل و 0.45 ميكرون تصفية حقنة.
  12. استرداد أنابيب مخروطية وإضافة 100 ميكرولتر من محلول التربسين و 4.9 مل من التفكك المتوسطة لكل 1 غرام من الأنسجة العضلية إلى كل أنبوب. لإكساءmple، إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين و 24.5 مل من التفكك المتوسطة إلى 5 غرام من الأنسجة العضلية.
    ملاحظة: التربسين هو الأنزيم البروتيني سيرين التي من شأنها فصل الخلايا السلائف عضلي من الصفيحة القاعدية.
  13. الأنسجة resuspend في التربسين / تفارق المتوسطة أيضا. احتضان لمدة 20 دقيقة في 18 درجة مئوية.
  14. بعد أول حضانة التربسين، أنابيب مخروطية أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  15. تحييد التربسين من خلال الجمع بين supernatants مع العزلة المتوسطة بتركيز 1 حجم طاف إلى 4 مجلدات من العزلة المتوسط. تخزينها في 4 درجات مئوية خلال عملية الهضم التربسين الثانية.
  16. لبيليه المتبقية من الأنسجة، وكرر الخطوات 4،12-4،15، والجمع بين طاف التالية الخطوة 4.15 مع المتوسطة طاف / بمعزل عن أول عملية الهضم التربسين.
  17. بدلا من ذلك: قد تكون مجتمعة والهضم كولاجيناز والتربسين لتعظيم عوائد الخلية. <رأ>
  18. للقيام بذلك، يسحن كولاجيناز هضم باستخدام قنية المعادن (6 في الطول و 16 مقياس يعمل بشكل أفضل) تعلق على حقنة 20 مل حتى جناسة يمر بسهولة من خلال قنية.
  19. إلى جناسة، إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين (المعد في الخطوة 4.10)، واحتضان عند 18 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  20. بعد أنابيب الحضانة، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج المخروطية لمدة 1 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  21. تحييد التربسين من خلال الجمع بين supernatants مع العزلة المتوسطة بتركيز 1 حجم طاف إلى 4 مجلدات من العزلة المتوسط.
  22. تخزينها في 4 درجات مئوية خلال عملية الهضم التربسين الثانية.
  23. المضي قدما في خطوة 4.18 كما هو الحال مع بروتوكول قياسي.
  • الاستغناء النهائي طاف / العزلة المتوسطة الخليط في 50 مل أنابيب مخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 12 درجة مئوية.
  • إزالة supernatants مع الحرص على عدم تعكير صفو الخليةالكريات. ماصة 2 مل من المتوسط ​​كاملة في كل أنبوب، حل كل بيليه الخلية.
  • الجمع بين الخلايا علقت في المتوسط ​​كاملة في واحد 50 مل أنبوب مخروطي.
  • شطف كل أنبوب مع 1 مل من المتوسط ​​كاملة، مع الجمع بين مجموعة من الخلايا معلق سابقا.
  • يسحن مع قنية المعادن والمحاقن 5-10 مرات.
  • تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون، الشطف مع المتوسطة كاملة.
  • تحديد تعليق خلية خلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر.
  • إضافة المتوسطة كاملة كافية ل50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 15 درجة مئوية.

    • 5. الفرز، التخفيف، والبذر من الخلايا

    1. بعد الطرد المركزي في الخطوة النهائية 4.25، وإزالة طاف بواسطة الصب أو حذرا مع ماصة المصلية. resuspend الكرية خلية في 5 مل من المتوسط ​​كاملة.
    2. مع الخلايا معلق تماما، وإزالة 20 ميكرولتر؛ لتعليق الخلية ومكان في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    3. إضافة 5 ميكرولتر من التريبان صبغة زرقاء والانتظار مدة 5 دقائق. باستخدام عدادة الكريات، وتحديد عدد من خلايا قابلة للحياة.
    4. بناء على تقرير، وتمييع الخلايا إلى تركيز الحاجة. مكتملة العظام البلدان المتوسطية الشريكة وأفضل المصنف في 150،000-200،000 الخلايا لكل سم 2. لاستراتيجية الطلاء ستة جيدا، وتمييع الخلايا إلى 1.5 × 10 6-2،0 × 10 6 في مل يدعم الانتشار والتمايز كافية.
    5. استرداد-L-المعالجة يسين بولي، لوحات laminin المغلفة وخلايا البذور. (انظر الجدول رقم (5) لوحة التخفيفات محددة وكميات الطلاء.) ملاحظة: يصور الجدول 6 متوسط ​​عدد خلايا معزولة في كل غرام من الأنسجة العضلية المعزولة من الأنواع مكتملة العظام المختلفة. تراوت قوس قزح (O. mykiss) يحمل أقل البلدان المتوسطية الشريكة في كل غرام من الأنسجة العضلية من القيام الزرد (D. rerio) وبالتالي سوف تتطلب المزيد من السمك لعزل من المناسب للبذار.
    6. ختم لوحات مع الشريط المختبر وضعها في حاضنة تقشعر لها الأبدان في درجة حرارة مناسبة. قد حضنت الدول المتوسطية الشريكة من جميع الأنواع المذكورة هنا (باستثناء الفئران) تحت الظروف الجوية العادية دون ثاني اكسيد الكربون (CO 2) مكملات. (انظر الجدول 7).
    7. بدلا من ذلك: لقد اعتمدت بعض المختبرات البروتوكول الذي يدعو إلى السماح للدول المتوسطية الشريكة على الانضمام إلى الطبقات التحتية الثقافة لمدة 40 دقيقة.
      1. ثم شطف لوحات مع وسائل الاعلام الغسيل لإزالة أي خلايا فضفاضة يعلق وغير ملتصقة. تحذير: هذه الخطوة مهمة جدا لتجنب التصاق "غير محددة" الخلايا الأخرى (مثل الخلايا الليفية) إلى الطبقات التحتية الثقافة.
      2. إضافة وسائط كاملة وخلايا مكان في الحاضنة ورعاية كما هو مفصل أدناه.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    يجب أربع وعشرين ساعة بعد البذر، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) تكون مرئية تعلق على قوام laminin (انظر الأرقام 1a و 1D). بعد البذر، وخلايا (البلدان المتوسطية الشريكة) اعتماد مثل مغزل الشكل، مما يدل على هذا النوع من الخلايا (الشكل 1)، وهي MyoD1 + (الشكل 2). في الأنواع دانيو، تظهر البلدان المتوسطية الشريكة لتكون أكثر إحكاما مع العمليات القطبين أصغر من قيام الدول المتوسطية الشريكة من هينوكس وسلمون ال...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    برنامج عضلي، في أيهما الأنواع التي تم فحصها، يمكن دراسة معظم بسهولة من خلال نظام في المختبر. في الواقع، بناء على العزلة، وخلايا السلائف عضلي (البلدان المتوسطية الشريكة) في الأسماك أو خلايا myosatellite (اللجان الدائمة) في الثدييات تدخل بسهولة هذه العملية تنطوي على درجة عالية من التنظيم والانتشار، دورة الخلية الانسحاب، والتمايز النهائي من myoblasts ودمج تلك myoblasts في myotubes الوليدة. النقص العام في سلالات مراسل الجين المعدل وراثيا من الأنواع السمكية (مع احتمال استثناء ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    ليس هناك شيء في الكشف عنها.

    شكر وتقدير

    فإن الكتاب أود أن أعرب العديد بفضل الدكاترة. جوسيب بلاناس وخوان كاستيو للخبرات المهنية في تطوير وتطبيق هذا البروتوكول إلى ثقافة الأسماك الصغيرة والبرمائيات. الشكر أيضا نظرا لعدد لا يحصى من الأفراد الذين ساعدوا بلا كلل مع تشريح والتفكك من الأنسجة العضلية من العديد من الأسماك (سواء في الأنواع والعدد)، بما في ذلك الشحن ماثيو، Delci كريستنسن، زاكاري فاولر، بروك فرانزين، ناثان FROEHLICH، كيرا مارشال، بن ماير، إيثان Remily، وSinibaldo روميرو. وأيد هذا العمل من قبل جامعة ألاباما في برمنغهام قسم البيولوجيا الأموال البدء، مركز البحوث البروتياز المعاهد الوطنية للصحة منح # 2P20 RR015566، المعاهد الوطنية للصحة NIAMS غرانت # R03AR055350، وNDSU تقدم إلى الأمام جبهة الخلاص الوطني جرانت # HRD-0811239 لPRB. وقدم الدعم أيضا من قبل مركز بحوث السمنة UAB التغذية الجائزة # P30DK056336، المعاهد الوطنية للصحة NIDDK. محتوياته هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين والقيام ليس بالضرورةتمثل وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    الجدول 1. شركة كاشف معلومات الكاشف التفصيلية
    (المفضل مقابل البديل)رقم الكتالوج (المفضل مقابل البديل)الكمية لكل ثقافة
    جاما ؛ بولي إل ليسينسيجما ألدريتش (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 مجم
    DMEM (نسبة عالية من الجلوكوز)سيجما ألدريتش (سيلجرو)MT-50-003-PB (D7777) 2لتر
    لامينينBD Biosciences ( سيجما ألدريتش)CB-40232 (L2020)1 مجم
    بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) فيشرScientific (سيجما ألدريتش)BP328-500 (S5761)1.51 جم
    هيبس (C8H18N2O4S) فيشرساينتفيك (سيجما ألدريتش)BP310-1 (H6147)9.53 جم
    مضاد حيوي / مضاد للفطرياتالحرارية العلمية (سيجما ألدريتش)SV3007901 (A5955)17-20 مل
    كبريتاتجينتاميسينلونزا (سيجما ألدريتش)BW17-519Z (G1397)2-3 مل
    متبرع الخيول مصلحراري علمي (سيجما ألدريتش)SH3007403 (H1270)75 مل
    مصل الأبقار الجنينيةالحرارية العلمية (سيجما ألدريتش)SH3007103 (F2442)25 مل
    كولاجيناز (النوع الرابع)ورثينجتون (سيجما ألدريتش)LS004189 (C9891)0.44 جم
    تربسين (من البنكرياس)MP الطب الحيوي (سيجما ألدريتش)ICN15357125 (T5266)1 ز
    الأدوات الاستهلاكيةالمعدات
    زراعة الخلاياملقط (خشن)ماصة
    معقمة 50 مل أنابيب مخروطيةملقط (ناعم)مقياس
    شريط مختبرمقابض مشرطحاضنة تقشعر لها الأبدان (Echotherm)
    0.2 & مو ؛ م أنظمة التعقيم بالفراغشفرات مشرط (# 10 ، # 11)التدفق
    طارد الماء الأوتوكلاف ورقة الأوتوكلافمقص جراحيفراغ مشعب
    ماصاتمصلية زجاجية أطباق بتريميكروسمولية متر
    12-16 جرام قنيات مع أقفال
    حجم اللوحةسم ^ 2 لكل بئربولي إل ليسين *لامينين **
    6 بئر9.51.6 مل1
    24 بئر1.90.320.2
    48 بئر0.950.160.1
    96 بئر0.320.060.03
    * 0.1 مجم / مل تركيز** 0.020 مجم / مل تركيز
    الجدول 4. وسائط العزل والتفكك والثقافة
    عزلكاشفتفككالغسيل
    المتوسطة419.25 مل395.40 مل297.00 مل
    كبريتات الجنتاميسين **0.75 مل0.60 ملمصل
    الخيول المانحة75.00 مل-
    مصل الأبقار الجنينية ***---
    * PSF: كوكتيل البنسلين / الستربتومايسين / الفطريات (100x) ؛ ** تركيز 50 مجم / مل ؛ مشخص<
    حجم اللوحةسم ^ 2 لكل طلاء تخفيف البئر
    حجم 6 بئر9.51.5-2.0x10 ^ 6 خلايا / مل1 مل
    24 بئر1.91.5-2.0x10 ^ 6 خلايا / مل250 & مو ؛ L
    48 جيدا0.951.5-2.0x10^ 6 خلايا / مل150 مو ؛ L
    96 جيدا0.321.5-2.0x10 ^ 6 خلايا / مل50-100 مو ؛ L
    الجدول 6. متوسط عدد الخلايا لكل غرام من الأنسجة
    الأنواعمتوسط # الخلايا / جم الأنسجة
    دانيو ريريو6،400،000
    دانيو دانجيلا1،783،000
    ديفاريو أكيبيناتوس1،797،000
    Oncorhynchus mykiss66،800
    الجدول 7. درجات حرارة الحضانة الموصى بها
    حرارة
    الأنواع Danio / Devario spp.26 - 28 درجة ؛ سي
    Oncorhynchus / Salmo spp.10 * - 18 درجة ؛ ج
    Ambystoma mexicanum18 درجة ؛ ج
    * تدعم درجات الحرارة المنخفضة معدلات انتشار أقل.
    < td colspan = "4" >الجدول 2. المواد الاستهلاكية والأدوات والمعدات لوحات مصليةالأس الهيدروجيني غطاء الصفحي لور< td colspan = "4" > الجدول 3. أحجام محسنة لطلاء ألواح زراعة الخلايا قاعدة td colspan = "4" >الجدول 5. التخفيفات الموصى بها وأحجام الطلاء درجة

    المراجع

    1. Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
    2. Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J. Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 286 (5), 935-941 (2004).
    3. Bower, N. I., Johnston, I. A. Paralogs of Atlantic salmon myoblast determination factor genes are distinctly regulated in proliferating and differentiating myogenic cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (6), 1615-1626 (2010).
    4. Funkenstein, B., Balas, V., Skopal, T., Radaelli, G., Rowlerson, A. Long-term culture of muscle explants from Sparus aurata. Tissue & Cell. 38 (6), 399-415 (2006).
    5. Cornelison, D. D. Context matters: in vivo and in vitro influences on muscle satellite cell activity. Journal of Cellular Biochemistry. 105 (3), 663-669 (2008).
    6. Harris, M. Quantitative growth studies with chick myoblasts in glass substrate cultures. Growth. 21 (3), 149-166 (1957).
    7. Cornelison, D. D., Wold, B. J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Developmental Biology. 191 (2), 270-283 (1997).
    8. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210 (2), 440-455 (1999).
    9. Yablonka-Reuveni, Z., Seger, R., Rivera, A. J. Fibroblast growth factor promotes recruitment of skeletal muscle satellite cells in young and old rats. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (1), 23-42 (1999).
    10. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 34 (1), 171-180 (1990).
    11. Tripathi, A. K., Ramani, U. V., Patel, A. K., Rank, D. N., Joshi, C. G. Short hairpin RNA-induced myostatin gene silencing in caprine myoblast cells in vitro. Applied Biochemistry and Biotechnology. 169 (2), 688-694 (2013).
    12. Ghahramani Seno,, M, M., et al. Transcriptomic analysis of dystrophin RNAi knockdown reveals a central role for dystrophin in muscle differentiation and contractile apparatus organization. BMC Genomics. 11, 345(2010).
    13. Honda, M., Hosoda, M., Kanzawa, N., Tsuchiya, T., Toyo-oka, T. Specific knockdown of delta-sarcoglycan gene in C2C12 in vitro causes post-translational loss of other sarcoglycans without mechanical stress. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 323-321 (2009).
    14. Rochard, P., et al. Mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors. The Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2733-2744 (2000).
    15. Jackson, M. F., Hoversten, K. E., Powers, J. M., Trobridge, G. D., Rodgers, B. D. Genetic manipulation of myoblasts and a novel primary myosatellite cell culture system: comparing and optimizing approaches. The FEBS Journal. 280 (3), 827-839 (2013).
    16. McGrew, M. J., Rosenthal, N. Transgenic analysis of cardiac and skeletal myogenesis. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (6), 251-256 (1994).
    17. Dong, Y., Pan, J. S., Zhang, L. Myostatin suppression of Akirin1 mediates glucocorticoid-induced satellite cell dysfunction. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
    18. Chen, Y., Melton, D. W., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. MiR-351 transiently increases during muscle regeneration and promotes progenitor cell proliferation and survival upon differentiation. Physiological Genomics. 44 (21), 1042-1051 (2012).
    19. Shadrach, J. L., Wagers, A. J. Stem Cells for skeletal muscle repair. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1575), 2297-2306 (2011).
    20. Wu, X., Wang, S., Chen, B., An, X. Muscle-derived stem cells: isolation, characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. Cell and Tissue Research. 340 (3), 549-567 (2010).
    21. Farini, A., Razini, P., Erratico, S., Torrente, Y., Meregalli, M. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. Journal of Cellular Physiology. 221 (3), 526-534 (2009).
    22. Kim, H. J., Archer, E., Escobedo, N., Tapscott, S. J., Unguez, G. A. Inhibition of mammalian muscle differentiation by regeneration blastema extract of Sternopygus macrurus. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 237 (10), 2830-2843 (2008).
    23. McGann, C. J., Odelberg, S. J., Keating, M. T. Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13699-13704 (2001).
    24. Cosgrove, B. D., Sacco, A., Gilbert, P. M., Blau, H. M. A home away from home: challenges and opportunities in engineering in vitro muscle satellite cell niches. Differentiation; Research in Biological Diversity. 78 (2-3), 2-3 (2009).
    25. Colbert, D. A., Edwards, K., Coleman, J. R. Studies on the organisation of the chicken genome and its expression during myogenesis in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 5 (2-3), 91-96 (1976).
    26. Bowman, L. H., Emerson, C. P. Post-transcriptional regulation of ribosome accumulation during myoblast differentiation. Cell. 10 (4), 587-596 (1977).
    27. Sun, S. S., McFarland, D. C., Ferrin, N. H., Gilkerson, K. K. Comparison of insulin-like growth factor interaction with satellite cells and embryonic myoblasts derived from the turkey. Comparative Biochemistry and Physiology. Comparative Physiology. 102 (2), 235-243 (1992).
    28. Marusich, M. F., Simpson, S. B. Changes in cell surface antigens during in vitro lizard myogenesis. Developmental Biology. 97 (2), 313-328 (1983).
    29. Schrag, J. A., Cameron, J. A. Regeneration of adult newt skeletal muscle tissue in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 77, 255-271 (1983).
    30. Hinkle, L., McCaig, C. D., Robinson, K. R. The direction of growth of differentiating neurones and myoblasts from frog embryos in an applied electric field. The Journal of Physiology. 314, 121-135 (1981).
    31. Yamane, H., Nishikawa, A. Differential muscle regulatory factor gene expression between larval and adult myogenesis in the frog Xenopus laevis: adult myogenic cell-specific myf5 upregulation and its relation to the notochord suppression of adult muscle differentiation. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    32. Alexander, M. S., et al. Isolation and transcriptome analysis of adult zebrafish cells enriched for skeletal muscle progenitors. Muscle & Nerve. 43 (5), 741-750 (2011).
    33. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. , (2013).
    34. Gabillard, J. C., Sabin, N., Paboeuf, G. In vitro characterization of proliferation and differentiation of trout satellite cells. Cell and Tissue Research. 342 (3), 471-477 (2010).
    35. Blau, H. M., Chiu, C. P., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in stable heterocaryons. Cell. 32 (4), 1171-1180 (1983).
    36. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 477-483 (1968).
    37. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
    38. Antin, P. B., Ordahl, C. P. Isolation and characterization of an avian myogenic cell line. Developmental Biology. 143 (1), 111-121 (1991).
    39. Malatesta, M., Giagnacovo, M., Cardani, R., Meola, G., Pellicciari, C. Human myoblasts from skeletal muscle biopsies: in vitro culture preparations for morphological and cytochemical analyses at light and electron microscopy. Methods in Molecular Biology. 976, 67-79 (2013).
    40. Scott, I. C., Tomlinson, W., Walding, A., Isherwood, B., Dougall, I. G. Large-scale isolation of human skeletal muscle satellite cells from post-mortem tissue and development of quantitative assays to evaluate modulators of myogenesis. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. , 10-1007 (2013).
    41. Baquero-Perez, B., Kuchipudi, S. V., Nelli, R. K., Chang, K. C. A simplified but robust method for the isolation of avian and mammalian muscle satellite cells. BMC Cell Biology. 13, (2012).
    42. Lu, A., et al. Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics. Gene Therapy. 15 (15), 1116-1125 (2008).
    43. Rouger, K., et al. Progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesion properties. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 55 (6), 607-618 (2007).
    44. Michal, J., et al. Isolation and characterization of canine satellite cells. In vitro cellular & Developmental Biology Animal. 38, 467-480 (2002).
    45. McFarland, D. C., et al. Isolation and characterization of myogenic satellite cells from the muscular dystrophic hamster. Tissue & Cell. 32 (3), 257-265 (2000).
    46. Burton, N. M., Vierck, J., Krabbenhoft, L., Bryne, K., Dodson, M. V. Methods for animal satellite cell culture under a variety of conditions. Methods in Cell Science: an Official Journal of the Society for In vitro Biology. 22 (1), 51-61 (2000).
    47. Pavlath, G. K. Isolation, purification, and growth of human skeletal muscle cells. Methods in Molecular Medicine. 2, 307-317 (1996).
    48. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).
    49. Doumit, M. E., Merkel, R. A. Conditions for isolation and culture of porcine myogenic satellite cells. Tissue & Cell. 24 (2), 253-262 (1992).
    50. Barjot, C., Jbilo, O., Chatonnet, A., Bacou, F. Expression of acetylcholinesterase gene during in vitro differentiation of rabbit muscle satellite cells. Neuromuscular Disorders: NMD. 3 (5-6), 443-446 (1993).
    51. Pasut, A., Oleynik, P., Rudnicki, M. A. Isolation of muscle stem cells by fluorescence activated cell sorting cytometry. Methods in Molecular Biology. 798, 53-64 (2012).
    52. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
    53. Musaro, A., Barberi, L. Isolation and culture of mouse satellite cells. Methods in Molecular Biology. 633, 101-111 (2010).
    54. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
    55. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. J. Vis. Exp. (49), (2011).
    56. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells and Development. 17 (4), 653-667 (2008).
    57. Bosnakovski, D., et al. Prospective isolation of skeletal muscle stem cells with a Pax7 reporter. Stem Cells. 26 (12), 3194-3204 (2008).
    58. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
    59. Powell, R. L., Dodson, M. V., Cloud, J. G. Cultivation and differentiation of satellite cells from skeletal muscle of the rainbow trout Salmo gairdneri. Journal of Experimental Zoology. 250 (3), 333-338 (1989).
    60. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Effect of fasting and refeeding on in vitro muscle cell proliferation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Cell and Tissue Research. 301 (3), 459-463 (2000).
    61. Rescan, P. Y. Muscle growth patterns and regulation during fish ontogeny. General and Comparative Endocrinology. 142 (1-2), 111-116 (2005).
    62. Johnston, I. A., Bower, N. I., Macqueen, D. J. Growth and the regulation of myotomal muscle mass in teleost fish. The Journal of Experimental Biology. 214, 1617-1628 (2011).
    63. Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 129 (2-3), 207-219 (2001).
    64. Biga, P. R., Goetz, F. W. Zebrafish and giant danio as models for muscle growth: determinate vs. indeterminate growth as determined by morphometric analysis. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291 (5), 1327-1337 (2006).
    65. Roy, S., Gatien, S. Regeneration in axolotls: a model to aim for! Experimental Gerontology. 43 (11), 968-973 (2008).
    66. Echeverri, K., Tanaka, E. M. Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail regeneration. Science. 298 (5600), 1993-1996 (2002).
    67. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
    68. Froehlich, J. M., Galt, N. J., Charging, M. J., Meyer, B. M., Biga, P. R. In vitro indeterminate teleost myogenesis appears to be dependent on Pax3. In vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 49 (5), 371-385 (2013).
    69. Seger, C., et al. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Developmental Dynamics: an Official Publication of the American Association of Anatomists. 240 (11), 2440-2451 (2011).
    70. Gabillard, J. C., Ralliere, C., Sabin, N., Rescan, P. Y. The production of fluorescent transgenic trout to study in vitro myogenic cell differentiation. BMC Biotechnology. 10, (2010).
    71. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry. 23 (13), 3077-3085 (1984).
    72. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin inhibits myosatellite cell proliferation and consequently activates differentiation: evidence for endocrine-regulated transcript processing. The Journal of Endocrinology. 215 (1), 177-187 (2012).
    73. Sanchez-Gurmaches, J., Cruz-Garcia, L., Gutierrez, J., Navarro, I. mRNA expression of fatty acid transporters in rainbow trout: in vivo and in vitro regulation by insulin, fasting and inflammation and infection mediators. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Molecular & Integrative Physiology. 163 (2), 177-188 (2012).
    74. Garikipati, D. K., Rodgers, B. D. Myostatin stimulates myosatellite cell differentiation in a novel model system: evidence for gene subfunctionalization. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1059-1066 (2012).
    75. Vraskou, Y., et al. Direct involvement of tumor necrosis factor-α in the regulation of glucose uptake in rainbow trout muscle cells. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (3), 716-723 (1152).
    76. Cleveland, B. M., Weber, G. M. Effects of insulin-like growth factor-I, insulin, and leucine on protein turnover and ubiquitin ligase expression in rainbow trout primary myocytes. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 298 (2), 341-350 (2010).
    77. Seiliez, I., et al. Amino acids downregulate the expression of several autophagy-related genes in rainbow trout myoblasts. Autophagy. 8 (3), 364-375 (2012).
    78. Chapalamadugu, K. C., et al. Dietary carbohydrate level affects transcription factor expression that regulates skeletal muscle myogenesis in rainbow trout. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 153 (1), 66-72 (2009).
    79. Seiliez, I., et al. Myostatin induces atrophy of trout myotubes through inhibiting the TORC1 signaling and promoting Ubiquitin-Proteasome and Autophagy-Lysosome degradative pathways. General and Comparative Endocrinology. 186, 9-15 (2013).
    80. Codina, M., et al. Metabolic and mitogenic effects of IGF-II in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) myocytes in culture and the role of IGF-II in the PI3K/Akt and MAPK signalling pathways. General and Comparative Endocrinology. 157 (2), 116-124 (2008).
    81. Seiliez, I., Sabin, N., Gabillard, J. C. Myostatin inhibits proliferation but not differentiation of trout myoblasts. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (2), 220-226 (2012).
    82. Averous, J., Gabillard, J. C., Seiliez, I., Dardevet, D. Leucine limitation regulates myf5 and myoD expression and inhibits myoblast differentiation. Experimental Cell Research. 318 (3), 217-227 (2012).
    83. Fauconneau, B., Paboeuf, G. Sensitivity of muscle satellite cells to pollutants: an in vitro and in vivo comparative approach. Aquatic Toxicology. 53 (3-4), 247-263 (2001).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    إعداد الابتدائية عضلي السلائف الخلية / ثقافات Myoblast من بصل الفقارية الأنساب
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.